Terabe等在毛細管電泳電解質(zhì)溶液中加入表面活性劑-上海藥學(xué)會課件

毛細管電泳技術(shù)及其在藥學(xué)研究中的應(yīng)用

上海市食品藥品檢驗所

林梅基本內(nèi)容1.電泳發(fā)展簡史2.電泳的概念與基本原理3.毛細管電泳儀器4.毛細管電泳分離模式5.毛細管電泳特點及應(yīng)用電泳發(fā)展簡史電泳現(xiàn)象在電解質(zhì)溶液中帶電粒子在外加電場作用下向電荷相反的方向遷移。電泳技術(shù)是依據(jù)帶電粒子在電場的作用下遷移行為不同而進行分離的技術(shù)。1809年，俄國物理學(xué)家Pence首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。但是，電泳作為分離技術(shù)是瑞典科學(xué)家Tiselius在1937年首先提出的，他成功地創(chuàng)建了Tiselius電泳儀，用于分離人血清中5種成分，并為此獲得諾貝爾化學(xué)獎。電泳發(fā)展簡史

1981年，Jorgenson和Lukacs用75μm內(nèi)徑、100cm長的石英毛細管，30kV的高壓，分離丹?；被幔―NS-AAS)，用靈敏的熒光檢測，峰形對稱，實現(xiàn)了正負離子的同時分離，理論塔板數(shù)超過每米40萬，轟動了分離科學(xué)界，成為毛細管電泳劃時代的里程碑。

至此，電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)——毛細管電泳。

電泳發(fā)展簡史

1983年，Hjerten將充聚丙烯酰胺凝膠毛細管用于電泳分離，發(fā)展了毛細管凝膠電泳(capillarygelelectrophoresis，CGE)。1984年，Terabe等在毛細管電泳電解質(zhì)溶液中加入表面活性劑，實現(xiàn)了中性分子的分離，這個模式稱為膠束電動色譜(micellarelectrokineticchromatography，MECC)，拓展了毛細管電泳的應(yīng)用范圍。1987年，Hjerten提出了毛細管等電聚焦電泳（CIEF），使CIEF技術(shù)在蛋白質(zhì)分離中成為一個強有力的微分離分析工具，達到能分辨等電點僅相差0.01pH的高分辨率水平。1989年，出現(xiàn)商品化儀器。電泳的概念與基本原理一、雙電層和Zeta電位二、電泳（Electrophoresis）三、電滲（Electroosmosis）四、焦耳熱（Jouleheating）五、遷移時間與有效淌度六、分離效能與分離度電泳的概念與基本原理一、雙電層和Zeta電位

雙電層是指固液兩相之間的分離表面由相對固定和游離的兩部分離子組成的與表面電荷異號的離子層。

“固定”離子有一個切平面，該處電位與溶液內(nèi)部的電位之差稱為Zeta電位。電泳的概念與基本原理雙電層和Zeta電位示意圖電泳的概念與基本原理二、電泳流（ElectrophoresisFlow）

電泳為帶電粒子在電場作用下在緩沖溶液中的定向移動。

Vep=

epE式中，E為電場強度，

ep表示溶質(zhì)的電泳淌度。

電泳的概念與基本原理二、電泳流（ElectrophoresisFlow）

溶質(zhì)的電泳淌度與荷電粒子的電荷密度成正比，即對于給定摩爾質(zhì)量的粒子，表面電荷越大，電泳淌度也就越大；反之，如果電荷給定，則摩爾質(zhì)量越大，電泳淌度越小。荷電粒子在電場作用下，依據(jù)表面電荷密度的差別，進行差速移動而實現(xiàn)電泳分離，這就是在自由溶液區(qū)帶電泳中不同荷電粒子的分離基礎(chǔ)。電泳的概念與基本原理三、電滲流（ElectroosmosisFlow）電滲流是指在電場作用下，毛細管內(nèi)液體沿固體表面移動的現(xiàn)象。電滲的產(chǎn)生與固液界面的雙電層有著密切的關(guān)系

雙電層中處于擴散層中的陽離子在毛細管內(nèi)壁負離子表面形成一個圓筒形的陽離子塞流，而陽離子又是溶劑化的，在外加電場作用下，水化陽離子沿毛細管內(nèi)壁剪切面作相對運動時，攜帶溶劑一齊向陰極遷移，形成電滲流。

一般地，電滲流速度是電泳流速度的5-7倍。對于石英毛細管，電滲流流向陰極。

電泳的概念與基本原理三、電滲流（ElectroosmosisFlow）電泳的概念與基本原理

電滲的特點：

1.電滲流的一個重要特點是具平面流型

2.電滲流使幾乎所有的樣品組分以同一方向移動

電泳的概念與基本原理三、電滲流（ElectroosmosisFlow）

Veo=

eoE

電滲流速度的實驗計算：Veo=l/teo電滲的淌度

eo可用下式表示，即：

電泳的概念與基本原理

值得注意的是，EOF對柱的內(nèi)表面變化非常敏感，EOF的細微變化將嚴重影響CE分離的重現(xiàn)性(遷移時間和峰面積)。所以，EOF的控制是CE中的一項重要任務(wù)。

電泳的概念與基本原理

影響EOF的因素：電場強度緩沖液pH

離子強度或緩沖液濃度溫度有機改變劑表面活性劑共價涂漬電泳的概念與基本原理四、焦耳熱（Jouleheating）

焦耳熱是由于電流通過電泳分離介質(zhì)而產(chǎn)生，其大小取決于操作功率的大小，與毛細管尺寸、緩沖液電導(dǎo)及電場強度有關(guān)。電泳的概念與基本原理四、焦耳熱（Jouleheating）

焦耳熱會引起電泳分離介質(zhì)的溫度梯度黏度梯度速度梯度從而引起區(qū)帶展寬。電泳的概念與基本原理四、焦耳熱（Jouleheating）

控制焦耳熱和溫度梯度的方法：降低電場強度減小毛細管內(nèi)徑降低緩沖液的離子強度或濃度用物理方法直接降溫或恒溫電泳的概念與基本原理五、遷移時間與表觀淌度

遷移時間：樣品組分從進樣口遷移到檢測窗所需要的時間。表觀淌度

ap

：

ap=l/（tmE）=lL/（tmV）

eo=l/（teoE）=lL/（teoV）

ep=

ap-

eo=lL/V（1/tm-1/teo）電泳的概念與基本原理毛細管總長度與有效長度電泳的概念與基本原理遷移時間與有效淌度電泳的概念與基本原理六、分離效能與分離度

分離效能N：

根據(jù)塔板理論

其中，t

為流出曲線最高點所對應(yīng)的時間，稱為遷移時間；W為峰高一半時的寬度即半峰寬。電泳的概念與基本原理六、分離效能與分離度

分離效能N：

根據(jù)速率理論:H=A+B/u+Cu毛細管電泳H=B/u＝2D/un=lu/2D=

apEl/2D=

apVl/2DL

電泳的概念與基本原理六、分離效能與分離度

分離度R：

R=2（tm2-

tm1）/（W1+W2）毛細管電泳儀器毛細管電泳儀器：

進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)毛細管電泳裝置示意圖

毛細管電泳分離模式毛細管區(qū)帶電泳（CapillaryZoneElectrophoresis）膠束電動毛細管色譜（MicellarElectrokineticChromatography）毛細管等電聚焦電泳（CapillaryIsoelectricFocusing）毛細管等速電泳（CapillaryIsotachrophoresis）毛細管凝膠電泳（CapillaryGelElectrophoresis）毛細管無膠篩分（Capillarynon-gelsieving）毛細管電色譜（Capillaryelectricchromatography）毛細管親和電泳（Capillaryaffinityelectrophoresis）毛細管區(qū)帶電泳

毛細管區(qū)帶電泳（CZE）是毛細管電泳中使用最為廣泛的一種技術(shù)。它是通過在充滿電解質(zhì)溶液的毛細管中，不同質(zhì)荷比大小的組分在電場的作用下遷移速度的不同而進行分離的。毛細管區(qū)帶電泳毛細管區(qū)帶電泳操作條件的選擇（一）操作電壓（二）緩沖液種類選擇（三）緩沖液的pH值（四）緩沖液的濃度（五）添加劑的影響（六）毛細管柱溫對電泳分離的影響毛細管電動色譜

毛細管電動色譜主要指的是膠束電動毛細管色譜，它是電泳技術(shù)與色譜技術(shù)的交叉，由日本學(xué)者Terabe于1984年提出，是毛細管電泳技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的操作模式之一。

膠束電動毛細管色譜分離中性分子需要在運行緩沖液體系中添加表面活性劑，其濃度要求在臨界膠束濃度以上，使單個表面活性劑分子之間聚集而形成膠束。膠束電動毛細管色譜的分離機理是基于樣品組分間電泳淌度的不同和分配系數(shù)的差異而實現(xiàn)。SDS膠束示意圖

毛細管電動色譜

MECC的兩相在MECC系統(tǒng)中，存在著兩相：流動的緩沖液相；相當于固定相作用的膠束相。對于SDS膠束來說，固定相朝陽極遷移。電滲流的速度大于膠束的遷移速度，膠束最終向陰極移動，但移動非常慢。因此，MECC中的“固定相”是移動的,又被稱為“準固定相”。溶質(zhì)在這兩相之間分配而分離。毛細管電動色譜

在SDS-MECC中，中性粒子根據(jù)本身疏水性的不同而達到分離。疏水性強的作用力就大，其留在膠束中的時間就長。因膠束的絕對速度很小，故組分的遷移時間就長，反之組分較多地停留在緩沖液這按電滲的速度移動，因此，遷移時間較短。如果使用陽離子表面活性劑，則情況相反。毛細管電色譜

毛細管電色譜（CEC）是指用電場驅(qū)動的微柱液相色譜，它克服了CE分離中性物質(zhì)相對困難的不足，同時也大大地提高了液相色譜的分離效率，形成了自己獨特的高效、微量、快捷的特點。毛細管電色譜

CEC采用熔融的石英毛細管柱，柱內(nèi)一般填充高效液相色譜（HPLC）用的固定相，用高壓直流電源代替高壓泵，即用電滲流代替壓力推動流動相。溶質(zhì)根據(jù)它們在流動相與固定相中的分配系數(shù)的不同和自身電泳淌度的差異得以分離。毛細管電色譜溶質(zhì)在毛細管電色譜中的保留是與它在兩相中的分配有關(guān)，決定了CEC實質(zhì)是一種色譜行為。但當溶質(zhì)為離子狀態(tài)時，其保留機制又類似于毛細管電泳，即根據(jù)其電泳淌度的不同而分離。因此，CEC在選擇性和使用范圍上兼顧了CE和高效液相色譜的特點。毛細管電泳特點及應(yīng)用一、毛細管電泳的技術(shù)特點

多——分離模式多快——分析速度快好——分離效能好省——分析費用省七種青霉素的分離CZE:20mMPi-Borate,pH8.5(B)MEKC:0.1MSDSin(A)soln.CZE分離RP-HPLC收集的多肽組分毛細管電泳特點及應(yīng)用二、毛細管電泳的應(yīng)用特點

生物大分子

有機小分子無機離子

中西藥物

生化樣品

手性分子蛋白質(zhì)混合物的毛細管等電聚焦分離陽離子分離毛細管電泳圖違禁藥物毛細管膠束電動色譜分離毛細管電泳特點及應(yīng)用三、毛細管電泳在藥學(xué)研究中的應(yīng)用熱點復(fù)雜樣品指紋圖譜手性分離分析藥物代謝研究藥品質(zhì)量研究及標準制訂

中藥指紋圖譜研究

CE雖然用于中藥指紋圖譜研究尚處于起步階段，用CE分析中藥具有較大的優(yōu)勢。一是它具有柱效高、快速、進樣體積小等特點；二是抗污染能力強，前處理簡單，甚至于不需前處理（適用于“臟”樣品分析）；三是分析運行成本低；四是水溶性樣品的“指紋”特征性強，如中藥湯劑、注射劑的分析等；五是應(yīng)用面廣。CE除可分析小分子酸、堿、鹽及中性分子外，還可分析生物大分子（核酸、多肽和蛋白質(zhì)等）及手性分子等。因此，CE可以完成中藥指紋圖譜研究的諸多課題。冬蟲夏草的毛細管電泳指紋圖譜

手性分離分析手性對映體分離有巨大的應(yīng)用價值，用CE直接分離手性對映體是發(fā)展方向。目前在機理上已提出手性對映體分離的數(shù)學(xué)模型，可用多種模式進行分離。

常用的手性選擇劑有環(huán)糊精、冠醚、手性選擇性金屬絡(luò)合物、膽酸鹽、手性混合膠束、蛋白和糖等。山莨菪堿合成品的毛細管電泳手性拆分未涂層石英毛細管柱(50μm×45cm)，運行緩沖液75mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH2.5，含25mmol/LCM-γ-CD)，運行電壓20kV，毛細管柱溫25℃，電遷移進樣8kV×6s，檢測波長200nm

藥物代謝研究

生物體液藥物分析及代謝物研究是臨床藥代動力學(xué)的重要內(nèi)容，而代謝物的結(jié)構(gòu)一般與原藥很相似，需要很高的分辨率才能達到分離測定的目的。CE具有分離效能高、所需樣品量少等優(yōu)點，且通過電遷移進樣、清洗毛細管柱等方式使得CE特別適于分析生物體液“臟”樣品，因此CE廣泛應(yīng)用于研究藥物的代謝過程、測定代謝產(chǎn)