實(shí)時(shí)定量r-pcr方法分析小鼠胸腺功能和狀態(tài)

實(shí)時(shí)定量r-pcr方法分析小鼠胸腺功能和狀態(tài)

胸腺是母乳喂養(yǎng)的中間免疫器官。這是t細(xì)胞的區(qū)分、發(fā)育、選擇和成熟的重要場(chǎng)所。它的免疫功能在抗衰老、抗感染、腫瘤和自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用。胸腺功能和狀態(tài)的分析和研究一方面可以直接反映機(jī)體免疫狀態(tài);另一方面,HIV病毒感染、腫瘤化療和造血干細(xì)胞移植等許多疾病導(dǎo)致的免疫缺陷都與胸腺功能障礙有關(guān),因而有關(guān)胸腺功能與狀態(tài)分析及其檢測(cè)方法的研究成了近年研究的熱點(diǎn)。胸腺的功能和狀態(tài)主要由胸腺微環(huán)境執(zhí)行和體現(xiàn)。本研究建立了實(shí)時(shí)定量RT-PCR的分析方法,對(duì)于小鼠胸腺微環(huán)境內(nèi)的相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量,分析胸腺微環(huán)境及其中細(xì)胞的狀態(tài),直接有效地評(píng)價(jià)胸腺功能和狀態(tài)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1pcr擴(kuò)增檢測(cè)Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司),Oligo(dT)15Primer(美國(guó)promega公司),M-MLVReverseTranscripIptase(美國(guó)promega公司),GeneTAQThermalStableDNAPolymerase(英國(guó)基因有限公司),SYBRPremixExTaqTM(日本Takara公司),100bpLadder(日本Takara公司),ABIPrism7300sequencedetector(美國(guó)ABI公司),LKBBiochorm4060紫外分光光度計(jì)(瑞典Pharmacia公司),96孔PCR板(forABI,美國(guó)Axygen公司)。1.1.2小鼠、大鼠、國(guó)家動(dòng)物中心1周5只,體質(zhì)量10g;36周5只,體質(zhì)量30g,均為SPF級(jí)BALB/c小鼠,雌雄兼有,購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):0002959。1.2方法1.2.1鼠胸徑、細(xì)胞培養(yǎng)分別處死1周和36周小鼠,無(wú)菌取小鼠胸腺,200目篩網(wǎng)碾磨,收集細(xì)胞懸液,胸腺細(xì)胞1000r/min離心10min,洗滌2次,計(jì)數(shù)。1.2.2細(xì)胞rna的提取按照TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提106～107細(xì)胞RNA,抽提的RNA用DEPC處理水溶解,0.8%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)檢測(cè)抽提的RNA,-70℃長(zhǎng)期保存。1.2.3但是，分段的rt-pcr擴(kuò)增1pcr擴(kuò)增片段的分析根據(jù)GenBankmRNA序列:BC023196.1、NM008505.3、NM008238.1、NM008371.2分別設(shè)計(jì)引物。GAPDH的上下引物分別為:5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′,5′-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3′,擴(kuò)增的片段大小為200bp;LMO2的上下引物分別為:5′-CTGAGGAACCCGTGGATGAG-3′,5′-CGACACCCACAGAGGTCACA-3′,擴(kuò)增的片段大小為150bp;Foxn1的上下引物分別為:5′-GACCTTGGGACTGACCTGGAT-3′,5′-TGCCTGTTTCTGCCAGACAA-3′,擴(kuò)增的片段大小為204bp;IL-7的上下引物分別為:5′-TCTGCTGCCTGTCACATCATC-3′,5′-GGACATTGAATTCTTCACTGATATTCA-3′,擴(kuò)增的片段大小為250bp。引物由上海博亞公司合成,滅菌的去離子水稀釋引物濃度為10μmol/L。2pcr反應(yīng)條件的確定本研究采用兩步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。其中PCR的反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性3min1次,94℃變性35s,60℃退火1min,35個(gè)循環(huán)。鑒定產(chǎn)物后,摸索PCR反應(yīng)最適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增條件,包括最適合的模板濃度、引物濃度200～500nmol/L、dNTP濃度50～400μmol/L、鎂離子濃度1.5～5mmol/L及退火溫度55～65℃。從而減少非特異性條帶和引物二聚體的產(chǎn)生,減少測(cè)量誤差。1.2.4檢測(cè)pcr擴(kuò)增結(jié)果本實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)在ABIPrism7300sequencedetector中進(jìn)行,使用實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(SYBRPremixExTaqTM)。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)以及上一步普通RT-PCR的優(yōu)化結(jié)果,在96孔PCR反應(yīng)板中配置反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為95℃10s預(yù)變性一次,95℃30s,60℃15s,40個(gè)循環(huán)。在同一批反應(yīng)中,設(shè)置樣品Foxn1片段PCR組,樣品LMO2片段PCR組,樣品IL-7片段PCR組,樣品GAPDH片段PCR組,陰性對(duì)照組,各組都設(shè)2個(gè)平行重復(fù)。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)結(jié)束后,ABIPrism7300SDS1.3軟件保存結(jié)果并分析。根據(jù)PCR獲得的熔解曲線和擴(kuò)增曲線分析結(jié)果的可靠性并設(shè)定閾值,輸出Ct值。采用比較Ct值定量方法進(jìn)行基因表達(dá)的比值計(jì)算。具體的公式為:2-ΔΔCt,其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對(duì)照組。2結(jié)果2.1od20/400比值小鼠胸腺細(xì)胞RNA獲得后,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/280比值在1.7～2.0內(nèi)。電泳結(jié)果也證實(shí)RNA質(zhì)量較好并沒(méi)有基因組DNA和蛋白質(zhì)的污染。2.2反應(yīng)體系的確定cDNA中GAPDH、LMO2、Foxn1、IL-7基因表達(dá)分別擴(kuò)增后,電泳檢測(cè)可觀察到特異性電泳條帶,與預(yù)測(cè)的目的基因片段大小相同,并在進(jìn)行第2次PCR后證實(shí)確為目標(biāo)產(chǎn)物(圖1)。確定的反應(yīng)體系是25μL,上下游引物各200nmol/L,MgCl23.5mmol/L,dNTP250μmol/L,模板cDNA4μL。條件優(yōu)化后結(jié)果顯示,PCR條帶特異性強(qiáng),無(wú)明顯非特異性條帶。2.3基因組化法檢測(cè)產(chǎn)物的敏感性和準(zhǔn)確性實(shí)時(shí)定量RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示,獲得的反映核酸擴(kuò)增過(guò)程的擴(kuò)增曲線為S形動(dòng)力學(xué)曲線,不同基因的熔解曲線均為產(chǎn)物單一峰,證實(shí)了產(chǎn)物的特異性和準(zhǔn)確性(圖2)。確定實(shí)時(shí)定量RT-PCR反應(yīng)體系是25μL,上下游引物各200nmol/L,模板cDNA2μL。2.43表達(dá)變化比值36周小鼠相對(duì)于1周小鼠的胸腺相關(guān)基因表達(dá)變化比值為:LMO22.54±0.08、Foxn10.68±0.02、IL-70.15±0.03。3實(shí)時(shí)定量rt-pcr檢測(cè)細(xì)胞發(fā)育機(jī)體T淋巴細(xì)胞在胸腺內(nèi)發(fā)育、分化、成熟、輸出的過(guò)程以及各種胸腺激素的分泌等功能主要是由胸腺微環(huán)境執(zhí)行和體現(xiàn)的。胸腺微環(huán)境是一個(gè)高度異質(zhì)性的三維網(wǎng)絡(luò),由胸腺上皮細(xì)胞、胸腺細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等共同構(gòu)成。T細(xì)胞在胸腺內(nèi)的發(fā)育是一個(gè)比較復(fù)雜的過(guò)程。在特定階段表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞發(fā)育的過(guò)程,其中:LMO2是一類負(fù)調(diào)節(jié)因子,調(diào)控T細(xì)胞的雙陰性(DN)至雙陽(yáng)性(DP)發(fā)育過(guò)程調(diào)節(jié)蛋白E2A。LMO2在DN1和DN2期特定表達(dá),而在正常的DN到DP發(fā)育過(guò)程中必須是非激活狀態(tài),否則影響細(xì)胞的發(fā)育。Foxn1(whnthenudegene)轉(zhuǎn)錄因子是胸腺上皮細(xì)胞(TEC)所表達(dá)的,并且為胸腺的器官發(fā)生過(guò)程中的TEC的增殖和分化所必須。Foxn1基因的缺失在人和小鼠中都導(dǎo)致了嚴(yán)重的胸腺缺失和免疫缺陷。IL-7(Interleukin-7)是分子量為25kU的糖蛋白。近年來(lái)的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明IL-7不僅是早期B細(xì)胞的生長(zhǎng)因子,也是胸腺早期T細(xì)胞的維持生長(zhǎng)因子。因此,作者選擇以上幾個(gè)胸腺微環(huán)境的相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析,從而有效地評(píng)價(jià)小鼠胸腺的功能和狀態(tài)。另外,GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)是逆轉(zhuǎn)錄PCR中常用的內(nèi)參,它是一類管家基因(housekeepinggene),在真核細(xì)胞的基因組里多拷貝恒定表達(dá)。作為內(nèi)參,它和目標(biāo)基因同批擴(kuò)增,用來(lái)校正樣品之間由于RNA濃度的不同而產(chǎn)生的誤差。本研究通過(guò)利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)對(duì)于1周和36周小鼠的胸腺功能和狀態(tài)進(jìn)行了比較研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),36周小鼠的Foxn1、IL-7基因的表達(dá)下降,而LMO2基因的表達(dá)量上升。胸腺的多種分泌因子(Foxn1、IL-7)表達(dá)活性下降表明,36周小鼠胸腺微環(huán)境中的胸腺上皮細(xì)胞活性和功能下降,胸腺微環(huán)境受到