普洱茶特征成分提取物抗疲勞、降膽固醇及毒理學(xué)效應(yīng)研究

普洱茶特征成分提取物抗疲勞、降膽固醇及毒理學(xué)效應(yīng)研究

普洱茶是云南漢江流域茶樹的起源地。這是在云南茶葉的新鮮過(guò)程中經(jīng)過(guò)加工而成的一種特殊茶。它是由云南的干綠茶通過(guò)緩慢自然、自然、人工和固體發(fā)芽而制成的發(fā)酵茶，包括普洱散茶和普洱散茶。還有獨(dú)特的質(zhì)量特點(diǎn)。茶色蒼白，湯色紅淡，香味獨(dú)特，陳香，葉底褐紅色，口感溫和甘甜?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床驗(yàn)證,普洱茶對(duì)人體有保健作用。如:降脂減肥、抗動(dòng)脈硬化、防癌與抗癌、護(hù)胃、養(yǎng)胃及抗衰老等作用。在普洱茶加工過(guò)程中,大部分的多酚類物質(zhì)、茶黃素及茶紅素氧化、聚合,形成茶褐素(TB),使其含量成倍增加,從而使茶湯的收斂性和苦澀味明顯降低。此外,水溶性多糖大幅度增加,為形成云南普洱茶特有的功能與品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)[3~6]。為了進(jìn)一步證明這些成分所起的作用以及為普洱茶深加工提供重要參考,本文探討了普洱茶特征成分提取物對(duì)昆明種小白鼠的抗疲勞、降膽固醇及其毒理學(xué)效應(yīng)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)(動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(渝)20020004)昆明種小白鼠,由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2加沉淀物中加味茶質(zhì)成分提取物的制備先將普洱茶用熱水浸泡,過(guò)濾后的濾液再用乙醇沉淀,此沉淀物經(jīng)真空干燥后即得普洱茶特征成分提取物,其主要由茶褐素58.3%,可溶性多糖33.3%,可溶性蛋白質(zhì)8.0%及少量的茶紅素、茶黃素、水溶性果膠等組成。1.3功能實(shí)驗(yàn)方法：從普洱茶中提取資源成分1.3.1小鼠尾血及血清尿素氮的測(cè)定采血及飼喂方法:實(shí)驗(yàn)小鼠先按常規(guī)方法飼喂一周,使其適應(yīng)環(huán)境,減少應(yīng)激反應(yīng)帶來(lái)的不便和實(shí)驗(yàn)誤差。普洱茶特征成分提取物組:每天飼喂普洱茶特征成分提取物每只鼠25mg(相當(dāng)于每公斤體重飼喂500~600mg),連續(xù)飼喂10d。普洱茶水浸液組:每天飼喂普洱茶水(將250mg普洱茶浸泡于熱水中,過(guò)濾得浸泡液10ml),連續(xù)飼喂10d。對(duì)照組:每天供給足量的蒸餾水和飼料,連續(xù)飼喂10d。各組小鼠試驗(yàn)過(guò)程中,正常供給飼料。采取飼喂前后小鼠尾血,分離血清后置于Eppendorf管中,4℃冰箱保存,用于游泳前血清尿素氮的測(cè)定。游泳試驗(yàn):小鼠取尾血后,在28±2℃水浴中游泳1h,泳后1~1.5h,再次取尾血分離血清,4℃冰箱保存,用于游泳后血清尿素氮測(cè)定。存活小鼠繼續(xù)喂養(yǎng)。運(yùn)動(dòng)耐力測(cè)定:將小鼠置于28℃±2℃水浴中游泳,直至全部淹死為止,記錄每只小鼠游泳持續(xù)時(shí)間(致死時(shí)間)。血清尿素氮增量測(cè)定:血清中尿素在氨基硫脲存在下,與二乙酰一肟在酸性溶液中混合加熱,經(jīng)Fe3+的催化縮生成3-羥-5,6-二甲基和1,2,4-三嗪紅色化合物,其顏色深淺與尿素含量呈正比。將樣品與試劑混勻后,置于沸水浴中10min,取出用流水冷卻,以520nm波長(zhǎng)或綠色濾光片比色,用空白管調(diào)零,讀取測(cè)定管及標(biāo)準(zhǔn)管的吸光光度值,按下列公式計(jì)算:血清尿素氮(mmol/L)=測(cè)定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×0.375×1000×0.2×0.1泳后泳前差值即為血清尿素氮增量。1.3.2飼料配方的制備采血及飼喂方法:實(shí)驗(yàn)小鼠先按常規(guī)方法飼喂一周,使適應(yīng)環(huán)境,減少應(yīng)激反應(yīng)帶來(lái)的不便和實(shí)驗(yàn)誤差。一周后對(duì)小鼠采取尾血分離血清,4℃冰箱保存,用于測(cè)定飼喂樣品前血清中總膽固醇的含量。次日開始飼喂樣品(飼喂劑量同1.3.1),連續(xù)飼喂10d。試驗(yàn)第11d,再次采尾血分離血清,4℃冰箱保存,用于測(cè)定飼喂樣品后的血清中的總膽固醇的含量。膽固醇測(cè)定方法:血清經(jīng)無(wú)水乙醇處理,蛋白質(zhì)被沉淀,膽固醇及其酯則溶在無(wú)水乙醇中,在乙醇提取液中加磷硫鐵試劑(即濃硫酸和三價(jià)鐵溶液),膽固醇及其酯與試劑形成較穩(wěn)定的紫紅色化合物,呈色程度與膽固醇及其酯含量成正比,可用比色法(560nm)定量測(cè)定。1.4本品系提取的解毒實(shí)驗(yàn)方法1.4.1飼料及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:昆明種小白鼠;性別和數(shù)量:20只,雌雄各半;動(dòng)物年齡:7周齡;動(dòng)物體重:18~22g;實(shí)驗(yàn)環(huán)境和條件:室溫23±2℃,濕度60±20%,自動(dòng)通風(fēng),光照14h。飼料由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,自由攝食和飲用自來(lái)水,飲水每日換一次;禁食時(shí)間:給藥前禁食12~16h。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):依照我國(guó)衛(wèi)生部頒發(fā)的《新藥審批辦法》和《新藥臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》中有關(guān)規(guī)定。單次給藥預(yù)試驗(yàn)結(jié)果如表1。劑量及分組:參考預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)立10.0g/kg體重1個(gè)劑量組,共20只小白鼠,雌雄各半。供試品給予途徑及給藥容量:灌胃,給藥容量為0.5ml/10g體重。單次給藥,藥后立即觀察、記錄動(dòng)物的中毒反應(yīng)、死亡情況及時(shí)間,連續(xù)觀察14d。1.4.2茶樹葉片細(xì)菌活性檢測(cè)試劑:陽(yáng)性對(duì)照組:直接誘變劑絲裂霉素C(mitomycinC,MMC)(0.5μg/皿)、四硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline1-oxide,4-NQO)(0.5μg/皿)和正定霉素(40μg/皿);間接誘變劑2-氨基芴(60μg/皿);均系Sigma化學(xué)試劑公司產(chǎn)品,4℃保存。菌株:選用組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102,由美國(guó)加州大學(xué)Ames.BN教授惠贈(zèng)。菌株保存方式:液氮冷凍保存。菌株增菌培養(yǎng):將細(xì)菌接種在肉湯培養(yǎng)基中,在37℃,空氣振蕩(100~120r/min)條件下連續(xù)培養(yǎng)約10h。菌株遺傳特性:TA97、TA98、TA100和TA102四株測(cè)試菌株除具有組氨酸合成缺失突變外,還具有細(xì)胞壁脂多糖缺失突變和含有抗性R因子,前者可增加受試物滲透進(jìn)入細(xì)胞的能力,而后者使細(xì)菌產(chǎn)生氨基芐青霉素抗性并增加檢測(cè)的敏感性。另外,TA97、TA98和TA100三菌株還具有切除修復(fù)系統(tǒng)缺失突變(紫外線敏感),而TA102則具有四環(huán)素抗性因子。大鼠S9活化系統(tǒng)的制備:大鼠誘導(dǎo)采用苯巴比妥酸和β-奈黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)方法,雄性大鼠體重180~220g,腹腔注射誘導(dǎo)劑,5d后殺鼠制備肝勻漿。肝勻漿的制備:將大鼠斷頭處死,75%乙醇皮毛消毒,開腹取出肝臟稱重,將肝組織剪碎后,用0.15mol/LKCl溶液洗滌4~5次。以每克肝重加3ml0.15mol/LKCl溶液的比例將肝組織放入勻漿器中制成勻漿,9000g離心10分鐘,取其上清夜(S9)分裝塑料管(2ml/管)。液氮或-75℃冰箱冷凍保存。每毫升S9混合液組成如下:0.1mlS9;8μmolMgCl2;33μmolKCl;5μmolG-6-P;4μmolNADP;0.5ml磷酸緩沖溶液(pH7.4)。S9混合液在臨用前配制。誘變性試驗(yàn)方法:誘變性實(shí)驗(yàn)采用平皿摻入試驗(yàn)保溫法。將0.1ml供試品溶液或溶媒、0.1ml增菌液和0.5ml磷酸緩沖溶液(pH7.4,0.2mol/L)或0.5mlS9混合液加入無(wú)菌試管(13×100mm)內(nèi),37℃振蕩培養(yǎng)20min,振蕩頻率約120r/min,然后向試管中加入2ml融化的頂層瓊脂(頂層瓊脂加入前維持45℃水浴中)。振蕩混懸管中成分后,鋪至基礎(chǔ)培養(yǎng)基平皿表面。待頂層瓊脂凝固后,將平皿倒置放入培養(yǎng)箱中,37℃培養(yǎng)約48h。每測(cè)試濃度在活化和非活化條件下各作三個(gè)平皿,重復(fù)試驗(yàn)一次。最終結(jié)果取兩次試驗(yàn)結(jié)果的平均值。分組:普洱茶特征成分提取物設(shè)5000、1000、100、10μg/皿和1μg/皿五個(gè)測(cè)試濃度。設(shè)空白對(duì)照,S9對(duì)照及陽(yáng)性誘變劑對(duì)照。直接誘變劑為0.5μg/皿MMC、0.5μg/皿4-NQQ(TA97、TA100),40μg/皿正定霉素(TA98),間接誘變劑2-氨基芴(60μg/皿)。菌落計(jì)數(shù):顯微鏡下確定細(xì)菌背景菌苔生長(zhǎng)良好,與溶劑對(duì)照相比無(wú)明顯稀疏的條件下進(jìn)行回變菌落計(jì)數(shù),用自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。結(jié)果觀察與判斷:采用沙門氏菌誘變性實(shí)驗(yàn)預(yù)培養(yǎng)試驗(yàn)方法,在加S9活化和非活化兩種條件下進(jìn)行試驗(yàn)。每測(cè)試點(diǎn)做三個(gè)平行樣本,并重復(fù)試驗(yàn)一次。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照、S9對(duì)照及相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照。再確認(rèn)細(xì)菌背景生長(zhǎng)良好的條件下,計(jì)數(shù)回變菌落數(shù)。如供試品引起的回變菌落數(shù)超過(guò)對(duì)照組一倍以上,并有劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí),判斷供試品誘變實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性,否則是陰性。統(tǒng)計(jì)分析:對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。1.4.3普洱茶特征成分提取物、大鼠骨髓細(xì)胞微測(cè)試1.4.4體外誘變劑、藥物作用時(shí)間及染色體畸變?cè)囼?yàn)細(xì)胞:中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞CHL(ChineseHamsterLungFibroblast,CHL),經(jīng)鑒定細(xì)胞核型穩(wěn)定,無(wú)支原體污染。細(xì)胞來(lái)源:衛(wèi)生部藥檢所;保存方式:細(xì)胞貯存液態(tài)氮中。細(xì)胞培養(yǎng)條件:細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI-1640培養(yǎng)基,放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。制備,貯存在-86℃超低溫冰箱中。采用苯巴比妥鈉和β-奈黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)方法劑量:通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及直線回歸法計(jì)算細(xì)胞存活率50%細(xì)胞生長(zhǎng)抑制濃度,IC50=5000μg/ml。據(jù)表2的結(jié)果,本試驗(yàn)選擇5000、2500、1250μg/ml和500μg/ml四個(gè)劑量組。生理鹽水對(duì)照及S9混合液0.5ml分別為陰性對(duì)照;直接誘變劑絲裂霉素C(MMC)0.25μg/ml及間接誘變劑環(huán)磷酰胺(CP)20μg/ml,分別為陽(yáng)性對(duì)照。代謝活化:為彌補(bǔ)傳代培養(yǎng)細(xì)胞沒有代謝活化系統(tǒng),用苯巴比妥鈉和β-奈黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)大鼠肝微粒體酶進(jìn)行體外代謝活化試驗(yàn)。藥物作用時(shí)間:在無(wú)代謝活化條件下,藥物與細(xì)胞作用24h及48h收獲細(xì)胞。有代謝活化條件下,藥物、S9混合液與細(xì)胞作用6h,洗滌、換液,于給藥后24h及48h收獲細(xì)胞。標(biāo)本制作時(shí)間:藥物與細(xì)胞作用24h及48h收獲細(xì)胞,制作標(biāo)本。鏡檢:每一濃度在油鏡下分析100個(gè)中期分裂相。分別記錄染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)畸變。結(jié)果判定:參照《新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則》。2結(jié)果與分析2.1本普洱茶提取物的生理作用2.1.1茶樹活性成分提取物對(duì)小鼠血清尿素氮、運(yùn)動(dòng)公信力的影響抗疲勞作用主要與人或動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)和含氮化合物的分解、形成血清尿素氮的形成速度有關(guān)?？蛊谖镔|(zhì)能有效地減少體內(nèi)蛋白質(zhì)和含氮化合物的分解,降低血清尿素氮的形成,提高肝糖原和肌糖原的貯備能力,從而提高機(jī)體的耐力和速度。用小鼠作動(dòng)物模型,抗疲勞物質(zhì)還能明顯延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)小鼠在水中游泳存活時(shí)間。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定實(shí)驗(yàn)小鼠血清尿素氮增量及實(shí)驗(yàn)小鼠在水中游泳存活時(shí)間、來(lái)確定普洱茶特征成分提取物和普洱茶水浸液的抗疲勞作用能力。圖1表示游泳前后小鼠血清尿素氮含量的變化。從圖1可以看出,普洱茶特征成分提取物組小鼠泳前泳后的血清尿素氮增量最小,普洱茶水提取物居中,對(duì)照組小鼠泳前泳后的血清尿素氮增量最大。小鼠運(yùn)動(dòng)耐力(致死時(shí)間)測(cè)定結(jié)果也表明,普洱茶特征成分提取物組小鼠游泳時(shí)間持續(xù)391.5±68.2min(n=4),顯著高于普洱茶水提取物組小鼠(252±67.3min,n=4)和對(duì)照組小鼠(250.5±68.7min,n=4)?？蛊谠囼?yàn)結(jié)果表明,由茶褐素、茶多糖和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體的抗疲勞效果較普洱茶水提取物的效果顯著,而普洱茶水提取物的抗疲勞效果在本試驗(yàn)中并不顯著。試驗(yàn)結(jié)果還表明,普洱茶抗疲勞作用并非完全由咖啡堿所引起,而茶褐素、茶多糖以及茶蛋白等組成的復(fù)合體同樣具有抗疲勞作用。但具體是何成分起作用,正在研究之中。2.1.2加味加熱對(duì)血清膽固醇含量的影響許多流行病學(xué)研究均證明血清膽固醇水平與冠心病發(fā)病率有聯(lián)系,降脂藥物均有副作用,不利于長(zhǎng)期使用,且中止服藥后血脂迅速上升,因此必須注意飲食治療。本實(shí)驗(yàn)用比色法測(cè)定血清膽固醇含量,計(jì)算實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼喂樣品前后的血清膽固醇含量差值,而判斷普洱茶特征成分提取物和普洱茶水浸液的降膽固醇作用。試驗(yàn)結(jié)果見圖2。從圖2可知,飲用普洱茶特征成分提取物比飲用普洱茶水提取液的降膽固醇效果更好,與對(duì)照(蒸餾水)相比,達(dá)顯著水平。由于茶褐素、茶多糖在普洱茶發(fā)酵過(guò)程中均大幅度增加,這為普洱茶奠定了良好的品質(zhì)基礎(chǔ)。2.2本產(chǎn)品提取物的毒性評(píng)價(jià)由于普洱茶特征成分提取物具有較好的保健作用,為了更好地開發(fā)利用普洱茶特征成分,我們?cè)u(píng)價(jià)了普洱茶特征成分提取物的毒理學(xué)。2.2.1小鼠單次灌胃加熱實(shí)驗(yàn)普洱茶特征成分提取物的小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)表明,小鼠無(wú)明顯抑制性癥狀,如活動(dòng)減少、伏臥不動(dòng)等。個(gè)別小鼠有嚴(yán)重中毒癥狀。按照《新藥臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》之規(guī)定,本實(shí)驗(yàn)連續(xù)觀察14d。小鼠單次灌胃普洱茶特征成分提取物(20.0g/kg)后,死亡均發(fā)生在第一天,20只小鼠中有1只死亡,第二天起小鼠活動(dòng)自如,皮毛光滑,未再出現(xiàn)死亡,存活動(dòng)物體重?zé)o明顯變化。選用1993年7月衛(wèi)生部藥政司頒布的《新藥臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》中推薦的Bliss法,在微機(jī)上運(yùn)行《藥理學(xué)計(jì)算與程序》之P33計(jì)算LD50及其95%可信限:LD50為>10g/kg體重。2.2.2細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)鼠傷寒沙門氏菌誘變性實(shí)驗(yàn)是目前廣泛應(yīng)用的致突變性試驗(yàn)方法,具有快速、靈敏的特點(diǎn),其結(jié)果對(duì)于評(píng)價(jià)供試品的遺傳毒性具有重要價(jià)值。普洱茶提取物在S9活化和非活化兩種測(cè)試條件下,1~5000μg/皿測(cè)試濃度范圍內(nèi),誘發(fā)TA97、TA98、TA100和TA102產(chǎn)生的回變菌落數(shù)與陰性對(duì)照組相比均無(wú)明顯增加。上述結(jié)果表明在1~5000μg/皿測(cè)試濃度范圍內(nèi),普洱茶提取物對(duì)TA97、TA98、TA100和TA102四種測(cè)試菌株均無(wú)致基因突變作用(見表3)。直接誘變劑MMC(0.5μg/皿)、4-NQQ(0.5μg/皿)和正定霉素(40μg/皿)和間接誘變劑2-氨基芴(60μg/皿),在相應(yīng)試驗(yàn)條件下,誘發(fā)四菌株產(chǎn)生的回變菌落數(shù)均超過(guò)陰性對(duì)照組兩倍以上,表明所用實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可靠。2.2.3加樣對(duì)骨髓嗜多染紅細(xì)胞的微核試驗(yàn)檢測(cè)小鼠普洱茶特征成分提取物5.0g/kg灌胃給藥后12、24、36、48h和72h,對(duì)骨髓嗜多染紅細(xì)胞的微核率無(wú)明顯影響(見表4)。根據(jù)上述結(jié)果,選定取材時(shí)間為給藥后24h。普洱茶特征成分提取物5.0、1.0、0.5g/kg和0.1g/kg四個(gè)劑量組給藥后24h,對(duì)骨髓嗜多染紅細(xì)胞的微核率無(wú)明顯影響(見表5)。各組微核率分別為2.67±1.11‰、2.00±1.15‰、3.00±1.00‰和2.17±1.34‰,與溶劑對(duì)照組1.67±0.75‰相比較,P>0.05,無(wú)顯著性差別。而環(huán)磷酰胺(CP)陽(yáng)性對(duì)照組微核率高達(dá)30.0±2.0‰,與溶劑對(duì)照組相比較,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)差異非常顯著(P<0.01),表明本系統(tǒng)可靠。說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)條件下,普洱茶特征成分提取物對(duì)昆明種小鼠無(wú)致骨髓細(xì)胞微核形成作用。2.2.4茶樹幼苗對(duì)chl細(xì)胞染色體畸變率的影響CHL染色體畸變?cè)囼?yàn)?zāi)壳皬V泛應(yīng)用的致突變?cè)囼?yàn)方法,具有快速、靈敏的特點(diǎn),其結(jié)果對(duì)于評(píng)價(jià)樣品的遺傳毒性具有重要價(jià)值。在本試驗(yàn)中,無(wú)論是24h及48h收獲細(xì)胞進(jìn)行染色體畸變分析,空白對(duì)照、溶劑對(duì)照、S9混合液對(duì)照染色體畸變率在正常范圍(見表6),在S9活化和非活化兩種測(cè)試條件下,普洱茶特征成分提取物在500~5000μg/ml濃度范圍內(nèi)染色體畸變率也在正常范圍,因此,在本試驗(yàn)系統(tǒng)條件下,普洱茶特征成分提取物在500~5000μg/ml濃度范圍內(nèi)未見誘發(fā)CHL細(xì)胞染色體畸變率增高。直接誘變劑絲裂霉素C(MMC,0.25μg/ml)染色體畸變率顯著增高。間接誘變劑環(huán)磷酰胺(CP,20μg普洱茶特征成分提取物/ml)無(wú)S9混合液時(shí)染色體畸變率在正常范圍,有S9混合液時(shí)染色體畸變率顯著增高,表明本試驗(yàn)系統(tǒng)可靠。3加標(biāo)對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)小鼠實(shí)驗(yàn)系統(tǒng):昆明種小白鼠;性別和數(shù)量:雄性,每組6只;年齡:40日齡;體重:19~22g;小白鼠每籠5只,室溫25±5℃,濕度80±10%,自動(dòng)通風(fēng),光照14h。自由飲用自來(lái)水,每日換一次。試驗(yàn)設(shè)計(jì):試驗(yàn)設(shè)計(jì)依據(jù)為