紫草素抗腫瘤作用及其機制研究進展

紫草素抗腫瘤作用及其機制研究進展

紫草是紫草科的多年生草本植物，廣泛分布于中國和歐洲其他國家。紫草產于中國東北和內蒙古等地，主要有效成分為紫草素（正如四環(huán)尼南人）。在新疆和其他地方種植的紫草是軟紫草科的主要有效成分（arnin，1）。主要有效成分為卡其色（2），這是反映紫色素的異構體。中醫(yī)中藥認為紫草味苦、性寒,有涼血、活血、解毒和透疹等功能,長期用于瘡瘍、淋濁、熱癥等,為《中華人民共和國藥典》收載的臨床常用中藥。紫草素及其衍生物作為紫草的主要有效成分,已經被證實具有抗炎、促進傷口愈合、抗菌、抗病毒、抗血栓、抗甲狀腺功能亢進、抗免疫功能低下、降血糖、保肝護肝等多種生物活性,特別是其抗腫瘤作用,已被大量研究所證實,引起研究人員的廣泛關注。紫草素類化合物的抗腫瘤機制涉及多個靶點,文獻報道的紫草素類化合物的抗腫瘤作用機制包括誘導細胞凋亡、誘導細胞壞死、抑制拓撲異構酶、抑制蛋白酪氨酸激酶、抗腫瘤血管生成、影響腫瘤細胞信號傳遞等一系列的化學預防和治療途徑。本文將在文獻報道的基礎上,重點闡述紫草素及其衍生物的抗腫瘤作用及其機制。1紫草素的激活作用機制細胞凋亡是指細胞在發(fā)育的一定階段出現(xiàn)的程序性死亡,是多細胞生物的一種基本生命活動,腫瘤細胞能被化學藥物誘導變異和凋亡。許多研究表明,紫草素類化合物可以通過此種機制來抑制腫瘤細胞生長。目前國內外對紫草素誘導凋亡的研究以及凋亡發(fā)生時與之相關的信號轉導途徑的研究非常關注,已經發(fā)現(xiàn)許多基因、蛋白酶和蛋白激酶包括caspase、p53及MAPK家族等在這一過程中起著重要的作用。吳振等發(fā)現(xiàn)人黑色素瘤細胞(A375-S2)對紫草素非常敏感,在較低的濃度和較短的作用時間內具有很強的細胞毒活性。紫草素對A375-S2細胞生長有明顯抑制作用,形態(tài)學上斷定為凋亡,進一步實驗發(fā)現(xiàn)紫草素誘導了caspase激活,進而推測凋亡的可能機制是紫草素首先激活了上游的caspase9,接著觸發(fā)了caspase的級聯(lián)反應,激活了下游的caspase3,導致了細胞凋亡。而深入研究發(fā)現(xiàn),紫草素作用于細胞9h,p53蛋白表達增加,之后略有下降,作用3~24h,Bax蛋白的表達上調,同時下調了Bcl-XL蛋白的表達,12h后可發(fā)現(xiàn)細胞色素c的釋放。這證實了凋亡機制為通過p53激活促凋亡蛋白Bax,Bax導致細胞色素c的釋放和caspase的激活,致使細胞凋亡。另有研究者進一步證實了紫草素通過活化p53降低cdk4的表達來抑制A375-S2細胞生長,滯留細胞周期。紫草素誘導的細胞凋亡由p53介導,通過上調Bax下調Bcl-2釋放細胞色素c,導致caspase8、caspase9及下游的caspase3的活化。1.2紫草素衍生物對k-ras基因突變的調節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs)是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPKs信號轉導通路在細胞增殖、分化、凋亡等過程中具有至關重要的作用。MAPKs信號通路包括細胞外信號激酶(extracelluarsignal-regulatedkinase,ERK)通路、c-jun氨基端激酶(c-junN-terminalkinase,JNK)通路和細胞表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)通路等。ERK通路是最經典的,也是介導細胞增殖和腫瘤形成的一條重要通路,pERK(phosphorylation-ERK)是ERK的活化形式。EGFR是表皮生長因子受體家族成員之一,EGFR信號通路在生理過程中發(fā)揮重要作用。JNK是一種能夠特異性磷酸化c-jun的蛋白激酶,是MAPK家族的主要成員之一。有研究表明,JNK通路的激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。Kim等研究發(fā)現(xiàn)紫草素衍生物明顯抑制pERK活化c-JNK,通過調節(jié)pERK、JNK、PKC-α的活性起到抑制腫瘤生長作用。Singh等發(fā)現(xiàn)紫草素以時間和劑量依賴性的方式抑制人表皮細胞增殖,降低EGFR、ERK1/2及酪氨酸激酶的磷酸化水平,進而影響細胞質的MAPK信號通路,JNK的磷酸化水平增加。同時有研究者發(fā)現(xiàn)紫草素以劑量和時間依賴性方式抑制人骨肉瘤細胞系(143B)生存,誘導ROS的產生,增加ERK蛋白的磷酸化,降低Bcl-2的表達,引起細胞凋亡。總之,紫草素能夠增加胞內與凋亡有關的蛋白的磷酸化水平,降低與增殖有關的蛋白的磷酸化水平,參與調控細胞凋亡。1.3mda-mb-33細胞中內生熱因子檢測缺氧誘導因子-1(HIF-1)是一種組織在缺氧環(huán)境中產生的具有轉錄活性的核蛋白,HIF-1的表達程度與腫瘤的惡性程度、新生血管的表達程度以及預后不良呈正相關。劉昕等體外細胞篩選實驗證實,β-羥基異戊酰紫草素(β-HIVS)對前列腺癌細胞(PC-3)有明顯的選擇性抑制作用。使用熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn),細胞中的核轉錄因子-κB(NF-κB)轉錄活性無明顯變化,而HIF-1轉錄活性受抑制,且呈劑量依賴效應,其下游基因VEGF(HIF-1下游靶基因血管內皮生長因子)表達下調,且細胞中HIF-1α蛋白累積減少,由此推斷其機制可能是β-HIVS減少低氧條件下PC-3中HIF-1α蛋白水平,抑制其轉錄活性,使下游促細胞生長靶基因VEGF表達下調。中國科學院上海藥物研究所丁健等設計合成了一系列側鏈具有芳基磺酰胺結構的新型紫草素衍生物,體外活性實驗顯示,此類紫草素衍生物大多數(shù)對HeLa及HL60的活性優(yōu)于紫草素,進一步實驗證實,其能夠有效降低乳腺癌MDA-MB-231細胞中HIF-1α的表達。針對HIF-1,作者課題組設計并合成了一系列結構新穎的β-HIVS類似物,抗腫瘤活性測試結果顯示,大多數(shù)化合物活性遠優(yōu)于陽性對照5-氟尿嘧啶,與β-HIVS活性接近或更好,其中最為突出的β-HIVS的醚類化合物,不僅對前列腺癌細胞(DU-145)的抗腫瘤作用增大,并且對腫瘤細胞的選擇性也有所提高。1.4trap1對-hivs的誘導凋亡的誘導腫瘤壞死因子相關受體蛋白1(TRAP1)存在于線粒體基質中,是熱休克蛋白90的四大亞型之一。Masuda等發(fā)現(xiàn)β-HIVS抑制TRAP1基因表達。當用β-HIVS處理人白血病細胞(HL60)、人類小細胞肺癌細胞(DMS114),發(fā)現(xiàn)在凋亡過程中線粒體中的TRAP1以時間和劑量依賴的方式減少。用TRAP1特異性的siRNA處理后的DMS114細胞對β-HIVS誘導的凋亡很敏感,并且細胞線粒體中細胞色素c的釋放增加。而β-HIVS對TRAP1的抑制可以被N-乙酰半胱氨酸(抗氧化劑)阻斷,這些結果表明線粒體中TRAP1的表達抑制在紫草素衍生物誘導凋亡中起到重要作用。1.5乙酰紫草素衍生物作者課題組與廈門大學曾錦章課題組合作研究證實乙酰紫草素SK03通過調控Nur77/Bcl-2凋亡通路誘導細胞凋亡,即孤兒受體Nur77出核后定位于線粒體,并與Bcl-2相互作用誘導細胞凋亡。在SK03的基礎上,作者合成了兩個新的乙酰紫草素衍生物—5,8-二乙酰氧基-2-(1-乙酰氧基-4-甲基-3-戊烯基)-1,4-萘醌(SK06)和5,8-二乙酰氧基-6-(1-乙酰氧基-4-甲基-3-戊烯基)-1,4-萘醌(SK07),深入研究發(fā)現(xiàn),SK07對于誘導凋亡有更強的作用(通過提高Nur77的蛋白水平及其在線粒體的定位),但是Nur77蛋白的mRNA表達水平不發(fā)生誘導作用,是轉錄后的調節(jié)。用普霉素A(LMB)和SK07共同處理細胞,可以抑制SK07介導的Nur77的出核轉運及凋亡。由此推測紫草素衍生物參與了Nur77/Bcl-2介導的細胞凋亡。1.6紫草素誘導的細胞凋亡一些生物抗氧化劑在過渡金屬如銅離子存在時可以形成活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)。銅離子自然存在于核染色質中,可以調動金屬螯合劑。在不同組織中銅離子濃度從13μmol·L-1到56μmol·L-1不等,在腫瘤組織中銅離子濃度顯著提高。文獻報道ROS參與了由紫草素誘導的細胞凋亡過程。Cheng等證實在銅離子存在下紫草素誘導ROS介導DNA斷裂,導致人宮頸癌細胞(HeLa)凋亡。Singh等用紫草素處理人白血病細胞(K562),結果發(fā)現(xiàn)細胞凋亡并伴隨著大量ROS的產生,同時伴隨著JNK、p38蛋白的激活,線粒體細胞色素c、Smac/DIABLO的釋放,caspase9、caspase3的激活,PARP的斷裂。而當清除了ROS后以上所有過程(JNK、p38磷酸化,細胞色素c、Smac/DIABLO釋放,PARP裂解以及誘導的細胞凋亡)均消失。1.7紫草素處理劑對nf-b和nf-b的信號表達Ruan等對紫草素誘導人舌鱗癌細胞(Tca-8113)凋亡的NF-κB信號轉導途徑進行了研究,發(fā)現(xiàn)紫草素處理后磷酸酶-lKAPPAba蛋白的表達、核內NF-κB與DNA的結合活性明顯下降,同時Bcl-2的表達也明顯降低。進而證明紫草素在Tca-8113細胞的抗腫瘤作用是通過抑制NF-κB途徑,進而激活caspase蛋白家族起作用。2紫草素的藥代動力學細胞壞死不同于細胞凋亡,是以細胞形態(tài)學壞死和自我吞噬的激活為特征。其形態(tài)學特征為胞質細胞器水皰形成、內質網膨脹、細胞骨架降解、質膜破裂、線粒體嚴重被破壞、基質密度增加、突起膨脹、被粗內質網纏繞,而細胞核很少受到影響。胡汛等研究發(fā)現(xiàn)紫草素可以以非細胞凋亡的方式誘導人乳腺癌細胞(MCF-7)和人胚腎293細胞(HEK293)死亡,其誘導的細胞死亡不同于凋亡,以質膜完整性被破壞為特征,在形態(tài)學上是細胞壞死(necroptosis),并且也發(fā)現(xiàn)紫草素對藥物敏感細胞MCF-7和HEK293有類似的作用。同時證實紫草素誘導的細胞死亡不受P-糖蛋白介導的抗藥性影響,既繞開了腫瘤的凋亡耐受,又避開了P-gp等藥泵造成的多藥耐藥性,對耐藥性腫瘤細胞有效。3紫草素的降解作用基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)是一種與腫瘤侵襲和轉移密切相關的蛋白酶,與血管形成過程中基質膜的降解密切相關,也是促進血管形成的重要因子之一。Min等對紫草素是否抑制腫瘤細胞浸潤進行了研究,發(fā)現(xiàn)紫草素在2.5~10μmol·L-1下作用24h不會對人高轉移性腺囊癌細胞(ACC-M)產生毒性,但能使ACC-M細胞浸潤降低,并且這種作用有濃度依賴性。進一步的研究證實紫草素主要降低了ACC-M細胞中MMP-9的活性,而MMP-9在腫瘤細胞轉移中有重要作用,初步推測MMP-9是紫草素作用的靶點之一。4ptsk與腫瘤的關系蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase,PTKs)是一種選擇性使不同底物的酪氨酸殘基磷酸化的酶。眾多研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸磷酸化在細胞調節(jié)的許多過程中起重要作用,比如細胞增殖、分化、代謝、信號傳遞基因表達等過程。PTKs與腫瘤形成、生長過程有密切關系,已成為抗腫瘤研究的重要新靶點。Takai等在研究中發(fā)現(xiàn)β-HIVS是蛋白酪氨酸激酶的ATP非競爭性抑制劑,與正常細胞相比,可以對癌細胞有更高的敏感性抑制,β-HIVS處理后的細胞更多的停留在G0/G1相。同時,Masuda等發(fā)現(xiàn)紫草素及β-HIVS可以非競爭性地抑制EGFR、PTKs的活性,特別是β-HIVS,對PTKs表現(xiàn)出極好的活性(IC50為2.5μmol·L-1),進而深入研究了β-HIVS的抗腫瘤機制,發(fā)現(xiàn)該紫草素衍生物通過抑制PTKs的活性,進而抑制polo-like激酶(PLK1)的活性,最終導致腫瘤細胞凋亡。5vegf抑制劑許多血管生長因子參與血管再生過程,比如血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、轉移生長因子(transformationgrowthfactor,TGF)。針對抗腫瘤血管再生的抗腫瘤藥物研究已成為研究重點。Lee等研究證實紫草素在5μmol·L-1濃度下對VEGF誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)增殖抑制率達40%,乙酰紫草素在10、20μmol·L-1也有明顯的抑制作用。紫草素、乙酰紫草素和β-羥基異戊酰紫草素分別在5、10、10μmol·L-1對VEGF誘導的內皮細胞的遷移有非常明顯的抑制,抑制率分別為75%、50%和60%,同時抑制了新血管的生成。體內實驗中發(fā)現(xiàn)紫草素、異丁酰紫草素和β-羥基異戊酰紫草素明顯抑制了腫瘤組織的生長,同時也發(fā)現(xiàn)這3個化合物明顯抑制了VEGF介導的腫瘤血管的再生、轉移及新血管的形成。6紫草素衍生物的活性拓撲異構酶(TOP)通過斷裂連接DNA鏈決定DNA的拓撲異構狀態(tài)。拓撲異構酶已被作為化學預防研究中的重要靶點,因為拓撲異構酶參與很多重要的過程,比如DNA復制轉錄重組。一系列紫草素酯類衍生物已被用以研究它們對TOP-Ⅰ的抑制作用。在體外實驗中已經證實紫草素及其衍生物可以與DNA拓撲異構酶相互作用。另有研究者報道紫草素通過形成一個可斷裂的復合物可以誘導TOP-Ⅱ介導的DNA斷裂。端粒酶是由核酸蛋白質構成的DNA聚合酶,具有延長端粒的作用,以彌補細胞分裂時染色體末端的縮短,解決末端復制問題。端粒酶的激活、端粒長度的調節(jié)與腫瘤的發(fā)生密切相關。目前端粒酶已被作為最為廣譜的腫瘤標志物之一,抑制端粒酶的活性已經成為一種治療腫瘤的特異靶點。盡管眾多研究結果表明紫草素及其衍生物具有極好的抗腫瘤作用。但到目前為止,還沒有一個紫草素或其萘醌類似物成為臨床應用的抗腫瘤藥物。存在的主要問題是該類化合物的廣泛細胞毒性,缺乏抗腫瘤作用的特異選擇性。紫草素的可修飾結構位點并不多,主要包括母核萘茜、含有6個碳原子的側鏈及側鏈上羥基。雖然過去的十多年,已有數(shù)十個國內外課題組展開了紫草素及其衍生物的合成,但進展緩慢,主要側重于對其側鏈長度及側鏈羥基的改造。眾多結果顯示,紫草素保持側鏈6個碳原子結構,側鏈羥基成酯活性較好(如β-HIVS、β,β-二甲基丙烯酰紫草素),但不能改變其廣泛的細胞毒性、缺乏選擇性等缺點。作者課題組近年來對紫草素衍生物的合成及抗腫瘤活性進行了較深入研究,旨在降低紫草素的非特異性細胞毒性,提高其作用選擇性和靶向性。作者在保持側鏈基本結構的同時,在側鏈羥基引入各種不同的取代基,并在此基礎上,成功實現(xiàn)對紫草素萘茜母核氧烷基化,共合成了300多個紫