第六章 原核細胞基因工程

第六章原核細胞基因工程第六章原核細胞基因工程在基因工程中，目的基因的異源表達主要包括三個要素目的蛋白的DNA編碼序列、表達載體、表達宿主(受體細胞或受體菌)。目的基因表達要素目的基因載體宿主需要表達的DNA序列運送外源基因進入受體細胞表達目的基因的細胞（原核或真核）在基因工程中，目的基因的異源表達主要包括三個要素目的蛋白的DNA編碼序列、表達載體、表達宿主(受體細胞或受體菌)。其中，利用原核細胞作為表達宿主進行目的基因重組表達被稱為原核表達，相應的基因工程技術被稱為原核細胞基因工程。①原核生物大多數(shù)為單細胞異養(yǎng)生物，具有生長快、代謝易于控制的特點，可通過發(fā)酵迅速獲得大量的基因表達產(chǎn)物。②原核生物只有一種RNA聚合酶(真核細胞有三種)，識別原核基因的啟動子，催化所有RNA的合成。③因為原核生物無核膜，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，二者也是連續(xù)進行的；而且在翻譯過程中，mRNA可與多個核糖體結合形成多核糖體(polyribosome)，即在一條mRNA鏈上可以有多個核糖體同時進行合成反應，大大提高了翻譯效率。與真核表達系統(tǒng)相比，原核表達系統(tǒng)具有以下優(yōu)點。本章內(nèi)容第一節(jié)原核表達系統(tǒng)的種類第二節(jié)原核表達策略第三節(jié)基因工程菌的大規(guī)模培養(yǎng)第四節(jié)原核表達產(chǎn)物的分離純化第五節(jié)基因工程菌不穩(wěn)定性及對策第六節(jié)原核表達應用舉例第一節(jié)

原核表達系統(tǒng)的種類一個完整的表達系統(tǒng)主要包括表達載體和受體菌株。其中，表達載體是將目的基因?qū)胨拗骷毎?，并在宿主中實現(xiàn)目的基因表達的運輸工具。原核細胞表達載體的主體部分主要來自于相應宿主菌株的內(nèi)源質(zhì)粒，以此為基礎添加與克隆表達相關的元件，即構成完整表達載體。原核表達載體除具有克隆載體所具有的復制起始位點、抗性選擇標記等以外，還帶有原核細胞所需要的表達元件，例如啟動子、多克隆位點、終止子和SD序列，有時還包括融合標簽的DNA編碼序列等。優(yōu)點：它的遺傳背景清晰，基因工程操作手段完善；代謝途徑和基因表達調(diào)控機制比較清楚；已有大量可供選用的大腸桿菌表達載體；它的培養(yǎng)成本低廉，生長繁殖迅速，

抗污染能力強，適合于大規(guī)模培養(yǎng)；外源基因產(chǎn)物的表達量高，目的蛋白可以占細菌總蛋白的30%以上，因此是目前應用最為廣泛的原核表達系統(tǒng)。一.大腸桿菌表達系統(tǒng)缺點：目的蛋白常形成包涵體，導致后期純化過程繁瑣，應用成本高；由于原核表達系統(tǒng)的翻譯后加工修飾體系不完善，所以在表達某些真核基因時，會導致表達產(chǎn)物無法正確折疊或進行糖基化、磷酸化修飾，致使產(chǎn)物的生物活性相對較低。大腸桿菌內(nèi)源性蛋白酶易降解空間構象不正確的異源蛋白，造成表達產(chǎn)物不穩(wěn)定；大腸桿菌細胞膜間隙中含有大量的內(nèi)毒素，痕量的內(nèi)毒素即可導致人體熱原反應。一.大腸桿菌表達系統(tǒng)常用的外源基因表達的載體有：pET系統(tǒng)、pBV等。一.大腸桿菌表達系統(tǒng)受體菌株有：BL21（DE3）、JM109等。1.BL21(DE3)該菌株用于高效表達克隆于含有噬菌體T7啟動子的表達載體（如pET系列）的基因。T7噬菌體RNA聚合酶位于λ噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)整合于BL21的染色體上。該菌適合表達非毒性蛋白。2.BL21(DE3)pLysS該菌株含有質(zhì)粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。pLysS含有表達T7溶菌酶的基因，能夠降低目的基因的背景表達水平，但不干擾目的蛋白的表達。該菌適合表達毒性蛋白和非毒性蛋白。一.大腸桿菌表達系統(tǒng)受體菌株有：BL21（DE3）、JM109等。3.Rosetta(DE3)pLysS

Rosetta菌株是經(jīng)過修飾，專用于帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白表達的菌株。一.大腸桿菌表達系統(tǒng)一.大腸桿菌表達系統(tǒng)受體菌株有：BL21（DE3）、JM109等。3.Rosetta(DE3)pLysS

Rosetta菌株是經(jīng)過修飾，專用于帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白表達的菌株。4.JM109

該菌株在使用pUC系列質(zhì)粒載體進行DNA轉(zhuǎn)化或用M13phage載體進行轉(zhuǎn)染時，由于載體DNA產(chǎn)生的LacZa多肽和JM09編碼的LacZΔM15進行α－互補，從而顯示β－半乳糖苷酶活性。芽孢桿菌為革蘭陽性細菌，細胞壁不含內(nèi)毒素，能分泌大量蛋白質(zhì)到體外，為一些重要工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌種，能形成芽孢，而子囊中只有一個芽孢。除個別種如炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)外，其他芽孢桿菌對人畜無毒。二.芽孢桿菌表達系統(tǒng)優(yōu)點：①芽孢桿菌是非致病微生物，比較安全；②培養(yǎng)條件簡單，易于控制；③生長迅速，周期短；④表達產(chǎn)物能分泌到細胞外的培養(yǎng)基中；⑤多數(shù)表達產(chǎn)物具有天然構象和生物學活性；⑥某些芽孢桿菌的遺傳背景比較清楚，且利用芽孢桿菌進行發(fā)酵的技術相當成熟。二.芽孢桿菌表達系統(tǒng)缺點：野生型芽孢桿菌能分泌大量的胞外蛋白酶，影響外源基因表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性。

因此，在構建芽孢桿菌表達系統(tǒng)宿主菌時需要將蛋白酶基因進行突變或敲除，使其降低活性甚至失活。遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備。二.芽孢桿菌表達系統(tǒng)二.芽孢桿菌表達系統(tǒng)應用：適用于原核生物基因的克隆、表達以及重組蛋白多肽的有效分泌。目前應用較多的芽孢桿菌宿主菌有枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜堿芽孢杄菌、淀粉芽孢杄菌、巨大芽孢桿菌、球形芽孢杄菌、短芽孢杄菌、嗜熱脂肪芽孢杄菌、耐堿的芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌等。

其中，枯草芽孢桿菌(又稱枯草桿菌，Bacillussubtilis)表達系統(tǒng)是目前應用最為廣泛的，枯草芽孢桿菌是一種重要的工業(yè)微生物，人們對其遺傳背景和生理學特性的了解僅次于大腸桿菌。鏈霉菌是一類革蘭陽性細菌，廣泛分布于土壤中，能產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)。三.鏈霉菌表達系統(tǒng)優(yōu)點：①鏈霉菌為非致病菌，使用比較安全；②不產(chǎn)生內(nèi)毒素；③表達產(chǎn)物可分泌到細胞外；④可進行高密度培養(yǎng)；⑤具有豐富的次生代謝途徑和初級、次生代謝調(diào)控系統(tǒng)；⑥鏈霉菌進行工業(yè)規(guī)模化發(fā)酵的技術成熟。缺點：遺傳不穩(wěn)定，生長相對緩慢。三.鏈霉菌表達系統(tǒng)應用：鏈霉菌受體系統(tǒng)中常用的宿主菌有變鉛青鏈霉菌和天藍色鏈霉菌。天藍色鏈霉菌有很強的修飾系統(tǒng)，因此在實際應用中均以變鉛青鏈霉菌作為外源基因表達的表達系統(tǒng)。變鉛青鏈霉菌表達系統(tǒng)：大腸桿菌的卡那霉素抗性基因(Kan)、牛生長激素基因、人白細胞介素2基因、人乙肝表面抗原(HBsAg)基因、人類干擾素(IFN-a2、IFN-a1)基因、人類腫瘤壞死因子(TNF)基因等。三.鏈霉菌表達系統(tǒng)三.鏈霉菌表達系統(tǒng)1952年，美國微生物學家賽爾曼·A·瓦克斯曼（SelmanA.Waksman）因“發(fā)現(xiàn)鏈霉素——第一個有效對抗結核病的抗生素”獲得了當年的諾貝爾生理醫(yī)學獎。藍藻又稱藍細菌，是一類能夠進行植物型放氧光合作用的原核生物，有大約150個屬，2000余種。藍藻具有獨特的細胞結構，多年來一直被廣泛應用于光合作用、固氮作用和葉綠體起源等生物學問題的研究中。近年來，隨著藍藻分子生物學研究的深入，藍藻也開始被作為表達外源目的基因的受體系統(tǒng)。四.藍藻表達系統(tǒng)優(yōu)點：①藍藻遺傳背景簡單，便于基因操作和外源DNA的檢測；②藍藻是革蘭陰性菌，細胞壁主要由肽聚糖組成，便于外源DNA的轉(zhuǎn)化；③光合自養(yǎng)型生長，培養(yǎng)條件簡單，只需光、CO2、無機鹽、水和適宜的溫度就能滿足生長需要，生產(chǎn)成本低；④多數(shù)藍藻有內(nèi)源質(zhì)粒，為構建藍藻質(zhì)粒載體提供了良好的條件；⑤藍藻在各個生長時期均處于感受態(tài)，便于外源基因的轉(zhuǎn)化；四.藍藻表達系統(tǒng)優(yōu)點：⑥多數(shù)藍藻無毒，且富含蛋白質(zhì)，早已用作食品或保健品，在此基礎上開展轉(zhuǎn)基因技術研究，將一些重要藥物的基因轉(zhuǎn)入無毒藍藻，可達到錦上添花的效果。四.藍藻表達系統(tǒng)應用第二節(jié)

原核細胞表達策略①目的基因DNA片段的制備。目的基因可以從基因組中進行擴增，也可以通過人工合成的方法獲得。值得注意的是，原核細胞中缺乏真核生物的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，因此目的基因不能用真核生物的基因組DNA，而應該用cDNA。②目的基因與表達載體的連接。表達載體中，在啟動子區(qū)的下游設計有多克隆位點，目的基因的DNA片段通過這些位點插入到啟動子的下游，受到相應啟動子的調(diào)控。③將重組載體導入到宿主菌中，從而獲得相應的基因工程菌株。一般的轉(zhuǎn)化方法包括化學法、電轉(zhuǎn)化等。外源基因在原核細胞中的表達主要包括以下步驟外源基因在原核細胞中的表達主要包括以下步驟④對重組菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，并在生長量達到一定水平后誘導目的基因的表達，根據(jù)啟動子的類型，分為組成型表達和誘導型表達。⑤檢測目的蛋白的表達量及活性，然后進行分離純化。一.融合型表達將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起，但不改變兩個基因的閱讀框，這樣形成的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。外源蛋白以融合蛋白的方式表達時能以較高的效率進行，因為受體菌自身蛋白基因的SD序列和堿基組成等有利于基因的表達。常見的融合蛋白表達載體包括pRSET、pGEX系列等。一.融合型表達表達融合型蛋白時，為了得到正確的真核蛋白，在插入真核基因時，應非常注意其閱讀框架，確保融合的各個DNA片段的閱讀框架一致，只有這樣，在翻譯時才不至于產(chǎn)生移碼突變。以融合形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點：目的蛋白穩(wěn)定性高，尤其對分子量較小的多肽效果更佳。目的蛋白易于分離，利用受體蛋白建立相應抗體、配體、底物親和層析系統(tǒng)，可以快速獲得純度較高的融合蛋白。目的蛋白表達率高，與受體蛋白共用一套完善的表達元件。目的蛋白溶解性好，由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構象，且大多具有水溶性。目的蛋白需要回收，融合蛋白需要裂解和進一步分離，才能獲目的蛋白。在實際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段。一.融合型表達融合蛋白表達質(zhì)粒的構建原則：受體細胞的結構基因要能高效表達，其表達產(chǎn)物可以通過親和層析進行特異性簡單純化。外源基因應在受體蛋白編碼基因的下游，為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下，并不需要完整的受體結構基因，目的是盡可能避免融合蛋白分子中兩種組份的分子量過于接近，為目的蛋白分離回收創(chuàng)造條件。兩個結構基因拼接位點處的序列設計十分重要，它直接決定著融合蛋白的裂解工藝。兩個蛋白編碼序列應保持一致的翻譯閱讀框架。一.融合型表達用于融合蛋白構建的受體蛋白：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）維持良好空間構象麥芽糖結合蛋白（MBP）促進分泌金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA）免疫親和層析pRIT2T硫氧化還原蛋白（TrxA）維持良好空間構象pTrxFus外膜蛋白（OmpF）促進分泌

-半乳糖苷酶（LacZ）免疫親和層析泛素蛋白（Ubi）維持良好空間構象一.融合型表達目的蛋白的回收：一.融合型表達融合蛋白中受體蛋白部分的存在可能會影響目的蛋白的空間構象和生物活性，如果將之注入人體還會導致免疫反應，因此在制備和生產(chǎn)藥用目的蛋白時，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位點專一性斷裂方法有兩種：化學斷裂法和酶促裂解法?；瘜W斷裂法：一.融合型表達用于蛋白位點專一性化學斷裂的最佳試劑為溴化氰（CNBr），它與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側(cè)鏈的硫醚基反應，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個多肽降解片段其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端的第一位氨基酸殘基保持不變。這一方法的優(yōu)點是回收率高（可達到85%以上），專一性強，而且所產(chǎn)生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，與真核生物細胞中的成熟表達產(chǎn)物較為接近?；瘜W斷裂法：一.融合型表達如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法。一.融合型表達蛋白酶酶促裂解法的特點是斷裂效率更高，同時每種蛋白酶均具有相應的斷裂位點決定簇，因此可供選擇的專一性斷裂位點范圍較廣。幾種斷裂位點專一性最強的商品化蛋白酶分別在多肽鏈中的精氨酸、谷氨酸、賴氨酸殘基處切開酰胺鍵，形成不含上述殘基的下游斷裂肽段，與溴化氰化學斷裂法相似。

酶促裂解法：單殘基位點蛋白內(nèi)切酶切割位點梭菌蛋白酶Arg-C葡萄球菌蛋白酶Glu-C假單孢菌蛋白酶Lys-C豬胰蛋白酶Arg-CArgCNNC受體蛋白目的蛋白酶促裂解法：單殘基位點一.融合型表達

蛋白酶裂解融合蛋白的前提條件是外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴氨酸，如果外源基因表達產(chǎn)物為小分子多肽，這一限制條件并不苛刻，但大分子量的異源蛋白來說，上述三種氨基酸殘基的出現(xiàn)頻率是相當高的。酶促裂解法：多殘基位點一.融合型表達為了克服僅切單一氨基酸殘基的蛋白酶所帶來的應用局限性，可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子的外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接頭片段，該寡肽為具有蛋白酶活性的凝血因子Xa的識別和作用序列，其斷裂位點在Arg的C末端。

純化后的融合蛋白用Xa處理，即可獲得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于Xa的識別作用序列由四個氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，因此這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不同大小的目的蛋白產(chǎn)物。目的蛋白的回收ATCGAAGGTCGCGAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCXa-1ATCGAAGGTCGCGAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGXa-2ATCGAAGGTCGCGAAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGXa-3NruIHindIIIPvuIIBamHIKpnIEcoRVBglIISmaIXa因子切割位點IleGluGlyArgGlu酶促裂解法：多殘基位點Xa因子識別位點編碼序列生物素結合肽編碼序列SP6T7AproritacMCSPinpointXa啟動子受體基因GST接頭目的基因MetArgStopLysGluIle-Glu-gly-ArgIle-Glu-gly-Arg表達親和層析酶解回收谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）谷胱甘肽酶促裂解法：多殘基位點二.非融合型表達不與細菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表達蛋白稱為非融合蛋白。非融合蛋白的優(yōu)點在于它具有非常近似于真核生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的結構，因此表達產(chǎn)物的生物學功能也就更接近于生物體內(nèi)天然蛋白質(zhì)。二.非融合型表達非融合蛋白的最大缺點是容易被細菌蛋白酶破壞。為了在原核細胞中表達出非融合蛋白，可將帶有起始密碼ATG的真核基因插到原核啟動子與SD序列的下游，組成一個雜合的核糖體結合區(qū)，經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯，得到非融合蛋白。不易分離純化。三.分泌型表達大腸桿菌中某些蛋白質(zhì)屬于分泌型蛋白質(zhì)，可以被分泌到細胞膜外的間質(zhì)中，這是由于在這些蛋白質(zhì)的N端存在著一段稱為信號肽(signalpeptide)的多肽。在信號肽的幫助下，蛋白質(zhì)可以跨過細胞膜而分泌到胞外。蛋白質(zhì)的分泌機制原核細菌周質(zhì)中含有多種分子伴侶可阻止分泌蛋白的隨機折疊，分泌在細胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中的重組蛋白很少形成分子間的二硫鍵交聯(lián)，因此與包涵體相比，分泌型重組蛋白具有較高比例的正確構象，生物活性的回收率增加，且對蛋白酶不敏感。三.分泌型表達大腸桿菌中某些蛋白質(zhì)屬于分泌型蛋白質(zhì)，可以被分泌到細胞膜外的間質(zhì)中，這是由于在這些蛋白質(zhì)的N端存在著一段稱為信號肽(signalpeptide)的多肽。在信號肽的幫助下，蛋白質(zhì)可以跨過細胞膜而分泌到胞外。因此，將編碼信號肽的DNA序列插入到載體的啟動子與目的基因之間，就可使目的基因編碼的蛋白質(zhì)分泌到胞外，減少了細菌蛋白酶的破壞，同時為表達產(chǎn)物的分離純化等提供了極大的方便。三.分泌型表達常用的分泌型表達載體包括pINⅢ、plN-ompA等系列。三.分泌型表達優(yōu)點：簡化了發(fā)酵后處理的純化工藝；減少了外源蛋白在細胞內(nèi)被蛋白酶降解的概率；通過對分泌表達的設計有利于形成正確的空間構象，獲得有較好生物學活性或免疫原性的蛋白質(zhì)。三.分泌型表達缺點：相對其它生物細胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機制不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進行分泌型表達，少數(shù)外源基因既便能分泌表達，但其表達率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍。四.多拷貝表達外源基因在細胞中的表達水平與目的基因的拷貝數(shù)相關。研究表明，當表達載體上外源基因的拷貝數(shù)增加時，可將外源蛋白的表達量相應提高。表達載體上可表達的基因包括外源基因和選擇標記基因等，當細胞內(nèi)質(zhì)粒表達載體的拷貝數(shù)增加時，用于合成目的蛋白之外的其他蛋白質(zhì)的量也相應增加，而過多地表達非目的基因消耗大量能量，影響菌株的生長代謝。因而在構建外源蛋白表達載體時，可以考慮將多個外源蛋白基因串聯(lián)在一起，克隆在嚴謹型質(zhì)粒載體上。四.多拷貝表達以這種策略表達外源蛋白時，雖然宿主細胞內(nèi)質(zhì)粒的拷貝數(shù)減少，但外源基因在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的mRNA的拷貝數(shù)并不減少。這種方法對分子量較小的外源蛋白更為有效。四.多拷貝表達外源基因多分子線性重組的方式通常有三種：一是多表達單元的重組，即每個表達單元都含有獨立的啟動子、終止子、SD序列、起始密碼和終止密碼，形成獨立轉(zhuǎn)錄與串聯(lián)翻譯的表達單元，表達單元之間的連接方向與表達效率無關。表達的外源蛋白不須經(jīng)過裂解處理。這種方式適合于表達分子量較大的蛋白質(zhì)。典型的編碼蛋白質(zhì)的原核基因結構示意圖四.多拷貝表達外源基因多分子線性重組的方式通常有三種：一是多表達單元的重組，即每個表達單元都含有獨立的啟動子、終止子、SD序列、起始密碼和終止密碼，形成獨立轉(zhuǎn)錄與串聯(lián)翻譯的表達單元，表達單元之間的連接方向與表達效率無關。表達的外源蛋白不須經(jīng)過裂解處理。這種方式適合于表達分子量較大的蛋白質(zhì)。二是多順反子重組，即多拷貝外源基因有各自的SD序列、翻譯起始和終止信號，但這些基因的轉(zhuǎn)錄使用共同的轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子，表達的外源蛋白分子仍是相互獨立的，這種方式對表達中等大小分子量的外源蛋白比較合適。四.多拷貝表達外源基因多分子線性重組的方式通常有三種：三是多編碼序列重組，即將多個外源基因串聯(lián)在一起，利用同一套轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和翻譯起始與終止密碼子，在各自編碼序列的連接處引入蛋白酶酶切位點或可被化學斷裂的位點，這種方式適合表達外源小分子量蛋白質(zhì)或多肽。五.整合型表達將一種重組質(zhì)粒導入受體細胞后，宿主細胞的代謝會發(fā)生較大改變，同時由于細胞不斷地進行分裂，經(jīng)若干次傳代后宿主細胞內(nèi)的重組質(zhì)粒會發(fā)生丟失。因此，一種理想的選擇是將要表達的外源基因整合到宿主菌的染色體的特定位置上，使之成為染色體結構的一部分而穩(wěn)定地遺傳和表達。五.整合型表達優(yōu)點：目的基因表達穩(wěn)定整合型的目的基因隨受體細胞染色體DNA的復制而復制，在大多數(shù)情況下相當穩(wěn)定，工程菌在沒有選擇壓力存在下可以連續(xù)培養(yǎng)而不丟失目的基因表達盒，這對以改良物種遺傳性狀為目的的基因工程案例特別有意義。缺點：目的基因表達率低單拷貝整合的目的基因表達率受到限制，此時可通過強化表達元件而加以補償。在生物體細胞尤其是原核細菌細胞內(nèi)，廣泛存在著DNA的遺傳重組機制，其可能的生物學功效是促進生物種群的進化。細胞內(nèi)的遺傳重組可分為兩大類：DNA體內(nèi)重組的基本原理（1）轉(zhuǎn)位因子依賴型（2）同源序列依賴型轉(zhuǎn)位因子是指生物細胞內(nèi)天然存在的一類無復制能力的DNA可移動因子，不同生物種群擁有結構不同的轉(zhuǎn)位因子，例如：轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子家族DNA體內(nèi)重組的基本原理噬菌體

G片段（G-Fragment）真核細菌 轉(zhuǎn)座子（Tn、Ty）原核細菌 插入順序（IS）高等植物

可移動因子（Ac、Ds）高等動物 跳躍基因（mobilgene）轉(zhuǎn)位因子依賴型的體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子的結構IS（1kb）Ty（5kb）Tn（2-20kb）ACCATGGTTTTGGTACCA抗藥性基因轉(zhuǎn)位酶基因識別位點阻遏基因IRIRIRIRISISDNA體內(nèi)重組的基本原理在很多原核細菌細胞中，染色體DNA鏈上的兩個同源區(qū)之間可發(fā)生所謂的同源重組，其頻率與細菌種類、兩個同源區(qū)之間的距離同源區(qū)的長度、同源程度密切相關。一般地說，距離越遠、長度越長、同源性越高，重組的頻率也就越高，反之亦然。同源重組有整合和交換兩種形式，前者只需要一個斷裂位點，而后者涉及兩個斷裂位點。（2）同源序列依賴型的體內(nèi)重組：基本形式DNA體內(nèi)重組的基本原理（2）同源序列依賴型：同源交換DNA體內(nèi)重組的基本原理染色體DNA同源區(qū)域標記基因ori目的基因整合位點（2）同源序列依賴型：同源交換DNA體內(nèi)重組的基本原理ori同源區(qū)域交換區(qū)域染色體DNA目的基因標記基因ori+六.提高表達效率的方法1.啟動子的選擇2.核糖體結合位點3.選擇強終止子4.提高表達載體的質(zhì)粒拷貝數(shù)和穩(wěn)定性5.注意不同物種對密碼子的偏好性1.啟動子的選擇原核基因的表達調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平，以操縱子為單位，因此啟動子的正確選擇是實現(xiàn)目標蛋白高表達的關鍵步驟之一。原核生物的啟動子一般由四部分構成：①轉(zhuǎn)錄起始位點；②Pribnowbox(也稱-10區(qū))；③Sextama框(也稱-35區(qū))；④間隔區(qū)。①作用要強，待表達的基因產(chǎn)物要占有或超過菌體總蛋白的10%~30%；②必須表現(xiàn)最低水平的基礎轉(zhuǎn)錄活性，最好選用高密度培養(yǎng)細胞和表現(xiàn)最低基礎轉(zhuǎn)錄活性的可誘導或非抑制啟動子，以減少合成的外源蛋白對宿主細胞的毒害作用或?qū)ζ渖L的限制作用；③啟動子具有簡便和廉價的可誘導性。1.啟動子的選擇能在原核表達系統(tǒng)中應用的啟動子很多，為了提高表達水平，這些啟動子必須具有以下特性：目前，在大腸桿菌表達系統(tǒng)中最常用的是來自于大腸桿菌噬菌體的T7啟動子、lac啟動子(乳糖啟動子)、trp啟動子(色氨酸啟動子)、λ噬菌體PL啟動子(λ噬菌體的左向啟動子)以及tac啟動子(乳糖和色氨酸的雜合啟動子)等。1.啟動子的選擇啟動子具有如下特征：(1)序列特異性。在啟動子的DNA序列中，通常含有幾個保守序列框，序列框中堿基的變化會導致轉(zhuǎn)錄啟動的滯后和轉(zhuǎn)錄速度的減慢。(2)方向性。啟動子是一種有方向性的順式調(diào)控元件，在正反兩種方向中只有一種具有啟動功能。(3)位置特異性。啟動子只能位于所啟動轉(zhuǎn)錄基因的上游或者基因內(nèi)的前端，處于基因的下游或在基因的上游但遠離所要啟動的基因，則一般不會有作用。1.啟動子的選擇啟動子具有如下特征：(4)種屬特異性原核生物的不同種、屬，真核生物的不同組織都具有不同類型的啟動子。但一般來說，親緣關系越近的兩種生物，其啟動子通用的可能性也越大。1.啟動子的選擇啟動子的構建啟動子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlLPrecAPtraAPlacPtacTTGACATTGATATAGACATTTACATTGACATATAATTATAATTAATGTTATAATGATACTPtrpTTGACATTAACTEEAEE啟動子最佳距離的探測目的基因A酶切開目的基因啟動子Bal31酶解野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒有誘導物存在時，整個操縱子處于基底水平表達；誘導物可以使啟動子Plac介導的轉(zhuǎn)錄大幅提高啟動子的可控性（lac啟動子）乳糖啟動子Plac的可控性：基底水平轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導高效轉(zhuǎn)錄POPO野生型的Plac上游附近擁有代謝激活因子（CAP）結合區(qū)，cAMP激活CAP，CAP結合啟動子控制區(qū)，進而促進Plac介導的轉(zhuǎn)錄。葡萄糖代謝使cAMP減少，也能阻遏Plac介導的轉(zhuǎn)錄。因此，基因工程中使用的乳糖啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5乳糖啟動子Plac的可控性：cAMPCAP高效轉(zhuǎn)錄基底水平轉(zhuǎn)錄cAMP濃度降低葡萄糖代謝高效轉(zhuǎn)錄PlacPlacPlacUV5OOO啟動子的可控性（lac啟動子）色氨酸啟動子Ptrp的可控性：色氨酸啟動子Ptrp受是大腸桿菌的色氨酸操縱子的啟動子，在色氨酸操縱子的調(diào)控中，細胞中色氨酸的濃度是重要的調(diào)控因素，B-吲哚丙烯酸是色氨酸的競爭抑制劑，它能與阻遏蛋白結合，阻止色氨酸與阻遏蛋白的結合，是一種轉(zhuǎn)錄促進劑。如果刪除了衰減子則可使轉(zhuǎn)錄效率提高8~10倍。色氨酸基底水平轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白除去色氨酸PtrpOtrp或加3-吲哚丙烯酸（IAA）高效轉(zhuǎn)錄高效轉(zhuǎn)錄PtrpOtrpPtrpOtrp啟動子的可控性（trp啟動子）啟動子的構建啟動子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlLPrecAPtraAPlacPtacTTGACATTGATATAGACATTTACATTGACATATAATTATAATTAATGTTATAATGATACTPtrpTTGACATTAACTtac啟動子亦稱為trp-lac啟動子，是一組由lac和trp啟動子人工構建的雜合啟動子。tac啟動子受乳糖操縱子的阻遏蛋白的負調(diào)控，當存在有高水平的lac阻遏蛋白時，tac啟動子受到抑制，如加入IPTG后，可使tac啟動子去阻遏并誘導其表達。啟動子的可控性（tac啟動子）PL和PR啟動子分別是λ噬菌體基因組上的左向和右向啟動子，它們都是強啟動子，比lac啟動子的活性高8~10倍。

PL和PR啟動子受λ噬菌體cI基因產(chǎn)物的負調(diào)控。cI基因產(chǎn)物是溫度敏感蛋白，是PL和PR啟動子轉(zhuǎn)錄的阻遏蛋白。在較低溫度(28~32℃)培養(yǎng)時，cI基因產(chǎn)物產(chǎn)生抑制作用，在溫度升至42℃時，其被破壞，于是PL和PR啟動子開始轉(zhuǎn)錄。在構建帶有PL和PR啟動子表達載體時，需將cI基因組裝在表達載體上，或選擇溶源化入噬菌體的大腸桿菌作為該表達載體的宿主菌，如N99cI+菌株。啟動子的可控性（PL和PR啟動子）T7噬菌體啟動子是目前最常用的啟動子，如Invitrogen公司的pET系列就是采用的該啟動子。在該系統(tǒng)中，目的基因的轉(zhuǎn)錄完全依賴于T7噬菌體RNA聚合酶，所以在構建帶有T7噬菌體啟動子表達載體時，需要配合使用能表達T7噬菌體RNA聚合酶的受體菌，這些菌株是被噬菌體溶源化的，如JM109(DE3)、BL21(DE3)、HMS174(DE3)等。啟動子的可控性（T7噬菌體啟動子）六.提高表達效率的方法1.啟動子的選擇2.核糖體結合位點3.選擇強終止子4.提高表達載體的質(zhì)粒拷貝數(shù)和穩(wěn)定性5.注意不同物種對密碼子的偏好性2.核糖體結合位點mRNA在細菌中的翻譯效率嚴格依賴于是否有核糖體結合位點的存在，這是因為細菌在翻譯水平上的調(diào)控是不嚴格的，只有mRNA和核糖體的結合，才是蛋白質(zhì)合成的關鍵。核糖體結合位點(ribosome-bindingsite，RBS)是指緊靠啟動子下游的，從轉(zhuǎn)錄起始位點開始延伸幾十個堿基長度的一段序列，翻譯起始密碼子AUG通常位于它的中心位置，是核糖體RNA識別與結合的位點。2.核糖體結合位點在原核生物中，RBS又被稱為SD序列，是位于起始密碼子AUG上游3~10bp處、由3~9bp組成的一致性序列。這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16sRNA3-末端的富含嘧啶核苷酸的序列互補，是核糖體RNA的識別與結合位點。核糖體結合位點對外源基因表達的影響SD序列(AAGGA或UAAGGAGG)與起始密碼子(AUG)的間距對翻譯起始效率影響較大。當lac啟動子的SD序列距ATG為7個核苷酸時，目的基因的表達最高，而間隔8個核苷酸時，表達水平下降500倍。mRNA與rRNA的互補區(qū)域越長，基因翻譯的概率就越大。SD序列與起始密碼子之間的堿基組成也影響翻譯的起始效率。SD序列所在的翻譯起始區(qū)應避免出現(xiàn)二級結構，否則將會降低翻譯起始效率。六.提高表達效率的方法1.啟動子的選擇2.核糖體結合位點3.選擇強終止子4.提高表達載體的質(zhì)?？截悢?shù)和穩(wěn)定性5.注意不同物種對密碼子的偏好性3.選擇強終止子在基因的3′-末端或一個操縱子的3′-末端往往還有一特定的核苷酸序列，它有終止轉(zhuǎn)錄的功能，這一DNA序列稱為轉(zhuǎn)錄終止子或簡稱終止子。終止子是表達載體中必不可少的元件，既可避免高水平轉(zhuǎn)錄對高拷貝質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響，又可使轉(zhuǎn)錄出的mRNA盡可能短，以提高mRNA的穩(wěn)定性，從而提高蛋白質(zhì)的表達水平。依據(jù)轉(zhuǎn)錄終止機理的不同，原核生物的轉(zhuǎn)錄終止子可以分為兩類：依賴于

因子的終止子(弱終止子)和不依賴于

因子的終止子(強終止子)。3.選擇強終止子在構建表達載體時，一般使用強終止子終止外源基因的表達。六.提高表達效率的方法1.啟動子的選擇2.核糖體結合位點3.選擇強終止子4.提高表達載體的質(zhì)?？截悢?shù)和穩(wěn)定性5.注意不同物種對密碼子的偏好性4.提高表達載體的質(zhì)?？截悢?shù)和穩(wěn)定性強化外源基因在原核宿主菌中高效表達的中心環(huán)節(jié)是提高mRNA的數(shù)量。這可通過兩種途徑來實現(xiàn)：一是用強啟動子以提高轉(zhuǎn)錄效率；二是將外源基因克隆在高拷貝的表達載體上。質(zhì)粒分子過量增殖消耗大量能量，影響受體細胞的生長和代謝，進而導致質(zhì)粒的不穩(wěn)定以及外源基因宏觀表達水平的降低。解決這一問題的一種有效策略是在表達載體中采用可調(diào)控的誘導型復制子來控制質(zhì)粒的增殖。例如，pCP3表達質(zhì)粒的復制子來源于溫度敏感型質(zhì)粒pKN402，可受溫度誘導。質(zhì)粒擴增時序的控制pCP3擁有一個溫度可誘導型的復制子。在28℃時，每個細胞的質(zhì)粒拷貝數(shù)為60；在42℃時，拷貝數(shù)迅速增至300–600，在此溫度下，受體細胞染色體上的CI基因表達的溫度敏感型阻遏蛋白失活。因此，用一種手段同時控制質(zhì)?？截悢?shù)和基因的表達pCP3MCSPLAproriVectorsCopyNumberoripUC~500-700pMB1(derivative)pBR322~15-20pMB1pET~15-20pBR322pGEX~15-20pBR322pColE1~15-20ColE1pR6K~15-20R6KpACYC~10p15ApSC101~5pSC101pBluescript~300-500ColE1(derivative)andF1pGEM~300-500pUCandF1常見質(zhì)粒載體拷貝數(shù)及其復制子表7-1原核表達載體上的常用復制子受體菌復制子大腸桿菌pMBIp15ApColE1pSC101芽孢桿菌pUB110pC194pE194pHY481pWT481鏈霉菌pIJ101SCP2pIJ702pIJ61pIJ699pKC796藍藻pPbspPKE2pUC104pSG111六.提高表達效率的方法1.啟動子的選擇2.核糖體結合位點3.選擇強終止子4.提高表達載體的質(zhì)?？截悢?shù)和穩(wěn)定性5.注意不同物種對密碼子的偏好性5.注意不同物種對密碼子的偏好性由于遺傳密碼的簡并性(degeneracy)，除個別氨基酸(色氨酸和甲硫氨酸)外，大多數(shù)氨基酸都具有兩個或者兩個以上的密碼子。這種編碼相同氨基酸的一組密碼子稱為同義密碼子(synonymcodon)。5.注意不同物種對密碼子的偏好性由于遺傳密碼的簡并性(degeneracy)，除個別氨基酸(色氨酸和甲硫氨酸)外，大多數(shù)氨基酸都具有兩個或者兩個以上的密碼子。這種編碼相同氨基酸的一組密碼子稱為同義密碼子(synonymcodon)。通過對大腸桿菌各種基因序列的大量分析表明，同義密碼子在基因中出現(xiàn)的頻率并不一樣，即密碼子使用存在差異的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象同樣存在于真核生物中，稱為密碼子偏好或密碼子偏愛(codonpreference)。5.注意不同物種對密碼子的偏好性研究者對大腸桿菌中的密碼子使用頻率進行系統(tǒng)分析得到以下結論：①大多數(shù)簡并密碼子中的一個或兩個具有偏好；②某些密碼子對所有不同的基因都是常用的，如CCG是脯氨酸最常用的密碼子；③表達強度高的基因比表達強度低的基因表現(xiàn)更大程度的密碼子偏好性；④同義密碼子的使用頻率與相應的tRNA含量呈高度相關。5.注意不同物種對密碼子的偏好性不同生物甚至同種生物的不同蛋白質(zhì)的基因?qū)啿⒚艽a子的使用有一定的選擇性。一般來說稀有密碼子含量較高(或稀有密碼子連續(xù)岀現(xiàn))的外源基因，在翻譯過程中容易發(fā)生提前終止或移碼突變或翻譯速率變慢?？刹扇∠铝写胧?/p>

①在受體菌中共表達稀有密碼子tRNA基因，以提高受體菌中稀有密碼子tRNA的豐度；

②在不改變外源基因編碼蛋白的一級結構的前提下，可通過突變或者基因重新合成方法將外源基因中的稀有密碼子改為受體菌中的偏愛密碼子。密碼子優(yōu)化密碼子優(yōu)化技術，使得優(yōu)化后的proteinα表達水平相比未優(yōu)化的序列提高了10倍。5.注意不同物種對密碼子的偏好性外源基因全合成。

按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規(guī)律，設計更換外源基因中不適宜的相應簡并密碼子，重組人胰島素、干擾素以及生長激素在大腸桿菌中的高效表達均采用了這種方法。本章內(nèi)容第一節(jié)原核表達系統(tǒng)的種類第二節(jié)原核表達策略第三節(jié)基因工程菌的大規(guī)模培養(yǎng)第四節(jié)原核表達產(chǎn)物的分離純化第五節(jié)基因工程菌不穩(wěn)定性及對策第六節(jié)原核表達應用舉例第四節(jié)

原核表達產(chǎn)物的分離純化傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品和基因工程產(chǎn)品提取精制的差異差異項目傳統(tǒng)發(fā)酵基因工程發(fā)酵產(chǎn)品分子量一般為小分子，對產(chǎn)品結構分析比較透徹大分子，必要數(shù)據(jù)缺乏，放大多憑經(jīng)驗表達物細胞內(nèi)定位細胞內(nèi)外都有一般位于細胞內(nèi)表達量表達量低表達量高提取方法簡單復雜一、分離純化的目標與策略利用轉(zhuǎn)基因工程菌株表達外源基因所獲得的目標蛋白的分離和純化，一般包括兩大步驟：一是初步分離獲得初提物，這一過程具體包括細胞破碎、蛋白類物質(zhì)的分離以及對特異表達蛋白的沉淀和超濾濃縮等；二是對初提物進行進一步提純，提高其品質(zhì)，這一過程所采用的手段包括色譜和電泳等。分離純化的目標分離純化的目標：將重組蛋白質(zhì)從雜質(zhì)蛋白質(zhì)、核酸、脂類、糖類以及其他代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基成分中分離出來。分離產(chǎn)物所需達到的目標與產(chǎn)物的用途有關。如果分離純化的蛋白質(zhì)只是用作一般實驗室研究使用，則一般不會過多地考慮作為基因工程藥物所顧及的純度和安全性，而且事實上也不會有純度為100%的蛋白質(zhì)。如果作為蛋白質(zhì)晶體結構分析、序列測定或作為人體注射用藥物，則純度和安全性將是考慮的最重要的因素。對于生產(chǎn)者和客戶來說，生產(chǎn)成本也是考慮的重要因素之一。(1)確定分離純化策略時必須考慮的因素①表達系統(tǒng)的影響?；蚬こ瘫磉_系統(tǒng)的影響包括工程菌的種類或細胞類型、代謝特征、表達方式(胞內(nèi)、胞外、包含體)、表達產(chǎn)物和副產(chǎn)物種類、代謝物種類、產(chǎn)物類似物毒素和能降解表達產(chǎn)物的酶類等。第四章基因工程的載體第一節(jié)質(zhì)粒載體第二節(jié)噬菌體載體第三節(jié)酵母載體第四節(jié)Ti質(zhì)粒表達載體第五節(jié)病毒表達載體第六節(jié)人工染色體載體(1)確定分離純化策略時必須考慮的因素①表達系統(tǒng)的影響。基因工程表達系統(tǒng)的影響包括工程菌的種類或細胞類型、代謝特征、表達方式(胞內(nèi)、胞外、包含體)、表達產(chǎn)物和副產(chǎn)物種類、代謝物種類、產(chǎn)物類似物毒素和能降解表達產(chǎn)物的酶類等。②表達產(chǎn)物性質(zhì)的影響。重組蛋白質(zhì)本身的物理、化學與生物學特性，包括化學組成分子量、等電點、電荷分布和密度、溶解度、穩(wěn)定性、疏水性、擴散性、分配系數(shù)、吸附性能、生物學活性、親和性、配基種類和表面活性等都是分離純化的重要依據(jù)，必須充分考慮。同時應該考慮到重組蛋白質(zhì)都是具有生物活性的大分子。(1)確定分離純化策略時必須考慮的因素③初始物料、雜質(zhì)等因素的影響。由于使用的菌種不同，所需的原始物料及由此產(chǎn)生的雜質(zhì)也有很大不同，這些因素都會對目的產(chǎn)物的分離純化產(chǎn)生影響。④生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)條件的影響。生產(chǎn)工藝包括生產(chǎn)方式(連續(xù)、分批、半連續(xù))、生產(chǎn)周期、生產(chǎn)能力、工藝控制等，生產(chǎn)條件主要是指生產(chǎn)中的環(huán)境條件、衛(wèi)生條件、無菌狀態(tài)與滅菌方法等，這些因素也會影響產(chǎn)物的分離純化。(2)制定合理的純化方式和純化工藝蛋白質(zhì)純化包含許多方法，包括沉淀、色譜、電泳、離心等各種分離方法，但如何將這些方法有機地結合起來，形成完整的工藝過程則是最為重要的環(huán)節(jié)。沉淀。硫酸銨或乙醇等進行沉淀可獲得2~8倍純化目標蛋白。沉淀硫酸銨沉淀法是粗分離蛋白時常用的純化和濃縮蛋白的技術。蛋白質(zhì)的溶解度和鹽濃度密切相關，在低濃度的條件下，隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)的溶解度增加；但在高濃度的鹽溶液里，鹽離子競爭性的結合蛋白表面的水分子，破壞蛋白表面的水化膜，溶解度降低，蛋白質(zhì)在疏水作用下聚集形成沉淀。(2)制定合理的純化方式和純化工藝蛋白質(zhì)純化包含許多方法，包括沉淀、色譜、電泳、離心等各種分離方法，但如何將這些方法有機地結合起來，形成完整的工藝過程則是最為重要的環(huán)節(jié)。沉淀。硫酸銨或乙醇等進行沉淀可獲得2~8倍純化目標蛋白。超濾離心。超濾可分離相對分子質(zhì)量在1,000~300,000間的蛋白質(zhì)。(2)制定合理的純化方式和純化工藝蛋白質(zhì)純化包含許多方法，包括沉淀、色譜、電泳、離心等各種分離方法，但如何將這些方法有機地結合起來，形成完整的工藝過程則是最為重要的環(huán)節(jié)。沉淀。硫酸銨或乙醇等進行沉淀可獲得2~8倍純化目標蛋白。超濾離心。超濾可分離相對分子質(zhì)量在1,000~300,000間的蛋白質(zhì)。色譜。經(jīng)過沉淀、超濾處理的樣品常進一步進行柱色譜，以快速捕獲蛋白質(zhì)，盡可能減少蛋白質(zhì)降解和其他修飾。(2)制定合理的純化方式和純化工藝融合標簽。對于重組蛋白，一般已在其C端或N端連接上了一個融合標簽，包括與底物或抑制劑親和的全酶、與單克隆抗體結合的抗原表位、由IMAC復性的寡聚組氨酸、血凝素識別的碳水化合物結合蛋白或結合域、體內(nèi)生物素化的生物素結合域等。利用這個標簽可以進行親和色譜純化以獲得目標蛋白。用于融合蛋白構建的受體蛋白：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）維持良好空間構象麥芽糖結合蛋白（MBP）促進分泌金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA）免疫親和層析pRIT2T硫氧化還原蛋白（TrxA）維持良好空間構象pTrxFus外膜蛋白（OmpF）促進分泌

-半乳糖苷酶（LacZ）免疫親和層析泛素蛋白（Ubi）維持良好空間構象一.融合型表達(2)制定合理的純化方式和純化工藝融合標簽。對于重組蛋白，一般已在其C端或N端連接上了一個融合標簽，包括與底物或抑制劑親和的全酶、與單克隆抗體結合的抗原表位、由IMAC復性的寡聚組氨酸、血凝素識別的碳水化合物結合蛋白或結合域、體內(nèi)生物素化的生物素結合域等。利用這個標簽可以進行親和色譜純化以獲得目標蛋白。部分融合系統(tǒng)中標簽蛋白可能會干擾目標蛋白的生物學活性和穩(wěn)定性，可利用預先設計的特異性蛋白酶裂解位點切除標簽蛋白。二、分離純化的一般過程根據(jù)外源基因在宿主細胞中表達方式的差別以及表達蛋白本身的特性，重組蛋白的分離純化工藝各不相同。一般都包括對發(fā)酵液進行預處理、回收菌體、細胞破碎、離心分離、樣品的濃縮與預處理、柱色譜和電泳等步驟。在分離過程中，為保證蛋白質(zhì)的生物活性，一般在低溫條件下操作，提取的條件也要盡量保持溫和。分離純化方法的選擇性要好，能從復雜的混合物中有效地將目的產(chǎn)物分離出來，達到較高純化倍數(shù)和回收率。1.發(fā)酵液的預處理預處理有助于后面的操作過程，可以達到以下目的：改變發(fā)酵液的物理性提高固液分離效率；轉(zhuǎn)移產(chǎn)物至后續(xù)處理的相中；除去部分雜質(zhì)，簡化后續(xù)工藝。發(fā)酵液的預處理內(nèi)容主要包括改變發(fā)酵液物理性狀(如加熱、調(diào)節(jié)PH值、絮凝等)以及改善固液分離特性(通過過濾等方法實現(xiàn)固液分離)兩類方法，根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)可選擇某一種或者其中的幾種方法相結合使用。2.細胞分離(1)離心沉降法是利用固體顆粒在外力作用下與液體物質(zhì)作相對運動最終實現(xiàn)固液分離的細胞分離技術。2.細胞分離(1)離心沉降法是利用固體顆粒在外力作用下與液體物質(zhì)作相對運動最終實現(xiàn)固液分離的細胞分離技術。(2)過濾法主要利用多孔介質(zhì)將固液懸液中的固相顆粒截留，液體則通過介質(zhì)來實現(xiàn)分離。根據(jù)被分離物質(zhì)的大小可以分為一般介質(zhì)的過濾和膜過濾。3.細胞破碎對于在胞內(nèi)表達的蛋白質(zhì)，將細胞與液態(tài)相分離后，就要考慮將細胞破碎，以使目標蛋白質(zhì)從胞內(nèi)釋放到提取液中，然后進行目的產(chǎn)物的純化。常用的細胞破碎方法包括物理法、化學法和生物方法，破碎細胞壁和細胞膜，從而將胞內(nèi)物質(zhì)釋放到提取液中。針對不同的細胞種類和細胞的不同生長狀態(tài)，可選擇適當?shù)钠扑榉椒?。常見的破碎方法有變性劑裂解法、超聲波破碎法、機械破碎法、酶解法和反復凍融法。3.細胞破碎(1)變性劑裂解法有的細胞如果沒有堅硬的細胞壁，破碎條件可選擇相對較溫和的變性劑進行裂解。在破碎緩沖液中加入變性劑就可使細胞破裂。常用的變性劑包括鹽酸胍、尿素、SDS、Nonidet-40(NP-40)、吐溫等。(2)超聲波破碎法這是實驗室常用的一種細胞破碎方法。超聲波法破碎細胞的一個明顯缺點是在超聲波處理過程中，會產(chǎn)生大量的熱量，可能破壞蛋白質(zhì)結構，所以應采取相應的降溫措施。3.細胞破碎(3)機械破碎法該法利用外力作用將細胞破碎，最常用的就是研磨法，適合于細菌酵母和植物細胞的破碎。在研磨之前，一般加入石英砂或細玻璃珠與待破碎的細胞混合，以增大摩擦力，使細胞更容易硏碎。另外可以采取的一個措施是在硏磨前將待破碎細胞用液氮處理，在液氮中研磨既増加了細胞的脆性也提供了低溫環(huán)境，保證了蛋白質(zhì)活性。3.細胞破碎(3)機械破碎法該法利用外力作用將細胞破碎，最常用的就是研磨法，適合于細菌酵母和植物細胞的破碎。在研磨之前，一般加入石英砂或細玻璃珠與待破碎的細胞混合，以增大摩擦力，使細胞更容易硏碎。另外可以采取的一個措施是在硏磨前將待破碎細胞用液氮處理，在液氮中研磨既増加了細胞的脆性也提供了低溫環(huán)境，保證了蛋白質(zhì)活性。(4)酶解法該法主要參考組成細胞壁的物質(zhì)分子特點，利用能降解細胞壁的酶將菌體細胞壁破壞，使細胞暴露在低滲溶液或者含變性劑的溶液中從而破裂。3.細胞破碎(5)反復凍融法該法利用生物組織經(jīng)冰凍后，細胞內(nèi)液結冰膨脹從而破壞細胞。具體操作方法是將細胞在-20℃以下冰凍，室溫融解，反復幾次后，大部分細胞都可被破碎。4.離心分離離心是基因表達產(chǎn)物分離純化的重要步驟，包括高速離心和超速離心。高速離心的離心力一般在10000g的范圍以內(nèi)，主要用來去除未破碎的細胞和細胞壁碎片等。經(jīng)過高速離心后細胞膜碎片和細胞內(nèi)的可溶性蛋白等主要存在于上清液中。如果基因表達產(chǎn)物是小分子可溶性蛋白，還可以進行超速離心(10000以上)以除去細胞膜碎片等雜質(zhì)。5.柱色譜根據(jù)蛋白質(zhì)的不同用途，需要對表達的特異性蛋白質(zhì)進行進一步的分離純化，而柱色譜技術是蛋白質(zhì)分離純化的重要手段。色譜法(chromatography)包括凝膠過濾色譜、離子交換色譜、疏水色譜、親和色譜、吸附色譜、金屬鏊合色譜以及共價色譜等。6.電泳電泳不僅是檢測蛋白質(zhì)的重要手段，在實驗室也可以作為少量制備或純化蛋白質(zhì)的方法。蛋白質(zhì)電泳通常采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。PAGE可分為Native和SDS兩種，前者主要用于不能變性的表達蛋白的分離與純化，后者則用于可通過變性的方法作進一步純化的特異性表達蛋白。三、包涵體的溶解和重組蛋白的復性在外源基因的原核表達中，尤其是以大腸桿菌為宿主菌高效表達外源基因時，表達蛋白常常在細胞質(zhì)內(nèi)聚集形成不溶性蛋白質(zhì)晶狀物，稱為包涵體(inclusionbody)。三、包涵體的溶解和重組蛋白的復性在外源基因的原核表達中，尤其是以大腸桿菌為宿主菌高效表達外源基因時，表達蛋白常常在細胞質(zhì)內(nèi)聚集形成不溶性蛋白質(zhì)晶狀物，稱為包涵體(inclusionbody)。包涵體是不具有膜結構的非晶體性蛋白質(zhì)聚集體。在偏振光顯微鏡或電子顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)包涵體與細胞質(zhì)的明顯區(qū)別。三、包涵體的溶解和重組蛋白的復性在外源基因的原核表達中，尤其是以大腸桿菌為宿主菌高效表達外源基因時，表達蛋白常常在細胞質(zhì)內(nèi)聚集形成不溶性蛋白質(zhì)晶狀物，稱為包涵體(inclusionbody)。包涵體是不具有膜結構的非晶體性蛋白質(zhì)聚集體。在偏振光顯微鏡或電子顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)包涵體與細胞質(zhì)的明顯區(qū)別。目前上市的重組蛋