多肽及蛋白質(zhì)的提取及分離

-.z.關(guān)鍵詞：多肽蛋白質(zhì)提取別離摘要：多肽是由多個(gè)氨基酸縮合形成的，蛋白質(zhì)是由幾十到幾千個(gè)氨基酸分子借助肽鍵和二硫鍵相互連接的多肽鏈，隨肽數(shù)目，氨基酸組成及排列順序不同，蛋白質(zhì)分子呈現(xiàn)三維空間構(gòu)造，并且有生物活性。采取何種別離方法要由所提取的組織材料、所要提取物質(zhì)的性質(zhì)決定。對(duì)蛋白質(zhì)、多肽提取別離常用的方法包括：鹽析法、超濾法、凝膠過(guò)濾法、等電點(diǎn)沉淀法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法等。這些方法常常組合到一起對(duì)特定的物質(zhì)進(jìn)展別離純化。=1\*GB4㈠﹑多肽的提取與別離多肽類化合物廣泛存在于自然界中，其中對(duì)具有一定生物學(xué)活性的多肽的研究，一直是藥物開(kāi)發(fā)的一個(gè)主要方向。生物體的活性多肽主要是從分泌腺組織器官、分泌細(xì)胞和體液中產(chǎn)生或獲得的，生命活動(dòng)中的細(xì)胞分化、神經(jīng)激素遞質(zhì)調(diào)節(jié)、腫瘤病變、免疫調(diào)節(jié)等均與活性多肽密切相關(guān)。隨著現(xiàn)代科技的飛速開(kāi)展，從天然產(chǎn)物中獲得肽類物質(zhì)的手段也不斷得到提高。相1.高效液色譜〔HPLC〕HPLC的出現(xiàn)為肽類物質(zhì)的別離提供了有利的方法手段，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)、多肽的HPLC應(yīng)用與其他化合物相比，在適宜的色譜條件下不僅可以在短時(shí)間完成別離目的，更重要的是HPLC能在制備規(guī)模上生產(chǎn)具有生物活性的多肽。因此在尋找多肽類物質(zhì)別離制備的最正確條件上，不少學(xué)者做了大量的工作。如駿=1\*GB3①等以酪蛋白為原料，采用微生物蛋白酶A水解，其酶解產(chǎn)物為血管緊素轉(zhuǎn)化酶〔ACE〕。2.反相高效液相色譜〔RP-HPLC〕.用反相色譜法別離多肽和蛋白質(zhì)的原理是基于蛋白質(zhì)的疏水性，在不同介質(zhì)條件下，使不同的蛋白質(zhì)得以別離，具有快速高效和高回收的特點(diǎn)，在別離和制備多肽及蛋白質(zhì)上有獨(dú)特的優(yōu)越性。吳亞麗=2\*GB3②等利用反相高效液相色譜法分析降血壓肽AHP的最正確工藝條件。3.疏水作用色譜(Hydrophobicinteractionchromatography,HIC)HIC是利用多肽中含有疏水基團(tuán)，可與固定相之間產(chǎn)生疏水作用而到達(dá)別離分析的目的，其比RP-HPLC具有較少使多肽變性的特點(diǎn)。利用HIC別離生產(chǎn)激素〔GH〕產(chǎn)品的構(gòu)造與活性比RP-HPLC別離的要穩(wěn)定，活性較穩(wěn)定。Geng等利用HIC柱的低變性特點(diǎn)，將大腸桿菌表達(dá)出的經(jīng)鹽酸胍乙啶變性得到人重組干擾素-γ，通過(guò)HIC柱純化、折疊出高生物活性的產(chǎn)品。不同人尿表皮生長(zhǎng)因子〔EGF〕也利用HIC純化到了，均具有良好的生物活性。HIC可將未經(jīng)離子交換柱的樣品純化。而RP-HPLC則不能到達(dá)這一要求。

4.分子排阻色譜(Size-E*clusionchromatography,SEC)SEC是利用多肽分子大小、形狀差異來(lái)別離純化多肽物質(zhì)，特別對(duì)一些較大的聚集態(tài)的分子更為方便。如人重組生長(zhǎng)激素〔hGH)的別離，不同構(gòu)造、構(gòu)型的GH在SEC柱上的別離行為完全不同，從而可別離不同構(gòu)型或在氨基酸序列上有微小差異的變異體。利用SEC研究修飾化的PEG的別離方法，此PEG具有半衰期長(zhǎng)、作用強(qiáng)的特點(diǎn)。一些分子量較大的肽或蛋白均可利用此法別離分析。5.離子交換色譜(Iron-E*changechromatography,IE*C)IE*C可在中性條件下，利用多肽的帶電性不同別離純化具有生物活性的多肽。其可分為陽(yáng)離子柱與陰離子柱兩大類，還有一些新型樹(shù)脂，如大孔型樹(shù)脂、均孔型樹(shù)脂、離子交換纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠樹(shù)脂等。在多肽類物質(zhì)的別離分析研究中，對(duì)多肽的性質(zhì)、洗脫劑、洗脫條件的研究較多，不同的多肽別離條件有所不同，特別是洗脫劑的離子強(qiáng)度、鹽濃度等對(duì)純化影響較大。Wu等報(bào)道利用離子交換柱層析法，探討別離牛碳酸酐酶異構(gòu)體和牛血清白蛋白、雞血清白蛋白酶的提取條件，獲得了有價(jià)值的數(shù)據(jù)供今后此類物質(zhì)別離研究。6.膜蛋白色譜(ChromatographyofMembraneProtein,CMP)CMP+別離強(qiáng)疏水性蛋白、多肽混合物的層析系統(tǒng)，一般有去垢劑〔如SDS〕溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羥基磷灰石為固定相的柱子別離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團(tuán)〔P-端〕，又具有陽(yáng)離子鈣〔C-端〕，與固定相結(jié)合主要決定于膜蛋白的大小、SDS結(jié)合量有關(guān)。利用原子散射法研究cAMP的別離機(jī)制發(fā)現(xiàn)，樣品與SDS結(jié)合后在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而到達(dá)分級(jí)別離的目的。7.高效置換色譜(High-PerformanceDisplacementChromatography,HPDC)HPDC是利用小分子的高效置換劑來(lái)交換色譜柱上的樣品，從而到達(dá)別離目的。它具有別離組分含量較少成分的特性。利用HPDC鑒定別離了低于總量1％組分的活性人重組生長(zhǎng)激素(rHG)。=2\*GB4㈡﹑蛋白質(zhì)的提取與別離蛋白質(zhì)種類很多，性質(zhì)差異很大，既或是同類蛋白質(zhì)，因選用材料不同，使用方法差異也很大，且又處于不同的體系中，因此不可能有一個(gè)固定的程序適用各類蛋白質(zhì)的別離。但多數(shù)別離工作中的關(guān)鍵局部根本手段還是共同的，大局部蛋白質(zhì)均可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機(jī)溶劑中。因此可采用不同溶劑提取、別離蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的提取與別離一般分為4個(gè)階段：①材料的選擇和預(yù)處理，②細(xì)胞的破碎〔有時(shí)需進(jìn)展細(xì)胞器的別離〕，③提取，④別離。原料的選擇原料的選擇主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。從工業(yè)生產(chǎn)角度考慮，注意選含量高、來(lái)源豐富及本錢(qián)低的原料。盡量要新鮮原料。但有時(shí)這幾方面不同時(shí)具備。含量豐富但來(lái)源困難，或含量來(lái)源均不理想。但別離純化操作繁瑣，反而不如含量略低些易于獲得純品者。一般要注意種屬的關(guān)系，如鰹的心肌細(xì)胞色素C較馬的易結(jié)晶，馬的血紅蛋白較牛的易結(jié)晶。不但使用種屬一定的原料，而且要取自同一個(gè)體的原料。可能時(shí)盡量用全年均可采到的原料。對(duì)動(dòng)物生理狀態(tài)間的差異〔如饑餓時(shí)脂肪和糖類相對(duì)減少〕，采收期及產(chǎn)地等因素也要注意。二、前處理1、細(xì)胞的破碎材料選定通常要進(jìn)展處理。要剔除結(jié)締組織及脂肪組織。如不能立即進(jìn)展實(shí)驗(yàn)，則應(yīng)冷凍保存。除了提取及胞細(xì)外成分，對(duì)細(xì)胞及多細(xì)胞生物組織中的蛋白質(zhì)的別離提取均須先將細(xì)胞破碎，使其充分釋放到溶液中。⑴機(jī)械方法主要通過(guò)機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破壞。常用器械有：①高速組織搗碎機(jī)〔轉(zhuǎn)速可達(dá)10000rpm，具高速轉(zhuǎn)動(dòng)的鋒利的刀片〕，宜用于動(dòng)物臟組織的破碎；②玻璃勻漿器〔用兩個(gè)磨砂面相互摩擦，將細(xì)胞磨碎〕，適用于少量材料。⑵物理方法主要通過(guò)各種物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎的方法。Ⅰ反復(fù)凍融法于冷藏庫(kù)或干冰反復(fù)于零下15～20℃使之凍固，然后緩慢地融解，如此反復(fù)操作，使大局部細(xì)胞及細(xì)胞顆粒破壞。由于滲透壓的變化。使結(jié)合水凍結(jié)產(chǎn)生組織的變性，冰片將細(xì)胞膜破碎，使蛋白質(zhì)可溶化，成為粘稠的濃溶液，但脂蛋白凍結(jié)變性。Ⅱ冷熱變替法將材料投入沸水中，于90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷卻，絕大局部細(xì)胞被破壞。Ⅲ超聲波法暴露于9～10千周聲波或10～500千周超聲波所產(chǎn)生的機(jī)械振動(dòng)，只要有設(shè)備該法方便且效果也好，但一次處理量較小。應(yīng)用超聲波處理時(shí)應(yīng)注意防止溶液中氣泡的存在。處理一些超聲波敏感的蛋白質(zhì)酶時(shí)宜慎重。Ⅳ加壓破碎法加一定氣壓或水壓也可使細(xì)胞破遺留房產(chǎn)的繼承碎。⑶化學(xué)及生物化學(xué)方法Ⅰ有機(jī)溶媒法粉碎后的新鮮材料在0℃以下參加5～10倍量的丙酮，迅速攪拌均勻，可破碎細(xì)胞膜，破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合，蛋白質(zhì)一般不變性。Ⅱ自溶法將待破碎的鮮材料在一定pH和適當(dāng)?shù)臏囟认?。利用自身的蛋白酶將?xì)胞破壞，使細(xì)胞含物釋放出來(lái)。比擬穩(wěn)定，變性較難，蛋白質(zhì)不被分解而可溶化。因自溶時(shí)間較長(zhǎng)，不易控制，所以制備活性蛋白質(zhì)時(shí)較少用。Ⅲ酶法與前述的自體融法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去變性蛋白質(zhì)。但值得提出的是溶菌酶處理時(shí)，它能水解構(gòu)成枯草菌等菌體膜的多糖類。2、細(xì)胞器的別離制備*一種生物大分子需要采用細(xì)胞中*一局部的材料，或者為了純化*一特定細(xì)胞器上的生物大分子，防止其他細(xì)胞組分的干擾，細(xì)胞破碎后常將細(xì)胞各組分先行別離，對(duì)于制備一些難度較大需求純度較高的生物大分子是有利的。細(xì)胞器的別離一般采用差速離心法。細(xì)胞經(jīng)過(guò)破碎后，在適當(dāng)介質(zhì)中進(jìn)展差速離心。利用細(xì)胞各組分質(zhì)量大小不同，沉降于離心管不同區(qū)域，別離后即得所需組分。細(xì)胞器的別離制備、介質(zhì)的選擇十分重要。最早使用的介質(zhì)是生理鹽水。因它容易使亞細(xì)胞顆粒發(fā)生聚集作用結(jié)成塊狀，沉淀別離效果不理想，現(xiàn)一般改用蔗糖、Ficoll〔一種蔗糖多聚物〕或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。=3\*CHINESENUM3三﹑提取1.水溶液提取大局部蛋白質(zhì)均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中。因此蛋白質(zhì)的提取一般以水為主。稀鹽溶液和緩沖溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶度大，也是提取蛋白質(zhì)的最常用溶劑。以鹽溶液及緩沖液提取蛋白質(zhì)進(jìn)常注意下面幾個(gè)因素。=1\*GB2⑴鹽濃度等滲鹽溶液尤以0.02～0.05mol/L磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液常用。0.15mol/L氯化鈉溶液應(yīng)用也較多。有時(shí)為了螯合*些金屬離子和解離酶分子與其他雜質(zhì)的靜電結(jié)合，也常使用枸櫞酸鈉緩沖液和焦磷酸鈉緩沖液。有些蛋白質(zhì)在低鹽濃度下濃度低，如脫氧核糖核蛋白質(zhì)需用1mol/L以上氯化鈉液提取?？傊灰苋芙庠谒芤褐卸c細(xì)胞顆粒結(jié)合不太嚴(yán)密的蛋白質(zhì)和酶，細(xì)胞破碎后選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度及PH，一般是不難提取的。只有*些與細(xì)胞顆粒上的脂類物質(zhì)結(jié)合較緊的，需采用有機(jī)溶劑或參加外表活性劑處理等方法提取。

=2\*GB2⑵PH值蛋白質(zhì)提取液的PH值首先應(yīng)保證在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的圍，即選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)。如堿性蛋白質(zhì)則選在偏酸一側(cè)，酸性蛋白質(zhì)選擇偏堿一側(cè)，以增大蛋白質(zhì)的溶解度，提高提取效果。*些蛋白質(zhì)或酶與其分物質(zhì)結(jié)合常以離子鍵形式存在，選擇PH3～6圍對(duì)于別離提取是有利的。=3\*GB2⑶溫度多數(shù)酶的提取溫度在5℃以下。少數(shù)對(duì)溫度耐受性較高的蛋白質(zhì)和酶，可適當(dāng)提高溫度，使雜蛋白變性別離且也有利于提取。如胃蛋白酶等及許多多肽激素類，選擇37～50℃條件下提取，效果比低溫提取更好。2.有機(jī)溶劑提取有機(jī)溶劑提取用于提取蛋白質(zhì)的實(shí)例至今是不多的。但一些和脂結(jié)合較牢或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)，不溶于水、稀鹽或稀堿液中，可用不同比例的有機(jī)溶劑提取。從一些粒線體〔Mitochondria)及微粒體〔Microsome)等含多量脂質(zhì)物質(zhì)中提取蛋白質(zhì)時(shí)，采用Morton的丁醇法效果較好。因丁醇使蛋白質(zhì)的變性較少，親脂性強(qiáng)。=4\*CHINESENUM3四﹑別離純化從破碎材料或細(xì)胞器提出的蛋白質(zhì)是不純的，需進(jìn)一步純化。純化包括將蛋白質(zhì)與非蛋白質(zhì)分開(kāi)。將各種不同的蛋白質(zhì)分開(kāi)。選擇提取條件時(shí)，就要考慮盡量除去非蛋白質(zhì)。一般總是有其它物質(zhì)伴隨混入提取液中。但有些雜質(zhì)〔如脂肪〕以事先除去為宜。先除去便于以后操作。常用有機(jī)溶劑提取除去。對(duì)于異類物質(zhì)，提純蛋白質(zhì)和酶時(shí)常混有核酸或多糖，一般可用專一性酶水解。有機(jī)溶劑抽取及選擇性局部沉淀等方法處理。小分子物質(zhì)常在整個(gè)制備過(guò)程過(guò)屢次液相與固相轉(zhuǎn)化中被別離或最后用透析法除去。而對(duì)同類物質(zhì)如酶與雜蛋白、RNA、DNA以及不同構(gòu)造的蛋白質(zhì)、酶、核酸之間別離，情況則復(fù)雜得多。主要采用的方法有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法，等電點(diǎn)沉淀法、吸附法、結(jié)晶法、電泳法、超離心法及柱層析法等。其中鹽析法、等電點(diǎn)法及結(jié)晶法用于蛋白質(zhì)和酶的提純較多，有機(jī)溶劑抽提和沉淀用于核提純較多，柱層析法、梯度離心法對(duì)蛋白質(zhì)和核酸的提純應(yīng)用十分廣泛。蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互別離主要利用它們之間的各種性質(zhì)的微小差異。諸如分子形狀、分子量大小、電離性質(zhì)、溶解度、生物功能專一性等。蛋白質(zhì)提取液中，除包含所需要的蛋白質(zhì)〔或酶〕外，還含有其它蛋白質(zhì)、多糖、脂類、核酸及肽類等雜質(zhì)。除去的方法有：=1\*GB2⑴核酸沉淀法該法可用核酸沉淀劑和氯化錳、硫酸魚(yú)精蛋白或鏈霉素等。必要時(shí)也可用脫氧核糖核酸酶除去核酸。即在粗勻漿中參加少量DNase,于4℃保溫30～60min，可使DNA降解為足夠小的碎片，以致不影響以后的純化。=2\*GB2⑵醋酸鉛沉淀法利用醋酸鉛沉淀劑除去雜蛋白。因這些沉淀劑也常常使需要的酶〔或蛋白質(zhì)〕緩緩變性而失去活性。所以用這類試劑時(shí)應(yīng)迅速進(jìn)展鹽析，使樣品與這類試劑脫離接觸。=3\*GB2⑶調(diào)pH值或加熱沉淀法利用蛋白質(zhì)酸堿變性性質(zhì)的差異除去雜蛋白。利用蛋白質(zhì)的熱變性的溫度系數(shù)差異?？稍谝欢ǖ腜H下將蛋白提取液加熱到一定的溫度，使對(duì)熱不穩(wěn)定的雜蛋白沉淀而除去。=4\*GB2⑷選擇性變性法利用各種蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的不同，可用選擇性變性法來(lái)除去雜蛋白。例如胰蛋白酶及細(xì)胞色素C等少數(shù)特別穩(wěn)定的酶，甚至可用2.5%三氯醋酸處理，此時(shí)其它雜蛋白均變性而沉淀，而胰蛋白酶和細(xì)胞色素C則仍留在溶液中。=5\*GB2⑸鹽析法小分子物質(zhì)常在整個(gè)制備過(guò)程中屢次液相與固相互轉(zhuǎn)化中被別離或最后用鹽析法除去。透析法是利用溶解度不同的純化方法其原理為：蛋白質(zhì)在低鹽濃度下的溶解度隨鹽液濃度升高而增加〔鹽溶，與離子強(qiáng)度10～1間成比例增加〕。球蛋白當(dāng)鹽濃度不斷上升時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度又以不同程度下降并先后析出〔鹽析〕〔離子強(qiáng)度I2～10〕。這是由于蛋白質(zhì)分子和分子間的電荷的極性基團(tuán)有靜電引力。當(dāng)水中參加少量鹽時(shí)，鹽離子與水分子對(duì)蛋白質(zhì)分子一的極性基團(tuán)的影響，使蛋白質(zhì)在水中溶解度增大。但鹽濃度增加一定程度時(shí)，水的活度降低，蛋白質(zhì)外表的電荷大量被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)相互聚集而沉淀析出。鹽析法是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在一定濃度鹽溶液中溶解度降低程度不同到達(dá)彼此別離的方法。=6\*GB2⑹有機(jī)溶劑別離純化法有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導(dǎo)致溶解度降低。有機(jī)溶劑與水作用能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，使蛋白質(zhì)在一定濃度的有機(jī)溶劑中沉淀析出。常用的有機(jī)溶劑是乙醇和丙酮，由于有機(jī)溶劑的參加易引起變性失活，尤其乙醇和水混合釋放熱量，操作一般宜在低溫下進(jìn)展，且在參加有機(jī)溶劑時(shí)注意攪拌均勻以免局部濃度過(guò)大。用此法所析出的沉淀一般比鹽析法易過(guò)濾或離心沉降。別離后的蛋白質(zhì)沉淀應(yīng)立即用水或緩沖液溶解以降低有機(jī)溶劑的濃度。操作時(shí)的pH值大多數(shù)控制在待沉淀蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近。有機(jī)溶劑在中性鹽存在時(shí)能增加蛋白質(zhì)的溶解度減少變性和提高別離的效果。一般在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)添加中性鹽的濃度在0.05mol左右,過(guò)多不僅消耗有機(jī)溶劑,而且可能導(dǎo)致沉淀不好.沉淀的條件一經(jīng)確定,就必須嚴(yán)格控制,才能得到重復(fù)性結(jié)果.有機(jī)溶劑濃度通常以有機(jī)溶劑和水容積比或用百分濃度素示.故操作條件比鹽析法嚴(yán)格。=7\*GB2⑺凝膠層析屬