實(shí)驗(yàn)七-植物DNA的提取與純度鑒定

植物DNA的提取與純度鑒定謝艷實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)試劑實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)步驟注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庵参锟侱NA提取的原理學(xué)習(xí)和掌握提取、純化高等植物總DNA的方法和步驟核酸的理化性質(zhì)

DNA和RNA都是極性化合物，一般都溶于水或1mol/L的NaCl溶液中，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑。核酸的鈉鹽比游離酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/L。DNA在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。天然狀態(tài)的DNA是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在。

DNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響而不同。DNP在低濃度鹽溶液中，幾乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化鈉中溶解度最低，僅為在水中溶解度的1%，隨著鹽濃度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化鈉中的溶解度很大，比純水高2倍。背景知識(shí)1不同生物須選擇不同DNA提取方法不同生物（植物、動(dòng)物、微生物）的基因組DNA的提取難易度不同：對(duì)于低等生物，如從病毒中提取DNA比較容易，多數(shù)病毒DNA分子量較小，提取時(shí)易保持其結(jié)構(gòu)完整性。從細(xì)菌及高等動(dòng)植物中提取DNA難度大一些。細(xì)菌DNA分子量較大，一般達(dá)2×10道爾頓。因此易被機(jī)械張力剪斷。細(xì)菌DNA，除核DNA外，還有質(zhì)粒DNA等。背景知識(shí)2同一生物不同部位DNA含量不同為了研究DNA分子在生命代謝中的作用，常常需要從同一生物的不同的部位提取DNA。但由于DNA分子在生物體內(nèi)的分布及含量不同，要選擇適當(dāng)?shù)牟牧咸崛NA。

如動(dòng)植物中，小牛胸腺、動(dòng)物肝臟、魚類精子；植物種子的胚中都含有豐富的DNA。

如微生物中，谷氨酸菌體含7%-10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大腸肝菌含9%-10%。背景知識(shí)3

背景知識(shí)4不同種類或同一種類的不同組織因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA時(shí)必須參照文獻(xiàn)和經(jīng)驗(yàn)建立相應(yīng)的提取方法，以獲得可用的DNA大分子，尤其是組織中的多糖和酚類物質(zhì)對(duì)隨后的酶切、PCR反應(yīng)等有較強(qiáng)的抑制作用，因此用富含這類物質(zhì)的材料提取基因組DNA時(shí)，應(yīng)考慮除去多糖和酚類物質(zhì)。提醒真核細(xì)胞基因組提取的方法濃鹽法離子去污劑法苯酚抽提法水抽提法CTAB法DNA提取基本方法：1.機(jī)械法破碎細(xì)胞2.去除蛋白質(zhì)，酚類等細(xì)胞內(nèi)雜質(zhì)污染3.純化ＤＮＡCATB法的簡析冷凍和研磨，使細(xì)胞破裂加入CTAB提取緩沖液，溶解DNA氯仿/異戊醇抽提，去除蛋白加入無水乙醇/異丙醇，沉淀DNA酒精沖洗，去除剩余雜質(zhì)RNase消化，去除RNA無菌水/TE溶解，保存DNACTAB法實(shí)驗(yàn)原理離子型表面活性劑如十六烷基三甲基溴化銨(hexadyltrimethylammomumbromide，簡稱為CTAB)、十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate，簡稱SDS)等可以有效裂解植物細(xì)胞壁，且與DNA形成可溶于高鹽溶液的復(fù)合物，當(dāng)降低鹽濃度時(shí)DNA又可沉淀析出，從而與蛋白質(zhì)及多糖等分離。

具體CTAB、SDS等離子型表面活性劑能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。再加入苯酚/氯仿等有機(jī)溶劑，使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強(qiáng)，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細(xì)胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入異丙醇/無水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE或水溶液中，即得植物總DNA溶液。實(shí)驗(yàn)材料煙草嫩葉實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備研缽、研棒、水浴鍋、高速冷凍離心機(jī)移液器及配套吸頭、50ml＆10ml量筒1.5ml離心管

、

50mL離心管實(shí)驗(yàn)試劑及其配置

CTAB抽提液（要求配100mL）實(shí)驗(yàn)試劑及其配置21MpH8.0Tris·Cl（已有不用配置）121gTris堿溶于800mLddH2O，濃HCl調(diào)pH至8.0，補(bǔ)ddH2O定容至1000mL。注意：Tris緩沖液的pH值隨溫度變化較大，每1℃可引起大約0.028pH單位的變化。實(shí)驗(yàn)試劑及其配置0.5MpH8.0EDTA(乙二胺四乙酸

)

（要求配100mL）

29.22gEDTA溶于140mL水中，用固體NaOH調(diào)pH至8.0，補(bǔ)ddH2O定容至200mL。

作用：EDTA螯合二價(jià)離子，抑制DNA酶的活性，保護(hù)DNA實(shí)驗(yàn)試劑及其配置CTAB/NaCl(10%CTAB,0.7MNaCl)（要求配50mL）CTAB20gNaCl8.2g加入160mLddH2O，加熱至65℃溶解，補(bǔ)ddH2O定容至200mL，高壓滅菌。注意：此溶液很粘稠，使用時(shí)需加熱至65℃。實(shí)驗(yàn)試劑及其配置53MNaACpH5.2（要求配50mL）81.62gNaAC·3H2O/49.22g無水NaAC溶于160mLddH2O中，冰乙酸調(diào)pH至5.2，定容至200mL，高壓滅菌。作用：Na離子中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，使沉淀更完全。

實(shí)驗(yàn)試劑及其配置6高鹽TE溶液（pH8.0）

（要求配50mL）作用：DNA保存更穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)試劑及其配置724：1的氯仿（三氯甲烷）/異戊醇（要求配50mL）氯仿變性蛋白質(zhì)，異戊醇消除氣泡注意：混勻過程要輕柔，以免DNA斷裂。

875%乙醇

（要求配50mL）實(shí)驗(yàn)步驟（1）1、CTAB抽提液65℃預(yù)熱；異丙醇－20℃預(yù)冷；2、稱取新鮮煙草葉片1克，加液氮研磨，共加3-4次液氮；注意：(1)研磨時(shí)應(yīng)注意防止液氮凍傷，戴上一次性PE手套；(2)新鮮的本氏煙較易磨碎，加液氮3-4次；雜草樣品特別是不新鮮的雜草樣品常較難磨，加液氮4-5次。一般加液氮4次；(3)加液氮時(shí)動(dòng)作輕柔，否則液氮會(huì)將樣品沖出而造成樣品損失；(4)磨樣過程中，樣品不能溶化，樣品研磨得越細(xì)越好；(5)每換一個(gè)新樣品，要換一次PE手套。實(shí)驗(yàn)步驟（2）3、最后一次加液氮磨樣后，立即加入預(yù)熱的CTAB抽提液，每克葉片加入8mLCTAB抽提液，再加入160

L2－巰基乙醇（2-Me）（終濃度2％（v/v））。繼續(xù)研磨待CTAB抽提液溶化后，將研磨液轉(zhuǎn)入50mL離心管；4、65℃水浴鍋溫浴0.5-1小時(shí)，每10-20分鐘搖動(dòng)一次離心管；同時(shí)65℃預(yù)熱CTAB/NaCl；注意：離心管蓋子應(yīng)輕輕搭在管口，千萬不能蓋緊，以防加熱使蓋子沖出，最好離心管壁和蓋子同時(shí)做好標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)步驟（3）5、加入等體積（