雙酚a對(duì)微小小環(huán)藻的急性毒性效應(yīng)

雙酚a對(duì)微小小環(huán)藻的急性毒性效應(yīng)

雙酚a（bipsiea）的學(xué)名是氨基二苯基丙烯酸酯（c15h16a2）。這是生產(chǎn)環(huán)氧樹(shù)脂（ep）樹(shù)脂、酚醛樹(shù)脂、可塑性聚吡咯烷、抗氧劑和氯氯醚（pvc）穩(wěn)定性的前體材料。廣泛應(yīng)用于會(huì)計(jì)核算行業(yè)，如包裝甲、袋裝甲、牙科填充劑、嬰兒瓶等。雙酚A具有雌激素活性,可干擾人體內(nèi)分泌系統(tǒng)。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局1997年公布的內(nèi)分泌干擾物名單中雙酚A被列為可疑內(nèi)分泌干擾物。1998年日本在河川、湖泊、地下水及封閉性海域等調(diào)查地點(diǎn)檢出頻率較高的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)中就包括雙酚A。當(dāng)水體中雙酚A濃度達(dá)到1μg/L,即可引起腹足類Nucellalapillus雄性個(gè)體雌性化。隨著工業(yè)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,雙酚A的生產(chǎn)和使用大量增加,全球雙酚A使用量已超過(guò)200萬(wàn)t,其最終歸宿是由各種途徑進(jìn)入水體,并可通過(guò)食物鏈作用在水生生態(tài)系統(tǒng)中進(jìn)行傳遞,對(duì)水生生物產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾作用。目前,國(guó)內(nèi)外雙酚A對(duì)水生生物的毒理和毒性作用研究不多。深圳灣福田紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)是我國(guó)國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū),生物多樣性十分豐富,但其水域中雙酚A含量已達(dá)對(duì)水生生物有所影響的濃度。本文通過(guò)研究雙酚A對(duì)紅樹(shù)林優(yōu)勢(shì)藻種的生態(tài)毒理效應(yīng),來(lái)了解雙酚A對(duì)紅樹(shù)林水生生物的潛在危害。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備雙酚A購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司,以甲醇為溶劑配成10000mg/L的母液,實(shí)驗(yàn)時(shí)再以甲醇稀釋成所需濃度。實(shí)驗(yàn)中所用儀器有顯微鏡(OLYMPUSCX31)、制冰機(jī)(SCOTSMANAF100)、分光光度計(jì)(HITACHIU-1800)、高速離心機(jī)(AnkeTGL-16G)、數(shù)碼相機(jī)(NIKONCOOLPLAX4500)、MGC-300B型光照培養(yǎng)箱、WSZ-200A型搖床、XW-80A型旋渦混合器、血球計(jì)數(shù)板、高壓滅菌鍋、三角瓶等。1.2藻種的生長(zhǎng)caspia從福田紅樹(shù)林近岸水域中分離純化優(yōu)勢(shì)藻種微小小環(huán)藻(Cyclotellacaspia),在無(wú)菌條件下以人工海水配制的f/2培養(yǎng)基于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)作為本研究實(shí)驗(yàn)藻種。培養(yǎng)條件為:溫度26℃;光強(qiáng)4000lx,光暗比12h∶12h。藻細(xì)胞初始接種密度為1.32×104個(gè)/mL。1.3海藻密度的測(cè)定移取0.1mL藻液于血球計(jì)數(shù)板上,在100倍顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。1.4不可見(jiàn)效應(yīng)濃度以不同濃度甲醇處理微小小環(huán)藻,96h后在顯微鏡下計(jì)數(shù)。與對(duì)照組無(wú)顯著性差異的最高濃度可定為甲醇的不可見(jiàn)效應(yīng)濃度(noobservedeffectconcentration,NOEC)。1.5生長(zhǎng)抑制率測(cè)定根據(jù)生長(zhǎng)速率μ公式計(jì)算藻細(xì)胞生長(zhǎng)速率,根據(jù)Iμi公式計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。將雙酚A濃度與生長(zhǎng)抑制率進(jìn)行一元線性回歸,得到雙酚A對(duì)微小小環(huán)藻的半效應(yīng)濃度(EC50)。1.6測(cè)定了藍(lán)色信號(hào)的含量采用ISO10260乙醇提取法進(jìn)行葉綠素a含量測(cè)定。1.7內(nèi)膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的破壞逆境脅迫下生物體內(nèi)O2-·、H2O2、·OH等活性氧會(huì)大量增加,它可引起質(zhì)膜和內(nèi)膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的破壞和功能的喪失,甚至導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。生物體在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中發(fā)展了抗氧化防御系統(tǒng),SOD是抗氧化防御系統(tǒng)中清除超氧陰離子自由基(O??22-?)的關(guān)鍵酶,SOD活性可作為解釋生物對(duì)逆境脅迫耐受力和污染物對(duì)生物致毒機(jī)理的指標(biāo)。(1)粗酶溶液的制備離心法收集藻細(xì)胞,加入磷酸緩沖液和少量石英砂在冰浴中研磨,勻漿液冷凍離心,上清液即為粗酶提取液。(2)可溶性固形物含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定,以小牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)氮藍(lán)四唑nbt的光化學(xué)還原反應(yīng)法采用Beauchamp建立,Bewley等改進(jìn)的氮藍(lán)四唑(NBT)光化學(xué)還原反應(yīng)法測(cè)定,以單位時(shí)間內(nèi)NBT還原反應(yīng)速度被SOD抑制50%所需酶量為一個(gè)酶活力單位(u·mg-1·min-1)。1.8細(xì)胞形態(tài)的觀察顯微鏡(400×)下觀察藻細(xì)胞形態(tài)的變化,用測(cè)微尺測(cè)量藻細(xì)胞環(huán)面與殼面的尺寸,并進(jìn)行顯微拍照記錄藻在各濃度雙酚A作用下的形態(tài)變化。2結(jié)果與討論2.1小環(huán)藻的急性毒性實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到甲醇NOEC值為0.5%,雙酚A96h-EC50值為8.30mg/L。以96h-EC50值為中心濃度,設(shè)4,6,8,10和12mg/L雙酚A進(jìn)行微小小環(huán)藻急性毒性實(shí)驗(yàn)。微小小環(huán)藻的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。由圖1可以看出,雙酚A對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生不同程度的抑制作用,且抑制程度與雙酚A濃度顯示出明顯的劑量-效應(yīng)相關(guān)性。4~6mg/L雙酚A使藻細(xì)胞增長(zhǎng)較對(duì)照組緩慢,生長(zhǎng)周期延長(zhǎng);8~10mg/L雙酚A對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯抑制作用,并使其生長(zhǎng)周期縮短;當(dāng)雙酚A濃度高于10mg/L時(shí),藻細(xì)胞幾乎停止生長(zhǎng)。2.2藻細(xì)胞密度和葉綠素a含量的變化如圖2所示,隨著雙酚A濃度的增大,微小小環(huán)藻的葉綠素a含量逐漸降低,并且其含量變化與藻細(xì)胞密度變化呈一定相關(guān)。葉綠素a含量降低可能與活性氧的傷害有關(guān)。在雙酚A脅迫下,葉綠體產(chǎn)生的有害活性氧不能及時(shí)清除,使葉綠體膜受到氧化,基質(zhì)外漏,葉綠體代謝紊亂功能失常,從而導(dǎo)致葉綠素a含量降低。2.3藻細(xì)胞抗氧化酶活性不同濃度雙酚A脅迫下,微小小環(huán)藻SOD活性變化具有一定規(guī)律性(見(jiàn)圖3)。對(duì)照組SOD活性處于最低水平并且保持穩(wěn)定;處理組SOD活性基本呈現(xiàn)出先上升,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)再下降并趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。不同濃度雙酚A對(duì)藻SOD活性的影響主要表現(xiàn)出從誘導(dǎo)到抑制的動(dòng)態(tài)過(guò)程,這一現(xiàn)象與劉志禮等在研究NaCl脅迫對(duì)螺旋藻生長(zhǎng)及抗氧化酶活性的影響所得結(jié)果相似。4d時(shí),隨雙酚A濃度增加,藻細(xì)胞SOD受到誘導(dǎo)活性逐漸升高以提高超氧陰離子自由基的清除能力。繼續(xù)增大雙酚A濃度,SOD活性受到抑制,但仍較對(duì)照組高。10mg/L處理組SOD活性處于最高水平,較對(duì)照組升高了362%。4、6、8、12mg/L處理組SOD活性分別較對(duì)照組升高125%、166%、325%、263%。8d時(shí),10mg/L處理組SOD活性仍處于最高水平,較對(duì)照組高出300%。然而12mg/L處理組SOD活性大幅度下降,比對(duì)照組還低。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),低濃度處理組藻細(xì)胞中活性氧得到有效地清除,故其SOD活性降到了對(duì)照組水平;高濃度處理組SOD活性大幅降低可能是由于藻細(xì)胞中活性氧產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)受到嚴(yán)重破壞,過(guò)量活性氧對(duì)SOD活性產(chǎn)生抑制。12mg/L處理組中,藻細(xì)胞內(nèi)活性氧已嚴(yán)重超過(guò)了抗氧化防御系統(tǒng)的處理能力,完全抑制其SOD活性,故在后3次監(jiān)測(cè)中均測(cè)不到該處理組SOD活性。2.4小小環(huán)藻細(xì)胞形態(tài)的影響正常生長(zhǎng)情況下,微小小環(huán)藻呈短圓柱體狀,環(huán)面為四方形(長(zhǎng)12.25μm,寬9.80μm),殼面為圓形(直徑9.80μm)。不同濃度雙酚A對(duì)微小小環(huán)藻細(xì)胞形態(tài)的影響見(jiàn)圖4。由圖4可看出,對(duì)照組中微小小環(huán)藻處于正常分裂狀態(tài),其葉綠體較多地環(huán)繞細(xì)胞壁分布。4和6mg/L處理組(b,c)中藻細(xì)胞形態(tài)變化不大。8和10mg/L處理組(d,e)中藻細(xì)胞生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制,細(xì)胞器結(jié)構(gòu)受到破壞,細(xì)胞分裂增殖速度減慢,出現(xiàn)了很多明顯拉長(zhǎng)的藻細(xì)胞。12mg/L處理組(f)中藻細(xì)胞幾乎停止生長(zhǎng),細(xì)胞顏色變淡,部分細(xì)胞還出現(xiàn)較大的空白區(qū)和大小不一的球狀顆粒,這些球狀顆粒可能是過(guò)氧化物酶體或脂肪粒。3藻細(xì)胞抗氧化活性的變化(1)雙酚A對(duì)微小小環(huán)藻的96h-EC50為8.30mg/L,屬于高毒類有機(jī)化合物。(2)雙酚A對(duì)藻生長(zhǎng)的抑制程度隨其濃度增加而加強(qiáng),濃度超過(guò)10mg/L時(shí),微小小環(huán)藻幾乎完全停止生長(zhǎng)。(3)藻細(xì)胞葉綠素a含量隨雙酚A濃度的增加而下降,表現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。(4)藻SOD活性隨著雙酚A濃度和作用時(shí)間發(fā)生明顯的變化,總體表現(xiàn)為從誘導(dǎo)到抑制的動(dòng)態(tài)過(guò)程。藻生長(zhǎng)初期,4~10mg/L雙酚A使藻細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)被誘導(dǎo),SOD活性表現(xiàn)出應(yīng)激性上升并具有較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系;12mg/L雙酚A則明顯抑制其SOD活性。由此可見(jiàn),SOD活性可從分子水平上反應(yīng)雙酚A對(duì)藻細(xì)胞的早期影響,是較靈敏的生化指標(biāo)之一,可做為生物標(biāo)志物(biomarker)用于監(jiān)測(cè)雙酚A對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的影響。(5)不同濃度的雙酚A對(duì)藻細(xì)胞