蛋白質(zhì)的分離純化和表征課件

第七章蛋白質(zhì)的分離、純化和表征2009.7.290第七章蛋白質(zhì)的分離、純化和表征2009.7.2901主要介紹蛋白質(zhì)的分離、純化的一般原則和方法分離和純化蛋白質(zhì)的各種方法主要是利用蛋白質(zhì)之間各種特性的差異，包括分子的大小和形狀、酸堿性質(zhì)、溶解度、吸附性質(zhì)和對配體分子的特異生物學(xué)親和力第7章蛋白質(zhì)的分離、純化和表征主要介紹蛋白質(zhì)的分離、純化的一般原則和方法第7章蛋白質(zhì)的2三、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定

一、蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)

二、蛋白質(zhì)的分離純化四、蛋白質(zhì)的含量測定與純度鑒定三、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定一、蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)

二、蛋3

一、蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)

1、兩性解離性質(zhì)及等電點(diǎn)2、蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)3、蛋白質(zhì)的沉淀4、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性5、蛋白質(zhì)的紫外吸收特性6、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)一、蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)

1、兩性解離性質(zhì)及等電點(diǎn)41.蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。

1.蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可5對某一種蛋白質(zhì)來說，在某一pH，它所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等，也即凈電荷為零，這一pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)；蛋白質(zhì)等電點(diǎn)在一定程度上決定于介質(zhì)中離子的組成對某一種蛋白質(zhì)來說，在某一pH，它所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相6沒有其他鹽類干擾時，蛋白質(zhì)質(zhì)子供體基團(tuán)解離出來的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體基團(tuán)結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時的pH稱為等離子點(diǎn)（isoionicpoint）等離子點(diǎn)是蛋白質(zhì)的一個特征常數(shù)沒有其他鹽類干擾時，蛋白質(zhì)質(zhì)子供體基團(tuán)解離出來的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子7電泳沉淀電泳沉淀8膠體溶液具有布朗運(yùn)動、丁達(dá)爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象、不能透過半透膜以及具有吸附能力等特性蛋白質(zhì)是高分子化合物，由于分子量大，它在水溶液中所形成的顆粒直徑約為1－100nm。2.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)膠體溶液具有布朗運(yùn)動、丁達(dá)爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象、不能透過半透膜以92.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)*蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜（0.3-0.5g/gPr)表面分布著大量極性氨基酸殘基，對水有很高的親和性，通過水合作用在蛋白質(zhì)顆粒外面形成一層水化膜這些顆粒帶有電荷2.蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)*蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素表面分布著大量10+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白113.蛋白質(zhì)的沉淀如果加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等電點(diǎn)狀態(tài)或失去水化層（消除相同電荷，除去水膜），蛋白質(zhì)膠體溶液就不再穩(wěn)定并將產(chǎn)生沉淀。

沉淀:不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)從溶液中析出結(jié)絮：變性蛋白質(zhì)的絮狀沉淀，沉淀可溶于強(qiáng)酸、強(qiáng)堿凝固：沉淀結(jié)塊，結(jié)塊不溶于強(qiáng)酸強(qiáng)堿盡量采用沉淀方式，保留蛋白質(zhì)的活性3.蛋白質(zhì)的沉淀如果加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等12+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白13沉淀方法類別:1、高濃度中性鹽（鹽析、鹽溶）2、酸鹼（等電點(diǎn)沉淀）3、有機(jī)溶劑沉淀4、重金屬鹽類沉淀5、生物堿試劑和某些酸類沉淀6、加熱變性沉淀沉淀的蛋白質(zhì)不一定變性變性蛋白質(zhì)不一定沉淀，但結(jié)絮、凝固是變性深刻化體現(xiàn)變性沉淀沉淀方法類別:沉淀的蛋白質(zhì)不一定變性變性沉淀14某些物理或化學(xué)因素，能夠破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)理化性質(zhì)改變并導(dǎo)致其生理活性喪失。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性4.蛋白質(zhì)變性與復(fù)性

結(jié)構(gòu)功能高級結(jié)構(gòu)破壞生理功能喪失某些物理或化學(xué)因素，能夠破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，引起蛋白質(zhì)154.蛋白質(zhì)變性與復(fù)性

變性的可逆性可逆變性：除去變性因素，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)可以恢復(fù)原狀。不可逆變性：除去變性因素，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)不能恢復(fù)原狀。復(fù)性（renaturation）蛋白質(zhì)的變性作用如果不過于劇烈，則是一種可逆過程胃蛋白酶加熱至80℃－90℃時，變性、無消化蛋白質(zhì)的能力，失去溶解性。如將溫度下降到37℃，就復(fù)性，又恢復(fù)溶解性和消化蛋白質(zhì)的能力。但如變性時間加長，條件加劇，變性程度加深，就成為不可逆變性。4.蛋白質(zhì)變性與復(fù)性

變性的可逆性復(fù)性（renatura165.蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜

蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)紫外光區(qū)（200-230nm）有較大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用這一特性對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量鑒定。測定范圍：0.1～0.5mg/ml5.蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)紫外光區(qū)（200-176.蛋白質(zhì)主要呈色反應(yīng)

雙縮脲反應(yīng)酚試劑法

→蛋白質(zhì)定量、定性

茚三酮反應(yīng)測定常用方法考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)

6.蛋白質(zhì)主要呈色反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)18雙縮脲反應(yīng)

蛋白質(zhì)在堿性溶液中也能與硫酸銅發(fā)生相同反應(yīng)，產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物紅紫色絡(luò)合物(鹼性溶液)Cu2+CuSO4180℃雙縮脲反應(yīng)蛋白質(zhì)在堿性溶液中也能與硫酸銅發(fā)生相同反應(yīng)19Lorry法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。

Folin—酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測定范圍是20~250mg。Folin－酚試劑法Lorry法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種20茚三酮反應(yīng)(ninhydrinreaction)

蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。茚三酮反應(yīng)(ninhydrinreaction)21操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，可測定微克級蛋白質(zhì)含量考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌鞍踪|(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定?？捡R斯亮藍(lán)法(Bradford法

)1976年Bradford建立操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，可測定微克級蛋白質(zhì)含量考馬斯亮藍(lán)22(三)鹽析和有機(jī)溶劑沉淀(四)電泳(一)透析和超濾(五)層析溶解度兩性解離性質(zhì)分子大?。z體性質(zhì)）吸附性質(zhì)對配體分子的生物學(xué)親和力(二)凝膠過濾分子大小2009.7.290(三)鹽析和有機(jī)溶劑沉淀(四)電泳(一)透析和超23二、蛋白質(zhì)的分離純化(一)根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同(二)利用溶解度差別(三)根據(jù)電荷不同(四)利用選擇性吸附透析和超過濾、密度梯度（區(qū)帶）離心、凝膠過濾電泳、離子交換層析羥磷灰石層析、疏水作用層析等電點(diǎn)沉淀和pH控制、鹽溶和鹽析、有機(jī)溶劑分級分離法、(五)利用對配體的特異生物學(xué)親和力二、蛋白質(zhì)的分離純化(一)根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同(二)利用24蛋白質(zhì)純化的總目標(biāo)是增加制品的純度（purity）或比活（specificactivity），以增加單位蛋白質(zhì)重量中所要蛋白質(zhì)的含量或生物活性（以活力單位數(shù)/克蛋白質(zhì)表示）。設(shè)法除去變性的和不要的蛋白質(zhì)，并且希望所得蛋白質(zhì)的產(chǎn)量達(dá)到最高值。分離純化某一特定蛋白質(zhì)的一般程序可以分為前處理、粗分級分離和細(xì)分級分離3步。目標(biāo)與原則蛋白質(zhì)純化的總目標(biāo)是增加制品的純度（purity）或比活25（一）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同磁力攪拌器磁棒透析液蛋白質(zhì)溶液半透膜袋1、透析和超濾利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)分開。玻璃紙、火棉紙燈<1nm（一）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同磁力攪拌器磁棒透析液蛋白質(zhì)溶液半26透析工作圖半透膜原理滲透壓的平衡透析工作圖半透膜原理滲透壓的平衡27圖7-6利用壓力和離心力的超過濾濾膜抽氣施加外力利用壓力或離心力強(qiáng)行使水和小分子雜質(zhì)通過超濾膜(一種半透膜)除去，而蛋白質(zhì)留在膜上，稱為超過濾(超濾)。圖7-6利用壓力和離心力的超過濾濾膜抽氣施加外力利用28解決的是有或無的問題，未能解決大小的問題！解決的是有或無的問題，未能解決大小的問題！292.密度梯度（區(qū)帶）離心介質(zhì)：蔗糖、氯化銫、聚蔗糖（Ficoll)、葡聚糖等滴加樣品4%8%12%16%20%2.密度梯度（區(qū)帶）離心介質(zhì)：蔗糖、氯化銫、聚蔗糖（Fico303、凝膠過濾——分子排阻根據(jù)分子大小分離混合物最有效的方法之一多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（微孔）交聯(lián)度（孔度）凝膠珠（顆粒）3、凝膠過濾——分子排阻根據(jù)分子大小分離混合物最有效的方法之31凝膠的交聯(lián)度或孔度（網(wǎng)孔大?。Q定了凝膠的分級分離范圍（fractionationrange）SephadexG-50排阻極限是30000排阻極限（exc1usionlimit）來表示分級分離范圍的上限，它被定義為不能擴(kuò)散進(jìn)入凝膠珠微孔的最小分子的MrSephadexG-75

排阻極限是70000凝膠的交聯(lián)度或孔度（網(wǎng)孔大小）決定了凝膠的分級分離范圍（fr32分子篩層析分子篩層析33按照分子量大小分離開按照分子量大小分離開341、等電點(diǎn)沉淀和pH控制(二)利用溶解度差別溶解度（蛋白mg/ml）1、等電點(diǎn)沉淀和pH控制(二)利用溶解度差別溶解度（蛋白mg35在等電時，中性鹽（K2SO4)對一氧化碳血紅蛋白的溶解度的影響離子強(qiáng)度（I）Log（溶解度）鹽溶：中性鹽低濃度時，可以增加蛋白質(zhì)的溶解度。鹽析：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液的離子強(qiáng)度增加到一定強(qiáng)度后，很多蛋白質(zhì)可以從溶液中沉淀下來。2、鹽溶和鹽析在等電時，中性鹽（K2SO4)對一氧化碳血紅蛋白的溶解度的影36常用的中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉作用原理:降低水的活度WaterActivity，水化層脫水，表面疏水基團(tuán)暴露并相互作用引起聚集特點(diǎn)：不破壞蛋白質(zhì)的構(gòu)象，蛋白質(zhì)不發(fā)生變性。常用的中性鹽：硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉作用原理:降低水的活度W373、有機(jī)溶劑沉淀法降低溶液的介電常數(shù)：使蛋白質(zhì)表面可解離基團(tuán)的離子化程度減弱，有機(jī)溶劑脫去水化層，致蛋白質(zhì)分子聚集而沉淀。必須在低溫下操作注意事項:盡量縮短處理的時間及時將蛋白質(zhì)中殘存的有機(jī)溶劑除去甲醇、乙醇、丙酮缺點(diǎn)：原理常用有機(jī)溶劑:常會使蛋白質(zhì)變性介電常數(shù)大的溶劑，有利于離子對的解離。

80－303、有機(jī)溶劑沉淀法降低溶液的介電常數(shù)：使蛋白質(zhì)表面可解離基團(tuán)38（三）根據(jù)電荷不同1、電泳：帶電顆粒在電場中向著所帶電荷相反方向移動稱為電泳。（三）根據(jù)電荷不同1、電泳：帶電顆粒在電場中向著所帶電荷相39影響泳動速度的因素：

A、電荷多少B、分子形狀大小C、電場強(qiáng)度影響泳動速度的因素：40經(jīng)典：自由電泳或稱移動界面電泳樣品經(jīng)典：自由電泳或稱移動界面電泳樣品41區(qū)帶電泳根據(jù)支持物的物理性質(zhì)分為：①濾紙電泳和薄膜電泳②粉末電泳：淀粉、纖維素功硅膠粉等③細(xì)絲電泳：人造絲、尼龍絲等細(xì)絲支持物上的電泳④凝膠電泳：最常用的有聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶

區(qū)帶電泳根據(jù)支持物的物理性質(zhì)分為：指有支持介質(zhì)的電泳，待42水平式平板凝膠電泳水平式平板凝膠電泳43垂直式平板凝膠電泳垂直式平板凝膠電泳44SDS-凝膠電泳譜在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入十二烷基硫酸鈉SDS）和少量巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的相對分子質(zhì)量，而與原來所帶的電荷和分子形狀無關(guān)測定單體蛋白質(zhì)分子量SDS-凝膠電泳譜在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入十二烷基硫酸鈉S45等電聚焦（IEF）電泳蛋白質(zhì)混合物是在具有pH梯度的介質(zhì)（如濃蔗糖溶液）中進(jìn)行的pH梯度制作一般利用兩性電解質(zhì)在外電場作用下，自然形成pH梯度。等電聚焦（IEF）電泳蛋白質(zhì)混合物是在具有pH梯度的介質(zhì)（如46毛細(xì)管電泳電泳是在微內(nèi)徑管(一般為50um內(nèi)徑和300um外徑)中進(jìn)行記錄儀毛細(xì)管毛細(xì)管電泳電泳是在微內(nèi)徑管(一般為50um內(nèi)徑和300um外472、離子交換層析

陽離子交換層析陰離子交換層析2、離子交換層析48帶正電荷多蛋白緊密結(jié)合帶負(fù)電荷多蛋白流過層析柱陽離子交換樹脂工作示意圖帶正電荷多蛋白緊密結(jié)合帶負(fù)電荷多蛋白流過層析柱陽離子交換樹脂49蛋白質(zhì)的分離純化和表征課件50蛋白質(zhì)的分離純化和表征課件51(四)利用選擇性吸附1．羥磷灰石層析吸附劑羥磷灰石（hydroxylapatlde）即結(jié)晶磷酸鈣[Ca10(PO4)6(OH)2]它用于分離蛋白質(zhì)或核酸羥磷灰石層析最重要的用途之一是把單鏈DNA和雙鏈DNA分開

2．疏水作用層析疏水吸附劑有苯基瓊脂糖（phenyl-sephadex），辛基瓊脂糖（octa-sephadex）等(四)利用選擇性吸附1．羥磷灰石層析52親和層析工作示意圖蛋白質(zhì)載體介質(zhì)配體結(jié)合洗脫洗脫介質(zhì)(五)利用對配體的特異生物學(xué)親和力親和層析工作示意圖蛋白質(zhì)載體介質(zhì)配體結(jié)合洗脫洗脫介質(zhì)(五)利53蛋白質(zhì)的分離純化和表征課件54附：高效液相層析和快速蛋白液相層析反相HPLC：固定相是非級性的，而流動相是相對極性的固定相——由烷基硅烷與硅石通過化學(xué)反應(yīng)連接而成快速蛋白液相層析附：高效液相層析和快速蛋白液相層析反相HPLC：固定相是非級55三、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定

相對分子質(zhì)量根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量如：肌紅蛋白的含鐵量為0.335%，計算肌紅蛋白的最低分子量。三、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量SDS56凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量利用凝膠過濾（gelfiltration）可以把蛋白質(zhì)混合物按分子的大小分離開來。這種方法比較簡便，不要求復(fù)雜的儀器就能相當(dāng)精確地測出蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量如果某種蛋白質(zhì)與一理想的非水化球體具有相同的過柱速度即相同的洗脫體積，則認(rèn)為這種蛋白質(zhì)具有與此球體相同的半徑，稱蛋白質(zhì)分子的斯托克半徑凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量利用凝膠過濾（gelfiltr571966年Andrews根據(jù)他的實驗結(jié)果提出了一個經(jīng)驗公式VeV0=a-blogMr移項上式得logMr=ab1bVeV0-洗脫體積外水體積內(nèi)水體積1966年Andrews根據(jù)他的實驗結(jié)果提出了一個經(jīng)驗公式58圖7-4洗脫體積與相對分子質(zhì)量的關(guān)系VelogMrlogMr=ab1bVeV0-圖7-4洗脫體積與相對分子質(zhì)量的關(guān)系VelogMrlog59洗脫曲線logMr洗脫曲線logMr60SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定

相對分子質(zhì)量電泳時，大分子的遷移率決定于它所帶的凈電荷以及分子大小和形狀等因素SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳如果在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）和少量巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率（e1ectrophoreticmobility）主要取決于它的相對分子質(zhì)量，而與原來所帶的電荷和分子形狀無關(guān)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定

相對分子質(zhì)量電泳時，大分子的61SDS在一定條件下，SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比為1.4克SDS／l克蛋白質(zhì)，相當(dāng)于每兩個氨基酸殘基結(jié)合一個SDS分子。SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合：第一，由于SDS是陰離子，使多肽鏈覆蓋上相同密度的負(fù)電荷，該電荷量遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，結(jié)果所有的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合體，電泳時都以同樣的電荷／蛋白質(zhì)比向正極移動。第二，改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合體在水溶液中的形狀被認(rèn)為是近似雪茄煙形的長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合體的短軸長度（直徑）都是一樣的約為1.8nm，而長軸長度則隨蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量成正比例變化SDS在一定條件下，SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比為62電泳遷移率與多肽鏈分子量的對數(shù)有下列關(guān)系a和b、K1和K2都是常數(shù)以幾種相對分子量已知的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Mr的對數(shù)值對μR作圖，根據(jù)待測樣品的μR，從其標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出分子量logMr=a-bμR

或logMr=K1–K2μR

μR=樣品遷移距離前沿（染料）遷移距離電泳遷移率與多肽鏈分子量的對數(shù)有下列關(guān)系a和b、K1和63SDS-凝膠電泳譜SDS-凝膠電泳譜64四、蛋白質(zhì)的含量測定與純度鑒定（一）蛋白質(zhì)含量測定1.凱氏定氮法樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。四、蛋白質(zhì)的含量測定與純度鑒定（一）蛋白質(zhì)含量測定65若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：

CH2COOH

|

+3H2SO4

2CO2+3SO2+4H2O+NH3

(1)

NH2

2NH3+H2SO4

(NH4)2SO4

(2)

(NH4)2SO4+2NaOH

2H2O+Na2SO4+2NH3

(3)

若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：66反應(yīng)（1）、(2)在凱氏瓶內(nèi)完成，反應(yīng)（3）在凱氏蒸餾裝置中進(jìn)行。為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點(diǎn)。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強(qiáng)酸。計算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6．25即得。反應(yīng)（1）、(2)在凱氏瓶內(nèi)完成，反應(yīng)（3）在凱氏蒸餾裝672.雙縮脲法（Biuret法）

雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。于540nm處進(jìn)行比色測定。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。2.雙縮脲法（Biuret法）683.Folin—酚試劑法（Lowry法）

Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。

Folin—酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測定范圍是20~250mg。3.Folin—酚試劑法（Lowry法）694.考馬斯亮蘭法（Bradford法）

考馬