赤雹根總皂苷對(duì)fca誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠腫瘤壞死因子-表達(dá)的影響

赤雹根總皂苷對(duì)fca誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠腫瘤壞死因子-表達(dá)的影響

赤雨根具有苦味性寒、活血、消除充血、清熱解毒的功效。這是遼寧省常見的滿族藥品。它經(jīng)常被用來治療風(fēng)濕性腰椎和軟組織損傷，療效顯著，無明顯毒副作用。1材料和方法1.1免疫組化試劑盒TSTR提取所用赤雹根,經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院趙春穎教授鑒定為葫蘆科植物赤雹的干燥塊根,TSTR由承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所藥理實(shí)驗(yàn)室提取,純度為55.2%;雷公藤多苷(TG)片(安徽新隴海藥業(yè)有限公司,批號(hào)100301);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司,批號(hào)EK0526);弗氏完全佐劑(FCA,美國Sigma公司,批號(hào)100M8725);聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(大連寶生物工程有限公司,批號(hào)BK4501);PCR擴(kuò)增引物(美國Invitrogen生命技術(shù)公司,批號(hào)HB120706536);兔抗鼠TNF-α一抗(美國Bioworld公司);免疫組化試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2紫外分光光度計(jì)和icycarrpcr檢測CSR-1-30型超純水機(jī)(北京愛思泰克科技開發(fā)有限責(zé)任公司);YXQ-LS-30SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);DU800紫外可見分光光度計(jì)(美國BeckmanCoulter公司);iCyclerPCR儀(美國Bio-rad公司);SIM-F124制冰機(jī)(日本SANYO公司);ESJ200-4電子天平(沈陽龍騰電子有限公司);TK-218型恒溫?cái)偲酒瑱C(jī)(湖北泰維醫(yī)療科技有限責(zé)任公司);YKH-I型液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠);RM2125型常規(guī)輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)(德國Leica公司);BH-2型Olympus顯微鏡及攝像裝置(日本Olympus公司)。1.3菌株:scxkSPF級(jí),雄性8周齡SD大鼠60只,體重180~200g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,合格證號(hào):SCXK京2009-0007。1.4方法1.4.1fca的注射效果隨機(jī)數(shù)字表法取大鼠10只作為空白組,其余大鼠均于右后足跖部皮下注射FCA0.1ml,以注射點(diǎn)周圍出現(xiàn)明顯白泡為效果最佳,于注射FCA后第18天,關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)≥6為模型建立成功。AI評(píng)判標(biāo)準(zhǔn):肢體關(guān)節(jié)腫脹按0~Ⅳ級(jí)評(píng)分1.4.2灌胃藥物的給予將模型大鼠隨機(jī)分為模型組、TSTR40,80,160mg/kg組和TG12mg/kg對(duì)照組,各藥物組均灌胃給予相應(yīng)藥物21d,空白組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。1.4.3血清離心腹主動(dòng)脈取血,靜置30min以上,3500r/min離心10min,取上清,將血清注入EP管中4℃保存?zhèn)溆?。按照ELISA試劑盒說明書檢測血清TNF-α含量。1.4.4pcr檢測na表達(dá)取新鮮足趾100~200mg,加入1mlTrizol,置于勻漿器中,冰上充分研磨,勻漿液于離心機(jī)(4℃、12000r/min,15min)離心后,取上清液,加入0.2ml三氯甲烷,劇烈震搖30s,靜置5min;同等條件再次離心后,小心吸取上清水相液(勿吸入中間蛋白層),加入等體積異丙醇,上下緩慢顛倒幾次,使之混勻,-20℃冰箱靜置2h后,冰上放置5min;再次相同條件離心,留取管壁側(cè)部和底部的白色RNA沉淀,用75%乙醇[0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水配制]1ml,洗滌沉淀,重復(fù)3次,將洗滌后的RNA溶于20μlDEPC水中,放置-80℃冰箱,保存?zhèn)溆谩Ｈ∩倭看郎yRNA樣品,用DEPC水稀釋100倍,紫外分光光度計(jì)測定RNA純度,瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA完整性,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?30℃,10min;42℃,30min;99℃,5min;5℃,5min)產(chǎn)物cDNA于-20℃保存。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性2min,94℃變性30s,57℃退火30s(不同目的因子采用相應(yīng)的退火溫度),72℃延伸1min,共30個(gè)循環(huán),產(chǎn)物于-20℃保存。TNF-α上游引物5'-CGTCGTAGCCAAACCACCAAG-3',下游引物5'-CACAGAGCAATGACTCCAAAG-3',擴(kuò)增長度426bp,退火溫度57℃;β-actin上游引物5'-CATCCTGCGTCTGGACCT-3',下游引物5'-TCAGGAG-GAGCAATGATCTTG-3',擴(kuò)增長度480bp,退火溫度53℃反應(yīng)液依照試劑盒說明書配制同PCR反應(yīng)產(chǎn)物分析:配制含EB0.5μg/ml的2%瓊脂糖凝膠,取4μlPCR產(chǎn)物與1μl5倍DNA上樣緩沖液混勻,將電泳儀調(diào)至120V,25min,將電泳結(jié)束后的凝膠移至紫外透射儀下,觀察并攝取圖像。應(yīng)用QuantityOne4.6.2凝膠定量分析軟件測定圖像的光密度值(IOD),進(jìn)行定量分析。計(jì)算各目的條帶與β-actin條帶光密度的比值(ROD)。1.4.5免疫組化法檢測tnf-蛋白表達(dá)將取材后的大鼠脾臟于10%甲醛固定液固定48h后,常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片(免疫組化步驟按試劑盒說明書進(jìn)行)、10×20倍光鏡下觀察TNF-α高蛋白表達(dá)情況,并拍攝圖像;其中以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒狀淡黃色或褐黃色者為陽性細(xì)胞。采用IPP6.0軟件測定足跖部TNF-α表達(dá)的免疫組化染色的IOD值,計(jì)算各組光密度平均值,進(jìn)行半定量分析。陰性對(duì)照片用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗,其余操作步驟同上。1.5統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。2結(jié)果2.1各組血清tnf-水平比較模型組血清TNF-α含量[(0.98±0.08)ng/ml]明顯高于空白組[(0.15±0.03)ng/ml,P<0.01];TSTR40,80,160mg/kg組血清TNF-α含量[(0.56±0.05)、(0.32±0.04)、(0.18±0.04)ng/ml]明顯低于模型組(P<0.01);TSTR40mg/kg組和80mg/kg組血清TNF-α和TG對(duì)照組[(0.15±0.03)ng/ml]比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),治療RA效果弱于TG對(duì)照組;TSTR160mg/kg組血清TNF-α和TG對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.2大鼠ras-pcr檢測大鼠tnf-mrna表達(dá)各組內(nèi)參β-actinmRNA表達(dá)較為均一,空白組TNF-αmRNA表達(dá)較少(0.1±0.02)。各藥物組TNF-αmRNA表達(dá)均明顯低于模型組(0.665±0.099,P<0.05或P<0.01);其中TSTR40mg/kg組(0.299±0.054)和TSTR80mg/kg組(0.27±0.045)大鼠TNF-αmRNA表達(dá)和TG對(duì)照組(0.162±0.036)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),治療RA效果弱于TG對(duì)照組;TSTR160mg/kg組TNF-αmRNA表達(dá)(0.077±0.01)和TG對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。2.3tstnf-表達(dá)與空白組(0.09±0.02)相比,模型組(1.52±0.28)脾臟TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01);與模型組比較,TSTR各劑量組TNF-α表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01);其中TSTR40mg/kg組和80mg/kg組TNF-α表達(dá)水平(1.01±0.22,0.54±0.13)和TG對(duì)照組(0.39±0.11)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),治療RA效果弱于TG對(duì)照組;TSTR高劑量組TNF-α表達(dá)(0.47±0.15)和TG對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);見圖2。3中醫(yī)對(duì)于ra的認(rèn)識(shí)RA是一種以慢性、侵蝕性關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的自身免疫性疾病。目前為止,醫(yī)學(xué)界還沒有攻克RA這一世界性的難題,通常認(rèn)為與T細(xì)胞免疫反應(yīng)和B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體均有關(guān),但其具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。RA患者中炎性細(xì)胞因子異?；钴S已得到公認(rèn),特別是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α與RA的發(fā)病密切相關(guān)RA是一種反復(fù)發(fā)作性、以肢體小關(guān)節(jié)疼痛為主要病癥的疾病,傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中多把此類病癥歸為“痹證”范疇,雖然沒有RA這一病名,但是從患者體征、臨床癥狀等,可以看出古代醫(yī)家對(duì)該病認(rèn)識(shí)由來已久?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》中就提出了“痹”病,如《素問·逆調(diào)論》所云“……病名曰骨痹,是人當(dāng)攣節(jié)也”。東漢張仲景在《金匱要略·痙濕暍病脈證》中指出“病者,一身盡疼,發(fā)熱,日晡所劇者,名風(fēng)濕”。古代醫(yī)家多認(rèn)為氣血不足,營衛(wèi)