雞胚成纖維細(xì)胞感染馬立克氏病后部分染色體上微衛(wèi)星的變化

雞胚成纖維細(xì)胞感染馬立克氏病后部分染色體上微衛(wèi)星的變化

馬立克病（mdv）是由馬立克病病毒（mdv）引起的一種嚴(yán)重的雞淋巴腫瘤性疾病。mdv感染可能會(huì)導(dǎo)致主觀免疫抑制。這是目前和將來最重要的雞育種疾病之一。微衛(wèi)星(microsatellite,MS)是廣泛存在于原核及真核細(xì)胞基因組中的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)的DNA序列,約占人類基因組的10%1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)用微衛(wèi)星引物實(shí)驗(yàn)所用雞胚購(gòu)自南京藥械廠;馬立克氏病毒超強(qiáng)毒株RB-1B株,由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物免疫診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);本實(shí)驗(yàn)中所用的微衛(wèi)星引物由日本農(nóng)業(yè)生物科學(xué)研究所惠贈(zèng);小牛血清、MEM由Gibco公司生產(chǎn);胰蛋白酶購(gòu)自華美生物工程公司;Taq酶,PUC18DNA/MspI,購(gòu)自南京天為生物科技有限公司;尿素、過硫酸銨、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、硼酸與Trisbase,TEMED由Amresco公司生產(chǎn);AgNOCO1.2馬立克病毒對(duì)雞胚細(xì)胞生長(zhǎng)的影響取21個(gè)孵化9~11日齡SPF雞胚,按常規(guī)雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)。待細(xì)胞大約80%鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁時(shí),來自同一雞胚個(gè)體的CEF一半接種馬立克病毒超強(qiáng)毒株RB-1B株,一半不接毒作為對(duì)照。攻毒后第5天,有90%的細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變時(shí),收集細(xì)胞,采用常規(guī)的細(xì)胞基因組DNA提取法提取DNA1.3pcr擴(kuò)增試驗(yàn)提取的DNA作模板,用雞5,6,7,8,9號(hào)染色體上的43對(duì)微衛(wèi)星引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用25μL的反應(yīng)體系:基因組DNA(大約50ng/μL)1μL,引物(10pmol/μL)1μL,Taq酶1.25U,10×PCR緩沖液(Mg首先94℃,預(yù)變性1min15s,采用循環(huán)三相。第一相共10個(gè)循環(huán),94℃變性15s,60℃退火30s,68℃延伸1min。第二相共10個(gè)循環(huán),94℃變性15s,55℃退火30s,68℃延伸1min。第三相共30個(gè)循環(huán),94℃變性15s,50℃退火30s,68℃延伸1min。最后68℃延伸9min。1.4聚丙烯酰胺變性凝膠電泳取4μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物,上樣至10%聚丙烯酰胺變性凝膠內(nèi),160V電壓電泳2~3h,電泳凝膠銀染,成像系統(tǒng)拍照分析結(jié)果。1.5pcr擴(kuò)增效果目前國(guó)際MSI工作站推薦一組檢測(cè)微衛(wèi)星標(biāo)志物至少應(yīng)為5個(gè),其中有≥2個(gè)標(biāo)志物發(fā)生MSI時(shí)為MSI-H,1個(gè)標(biāo)志物發(fā)生MSI時(shí)為MSI-L,沒有MSI發(fā)生時(shí)為MSS判斷樣本是否有MSI:比較同時(shí)電泳上樣的染毒CEF和其同源正常CEF基因組DNA的PCR產(chǎn)物的PAGE條帶,與正常對(duì)照相比,若某一微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因條帶增多或位置發(fā)生改變,則記為MSI。2結(jié)果與分析2.1纖維細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果待CEF細(xì)胞貼壁長(zhǎng)成單層,大約有80%鋪滿底壁時(shí)(圖1),接毒超強(qiáng)毒株RB-1B株,在CO2.2聚丙烯酸-冷凝膠電泳的結(jié)果同一個(gè)引物不同樣品的電泳圖。2.3微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)由表1可見,5,6,7,8,9號(hào)染色體的43個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記,其中38個(gè)位點(diǎn)發(fā)生不同百分率的MSI,5個(gè)標(biāo)記沒有檢測(cè)到變化,占微衛(wèi)星標(biāo)記5/43(11.63%)。檢測(cè)到有MSI的微衛(wèi)星位點(diǎn)表現(xiàn)不同的百分率,其中ABR0262的MSI發(fā)生率最高為38.10%,ABR0048,ABR041,MCW0183次之,其MSI均為33.33%。MSI最低為4.76%,這樣的位點(diǎn)有7個(gè),占微衛(wèi)星標(biāo)記的比率為7/43(16.28%)。2.4樣品制備方法hdmi由表2可見,21組樣品中,9號(hào)樣品,MSI發(fā)生率最高為41.86%。11,6號(hào)樣品的發(fā)生率也較高,分別為32.56%,27.91%。3組樣品檢測(cè)到MSI的發(fā)生率為25.58%;1組樣品檢測(cè)到MSI發(fā)生率為16.28%;1組樣品檢測(cè)到MSI發(fā)生率為11.63%;4組樣品檢測(cè)到MSI發(fā)生率為9.30%;6組樣品MSI發(fā)生率為6.98%;1組樣品檢測(cè)到MSI發(fā)生率為4.65%;2組樣品的MSI發(fā)生率最低為2.33%。10個(gè)位點(diǎn)MSI的發(fā)生率在20%以上,占總微衛(wèi)星標(biāo)記的10/43(23.26%);21組雞胚19組出現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上位點(diǎn)出現(xiàn)基因組變化。3種病毒在色體上的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)與腫瘤之間的關(guān)系是近年來腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)之一,產(chǎn)生MSI的機(jī)制及其與腫瘤發(fā)生關(guān)系的研究已取得很大進(jìn)展。MSI是基因組不穩(wěn)定性的標(biāo)記,它在MSI腫瘤細(xì)胞增殖期間逐漸發(fā)展的一個(gè)動(dòng)力學(xué)過程本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞感染馬立克氏病毒后部分染色體上微衛(wèi)星不穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn),宿主基因組微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的變化是隨機(jī)的,但也有一定的規(guī)律,而且這些變化可以用微衛(wèi)星標(biāo)記來檢測(cè)。5,6,7,8號(hào)染色體上43個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)MSI的發(fā)生頻率存在差異。43個(gè)位點(diǎn)中,ABR0262的MSI發(fā)生率最高為38.10%,ABR0048,ABR041,MCW0183次之,他們的MSI均為33.33%。MSI最低為4.76%,這樣的位點(diǎn)有7個(gè),占微衛(wèi)星標(biāo)記的比率為7/43(16.28%)。10個(gè)位點(diǎn)MSI的發(fā)生率在20%以上,占總微衛(wèi)星標(biāo)記的10/43(23.26%);21組雞胚中19組出現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上位點(diǎn)出現(xiàn)基因組變化。夏繼飛由于檢測(cè)的位點(diǎn)和數(shù)量不同,不同染色體上或同一染色體上不同位點(diǎn)間MSI頻率差異可能很大。MD可能是MSI瘤,馬立克腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及不同基因的多部位、多步驟的改變。本實(shí)驗(yàn)中MSI率與以前研究結(jié)果4mdv致瘤機(jī)理解析微衛(wèi)星標(biāo)記研究能夠揭示MDV感染宿主后的致瘤機(jī)理。微衛(wèi)星標(biāo)記可以揭示宿主基因組尤其是腫瘤基因組發(fā)生了哪些變化,特別是對(duì)錯(cuò)配修復(fù)基因突變的探查,動(dòng)態(tài)的研究還能了解變化的順序及過程。故而針對(duì)宿主的基礎(chǔ)研究結(jié)合病毒功能基因組的研究成果,就比較容易解析MDV感染宿主后的致瘤機(jī)理。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與染色體數(shù)量、結(jié)構(gòu)異常密切相關(guān),分析某種腫瘤高頻率的染色體改變將為腫瘤易感基因的篩選提供定位資料。MD是由MDV引起的腫瘤性疾病,在發(fā)病前如能監(jiān)測(cè)或診斷出MDV致瘤株的感染,對(duì)避免雞場(chǎng)的損失非常關(guān)鍵。事實(shí)上,MD腫瘤的形成是本病的關(guān)鍵所在。在腫瘤形成前作出診斷是目前MD研究所缺乏的。本試驗(yàn)中篩選到的