抗真菌藥物敏感試驗(yàn)

抗真菌藥物敏感試驗(yàn)沈永年概述真菌感染的發(fā)病率,尤其是深部真菌感染的發(fā)病率逐漸增高大量新型抗真菌藥物不斷涌現(xiàn)臨床耐藥菌株的消滅抗真菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)為臨床耐藥菌株的發(fā)現(xiàn)，抗真菌藥物的選擇供應(yīng)指導(dǎo)。概述抗真菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)方法是建立在抗細(xì)菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)方法基礎(chǔ)之上由于真菌是一種高等的生物，其繁殖方式、生長周期、生長條件等均與細(xì)菌不同，因此抗真菌藥物敏感試驗(yàn)始終是國內(nèi)外學(xué)者討論的難題。因此，實(shí)驗(yàn)方法多樣化，但尚無通用的標(biāo)準(zhǔn)方法。美國國家臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）從1992年起，制訂了一系列針對抗真菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)性文件，但目前仍不能適用于全部醫(yī)學(xué)真菌的檢測。抗真菌藥敏試驗(yàn)?zāi)康闹笇?dǎo)抗真菌藥物的選擇測定抗真菌藥物對致病真菌的敏感性，供應(yīng)臨床用藥量及預(yù)后監(jiān)測的參考篩選耐藥菌株及研制對致病真菌有效的抗真菌藥物供應(yīng)臨床應(yīng)用常見術(shù)語最低抑菌濃度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）

MIC50，MIC90，MIC50％～80％最低殺菌濃度（minimalfungicidalconcentrationMFC）

MFC50，MFC90最低有效濃度（minimaleffectiveconcentration，MEC）抗真菌藥敏試驗(yàn)方法藥基法瓊脂稀釋法試管（液體）稀釋法微量液體稀釋法菌基法（瓊脂集中法）

ROSCO抗真菌藥敏紙片法E試驗(yàn)法（E－test）

酵母樣真菌藥物敏感試驗(yàn)酵母菌液基稀釋法抗真菌藥物敏感試驗(yàn)于1992年由美國國家臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）提出標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案（M27－P）以來，幾經(jīng)修訂，目前已由M27－A2取代。此外，其他藥物敏感試驗(yàn)方法如瓊脂稀釋法，瓊脂集中法，E試驗(yàn)法等時(shí)有應(yīng)用。試管液基稀釋法

(NCCLS-M27A)藥液的制備

儲(chǔ)存液：濃度至少為1280μg/mL或10倍于受試的最高濃度。儲(chǔ)存液濃度需依據(jù)藥物本身溶解性決定。氟康唑和5－氟胞嘧啶（5－FC）以滅菌蒸餾水溶解；酮康唑、伊曲康唑、兩性霉素B、伏力康唑等采納DMSO溶解。儲(chǔ)存液分裝后置－60℃保存。解凍后的儲(chǔ)存液應(yīng)在24h內(nèi)使用，不得重復(fù)凍存使用。試管液基稀釋法

(NCCLS-M27A)藥液的制備

使用液：水溶性藥物以無菌蒸餾水將儲(chǔ)存液倍比稀釋至工作液濃度（10倍測試濃度）。非水溶性藥物則需將儲(chǔ)存液用DMSO倍比稀釋至100倍測試濃度，再采納無菌蒸餾水稀釋至工作液濃度（10倍測試濃度），以防止藥物的析出。試管液基稀釋法

(NCCLS-M27A)培育基的制備

2倍濃度RPMI1640培育基（不含NaHCO3）作為標(biāo)準(zhǔn)培育基，用0.33mol/LMOPS緩沖液溶解,調(diào)節(jié)pH值至6.9~7.1（室溫），過濾除菌，4℃可保存4周。在培育基中加入4%葡萄糖可促進(jìn)菌生長，幫助終點(diǎn)的推斷。試管液基稀釋法

(NCCLS-M27A)菌液的制備受試菌在SDA或PDA中35℃培育24小時(shí)（念珠菌屬）或48小時(shí)（新生隱球菌）。取直徑約5mm菌落，混懸于5mL滅菌的生理鹽水中，渦旋混勻15秒，采納分光光度計(jì)在530nm處，調(diào)整菌懸液至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝粷岫?，相?dāng)于1×106～5×106/mL，作為菌液的貯備液。使用時(shí)，采納2倍量培育基將菌液調(diào)整至工作濃度為1.0×103～5.0×103/mL。再用無菌蒸餾水倍比稀釋成0.5×103～2.5×103/mL。試管液基稀釋法

(NCCLS-M27A)實(shí)驗(yàn)步驟：取無菌的15mm×100mm試管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)在試管中依次加入0.1mL倍比稀釋的不同濃度藥物工作液。依次在試管中加入0.9mL菌工作液，混勻。注意整個(gè)過程需在15min內(nèi)完成。實(shí)驗(yàn)過程中，設(shè)置空白對比和生長對比。同時(shí)進(jìn)行質(zhì)控菌株平行試驗(yàn)，進(jìn)行質(zhì)量掌握。將試管置于35℃培育46～50h觀察結(jié)果。對于新生隱球菌，培育時(shí)間應(yīng)延長至70～74h。試管液基稀釋法

(NCCLS-M27A)結(jié)果判讀兩性霉素B終點(diǎn)的推斷比較容易，無肉眼可見生長的最低藥物濃度為兩性霉素B的MIC值。氟胞嘧啶及唑類往往在最低濃度時(shí)也可消滅輕度渾濁。此時(shí)，可取生長對比管中菌懸液0.2mL，加入培育基0.8mL混勻作為推斷終點(diǎn)的濁度（即80％菌的生長受到抑制時(shí)的濁度)，與此濁度相近的試管即可判定為終點(diǎn)，其藥物濃度為該藥的MIC值。試管液基稀釋法

(NCCLS-M27A)結(jié)果的判定新三唑類藥物酵母菌的MIC值為0.03~16μg/mL，大多數(shù)酵母菌的MIC值小于1μg/mL。目前尚無資料說明MIC值與臨床療效之間的關(guān)系。氟胞嘧啶、氟康唑和伊曲康唑判定標(biāo)準(zhǔn)如下表所示。氟康唑的判定標(biāo)準(zhǔn)不適用于克柔念珠菌。采納不適當(dāng)?shù)娜苊饺芙庖燎颠蚩蓪?dǎo)致結(jié)果偏差。念珠菌體外藥物敏感試驗(yàn)的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

敏感（S）劑量依靠敏感（S－DD）中度敏感（I）耐藥（R）氟康唑≤816~32≥64伊曲康唑≤0.1250.25~0.5≥1氟胞嘧啶≤48~16≥32注：如果測定的MIC值位于上述分類之間，則將該菌劃分入高一級類別中試管液基稀釋法

(NCCLS-M27A)注意事項(xiàng)測試藥物的濃度范圍應(yīng)包括終點(diǎn)濃度和質(zhì)控株的MIC范圍。一般常見藥物的測試濃度范圍：兩性霉素B0.0313~16μg/mL；氟胞嘧啶0.125~64μg/mL；酮康唑0.0313~16μg/mL；伊曲康唑0.0313~16μg/mL；氟康唑0.125~64μg/mL，新三唑類藥物（如伏力康唑等）0.0313~16μg/mL。試管液基稀釋法

(NCCLS-M27A)注意事項(xiàng)測試過程中，需進(jìn)行生長空白對比、空白對比、質(zhì)控菌株對比。應(yīng)選擇對抗真菌藥物無拮抗作用的緩沖液溶解RPMI1640培育基，如MOPS。Tris緩沖液、PBS緩沖液因可與藥物存在相互作用而不適用。培育基pH值可能影響測試結(jié)果，應(yīng)嚴(yán)格掌握pH值于6.9~7.1。微量液體稀釋法藥液（儲(chǔ)備液和工作液）的制備儲(chǔ)備液的制備同試管稀釋法。與試管稀釋法不同，微量稀釋法的工作液濃度是測試濃度的兩倍。培育基的制備：同試管稀釋法菌液（儲(chǔ)備液和工作液）的制備菌儲(chǔ)備液的制備同試管稀釋法，但工作液濃度稀釋調(diào)整至兩倍測試濃度（即1×103～5×103/mL）即可，不需再用無菌蒸餾水倍比稀釋。微量液體稀釋法試驗(yàn)步驟

1.藥敏板的制備：采納96孔U型板，每排1～10孔依次加入不同濃度待測藥物工作液100μl，第1孔為最高濃度，第10孔為最低濃度。制備好的藥敏板可用塑料薄膜包裹后置－70℃保存6月以上。2.取制備好的藥敏板，在1～10孔加入100μl菌工作液，第11孔中加入100μl無菌蒸餾水和100μl菌工作液，作為生長對比；12孔僅加入無菌不含藥物培育基作陰性對比。3.將培育板置于35℃孵育48小時(shí)(新生隱球菌為72小時(shí)）后讀取結(jié)果。微量液體稀釋法

結(jié)果判讀觀察前，可輕輕震搖藥敏板，使終點(diǎn)判讀更容易。如果消滅菌膜沉淀，須進(jìn)行吹打、渦旋或其他方法混勻后，在進(jìn)行結(jié)果判讀。結(jié)果判讀以生長對比孔作為標(biāo)準(zhǔn)，將生長情況進(jìn)行評分：0：完全透明清亮；1：輕度渾濁2：濁度較生長對比明顯下降；3：濁度較生長對比輕度下降；4：濁度與生長對比全都。微量液體稀釋法結(jié)果判讀兩性霉素B：以評分為0的最低藥物濃度為MIC值5－FC和唑類：評分為2的最低藥物濃度作為MIC值。通過分光光度計(jì)檢測顯示，此時(shí)大約50％菌生長受到抑制。結(jié)果判讀可縮短至24小時(shí)，只要第11孔有菌生長即可進(jìn)行，對結(jié)果無明顯影響。瓊脂稀釋法

將瓊脂平板中摻入不同濃度的抗真菌藥物，以多點(diǎn)接種法將待測真菌接種于瓊脂表面（各點(diǎn)所種真菌量相同），以菌不生長的最低藥物濃度定為該藥對真菌的MIC。優(yōu)點(diǎn)：可同時(shí)測定多個(gè)菌株，易于確定終點(diǎn)。比液體稀釋法重復(fù)性好。缺點(diǎn)：方法繁瑣，耗時(shí)長。瓊脂稀釋法藥液的制備：同試管液基稀釋法，工作液濃度為10倍濃度的測試濃度，各種常用藥物的濃度測試范圍為：兩性霉素B0.0313~16μg/mL；氟胞嘧啶0.125~64μg/mL

酮康唑0.0313~16μg/mL；伊曲康唑0.0313~16μg/mL

氟康唑0.125~64μg/mL

；

新三唑類藥物（如伏力康唑等）0.0313~16μg/mL。

瓊脂稀釋法培育基制備RPMI1640培育基:

2倍量:RPMI164020.8g,葡萄糖40g,以0.33M

MOPS緩沖液溶解,調(diào)整pH值至6.9~7.1,過濾除菌,置-20℃保存。HR培育基：

2倍量：29.3gHR培育基，NaHCO3

2.0g，溶于1000mL雙蒸水中，調(diào)整pH值至7.5，過濾除菌，低溫保存。4％瓊脂：

40g瓊脂，溶于1000mL蒸餾水中，高壓滅菌15min，備用。瓊脂稀釋法菌液的制備受試菌在SDA中35℃培育24小時(shí)（念珠菌屬）或48小時(shí)（新生隱球菌）取直徑約5mm菌落，混懸于5mL滅菌的生理鹽水中，渦旋混勻15秒，采納分光光度計(jì)在530nm處，調(diào)整菌懸液至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝粷岫龋喈?dāng)于1×106～5×106/mL，作為菌液的工作液。

瓊脂稀釋法藥物平板的制備將RPMI1640培育基或HR培育基置60℃預(yù)溫。取4％瓊脂，加熱融化后，置60℃，保溫。將培育基和瓊脂1:1混勻，分裝入試管中，每管分裝13.5mL，仍置60℃保溫。將不同濃度藥液（工作液）1.5mL加入試管中，輕輕震搖混勻，倒入平皿，置水平桌面使之凝固，注意混勻時(shí)避開消滅氣泡。37℃，15分鐘，使干燥。如采納平板多點(diǎn)接種，可將培育基18mL，加入不同濃度藥液2mL，混勻倒入9cm直徑平皿，制成藥物平板備用。瓊脂稀釋法接種和培育在藥物平板中接種測試菌液，每點(diǎn)接種1～5μl，可進(jìn)行多點(diǎn)接種。并設(shè)置生長對比平皿，空白對比平皿和標(biāo)準(zhǔn)菌株對比。37℃培育48h或72h（新生隱球菌）終點(diǎn)判定：確定生長對比菌生長良好，空白對比無污染菌生長。逐一觀察從高濃度至低濃度平皿上的生長情況，以菌不生長平皿的藥物濃度作為對該菌的MIC值。瓊脂集中法

將待檢菌摻入瓊脂培育基內(nèi)，將浸有固定濃度的抗真菌藥液紙片置于瓊脂培育基表面，經(jīng)孵育后，依據(jù)紙片周圍真菌生長被抑制的范圍大小確定藥物對真菌的抑制作用。如同時(shí)應(yīng)用系列濃度紙片，尚可測出MIC值。優(yōu)點(diǎn)：簡潔、易行、不需簡潔設(shè)備缺點(diǎn)：單一濃度紙片僅能定性，不能確定MIC值。藥物紙片的標(biāo)準(zhǔn)化問題。瓊脂集中法培育基制備基本培育基為MH瓊脂，其中加入2%葡萄糖和亞甲基蘭（0.5μg/mL）。調(diào)整pH值至7.2～7.4（室溫下）。高壓滅菌后分裝入平皿，室溫下冷卻凝固后，37℃溫箱中干燥10～30min，以去除平皿表面水蒸氣。培育基平皿可在2～8℃冰箱保存一周。如采納塑料袋包裹可適當(dāng)延長。使用前，應(yīng)抽取同一批次平皿置于30～35℃孵箱中24小時(shí)，以確定無污染。瓊脂集中法藥液紙片制備：商品化藥液紙片：應(yīng)保存于－14℃以下冰箱中。使用前，應(yīng)提前取出置于室溫中平衡1～2小時(shí)。

瓊脂集中法菌液制備同試管稀釋法，受試菌在SDA或PDA中35

℃培育24小時(shí)（念珠菌屬）。取直徑約5mm菌落，混懸于5mL滅菌的生理鹽水中，渦旋混勻15秒，采納分光光度計(jì)在530nm處，調(diào)整菌懸液至0.5個(gè)濁度單位，相當(dāng)于1×106～5×106/mL，作為菌液的貯備液。瓊脂集中法操作步驟：用棉簽蘸取菌液涂于平板上，重復(fù)三次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60o再進(jìn)行涂布，最后涂布平板邊緣。將浸有藥液的紙片貼于瓊脂表面，可略微加壓保證紙片與瓊脂貼合緊密。紙片與紙片中心距離一般大于24mm。通常，150mm平板紙片數(shù)量不超過12個(gè)；100mm平板不超過5個(gè)。由于藥物集中在接觸時(shí)即已進(jìn)行，因此，當(dāng)紙片接觸平板后即不行再移動(dòng)。將貼有紙片的平皿翻轉(zhuǎn)后置35℃培育20～24小時(shí)，觀察結(jié)果。如24小時(shí)菌生長不良，可將培育時(shí)間延長至48小時(shí)。瓊脂集中法結(jié)果判讀藥物對受試菌有生長抑制時(shí)，可圍繞紙片形成抑制環(huán)。以明顯受抑制的環(huán)邊緣作為邊界，測量抑制環(huán)大小。環(huán)邊緣針尖大小菌落或環(huán)內(nèi)的大菌落可忽視不計(jì)。瓊脂集中法結(jié)果判定

質(zhì)控菌株的參考值（mm）白念珠菌（ATCC90028）近平滑念珠菌（ATCC22019）熱帶念珠菌（ATCC750)克柔念珠菌（ATCC6258）氟康唑（25μg）28～3922～3326～37伏力康唑（1μg）31～4228～3716～25瓊脂集中法結(jié)果判定：耐藥劑量依靠敏感敏感抑菌環(huán)直徑(mm)≤1415～18≥19MIC值(μg/mL)≥6416-32≤8念珠菌氟康唑瓊脂集中法（25μg紙片）結(jié)果與MIC值對比抗真菌藥敏紙片法

丹麥ROSCO公司從20世紀(jì)70年月開頭研制抗真菌藥敏紙片，操作簡潔，結(jié)果直觀，易于普及，只要嚴(yán)格依據(jù)ROSCO公司Neo－Sensitab抗真菌藥敏紙片方法操作，可與NCCLS－M27p有很好的符合率。主要適用于酵母樣真菌的藥敏試驗(yàn)。該方法也是一種瓊脂集中法。抗真菌藥敏紙片法培育基采納SHADOMY瓊脂，用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至7.0，同時(shí)添加氯霉素掌握細(xì)菌污染。培育基高壓滅菌后，倒入9cm培育皿中制成平板備用。ROSCO抗真菌藥敏紙片分類合名稱類別名稱縮寫劑量（μg）多烯類兩性霉素BAMPHO10制霉菌素NYST50唑類酮康唑KETO15咪康唑MICO10克霉唑CLOTRI10益康唑ECON10氟康唑FLZ15伊曲康唑ITRA8伏力康唑VCR1異康唑ISO10噻康唑TIO10其他氟胞嘧啶FLU1010FLU11灰黃霉素GRIS25環(huán)吡酮胺CIC50特比萘芬TRB30抗真菌藥敏紙片法菌液制備及操作步驟取沙堡瓊脂上30℃培育48小時(shí)的待測酵母樣菌半白金耳，磨種至生理鹽水中，充分震蕩后調(diào)整接種液菌濃度至5×105/mL，相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?。將菌液按前述方法用棉拭子涂布于培育基平板上?5℃培育18~24小時(shí)，觀察結(jié)果。隱球酵母屬真菌，30℃，42～48小時(shí)判讀結(jié)果?；九凶x標(biāo)準(zhǔn)（局部治療用）抗真菌藥名稱敏感中介耐藥環(huán)吡酮胺≥20mm12~19mm≤11mm克霉唑≥20mm12~19mm≤11mm益康唑≥20mm12~19mm≤11mm氟康唑≥20mm12~19mm≤11mm異康唑≥20mm12~19mm≤11mm酮康唑≥20mm12~19mm≤11mm咪康唑≥20mm12~19mm≤11mm噻康唑≥20mm12~19mm≤11mm特比萘芬≥20mm12~19mm≤11mm游霉素≥15mm10~14mm無抑菌環(huán)制霉菌素≥15mm10~14mm無抑菌環(huán)伊曲康唑≥15mm10~14mm無抑菌環(huán)灰黃霉素≥10mm無抑菌環(huán)嚴(yán)重系統(tǒng)性感染株判讀標(biāo)準(zhǔn)藥物名稱抑菌圈直徑（mm）Breakpoints，MIC（μg/mL）敏感中介耐藥敏感耐藥兩性霉素B/10μg≥1514～10<10≤1≥4氟康唑/25μg≥2221～15≤14≤8≥64氟胞嘧啶/1μg≥2012～19≤11≤4≥32氟胞嘧啶/10μg≥3023～29≤22≤4≥32伊曲康唑/8μg≥1610～15≤9≤0.12≥1酮康唑/1μg≥3023～29≤22≤0.12≥0.5伏力康唑/1μg≥14≤1酵母紙片藥敏的質(zhì)控

（0.5麥?zhǔn)蠞岫龋?：1稀釋，培育18～24h）藥物名稱直徑（mm）白念珠菌（ATGG84548）白念珠菌（ATGG64550）光滑念珠菌2338NL（24h）兩性霉素B18～28（s）19～24（s）9～13（s）氟康唑36～42（s）11～17（s）氟胞嘧啶34～40（s）26～33（s）45～53（s）伊曲康唑25～31（s）9（R）酮康唑36～44（s）21～29（I）E試驗(yàn)法瓊脂集中法的改良，將原單一藥物濃度紙片用含有梯度濃度排列的藥液條代替，通過形成的橢圓形抑菌圈，可推斷藥物的MIC值。本法與瓊脂稀釋法比較，二者的符合率為95％，在提高試驗(yàn)的敏感度及削減實(shí)驗(yàn)步驟等方面有較大的優(yōu)越性。E試驗(yàn)法培育基：RPMI1640或HR培育基，含2％瓊脂和2％葡萄糖，制備過程同瓊脂集中法，調(diào)節(jié)pH值至7.0,倒入平皿，冷卻凝固，制成培育基平板。菌液：制備同瓊脂集中法，調(diào)節(jié)菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?。E試驗(yàn)紙片：有商品供應(yīng)。紙片上含有梯度濃度排列的藥物。E試驗(yàn)法操作步驟

1.用棉拭子蘸取菌液涂布于培育基平板

2.將含不同藥物的E試驗(yàn)藥液塑料條貼于培育基上，150mm

平皿最多貼4～5個(gè)；90mm平皿最多貼1～2個(gè)。

3.

35℃培育24小時(shí)（念珠菌）或48小時(shí)（隱球菌屬）后判讀結(jié)果。

E試驗(yàn)法結(jié)果判讀可見到呈橢圓形的抑菌圈，圈邊緣所指示的相應(yīng)位置的數(shù)值（藥物濃度）即為MIC值。絲狀真菌（雙相真菌）

藥物敏感試驗(yàn)由于絲狀真菌生長較慢，體積較大，給絲狀真菌的藥物敏感試驗(yàn)帶來很多困難。目前，絲狀真菌的藥物敏感試驗(yàn)無論是在培育基的選擇、菌量的確定或終點(diǎn)推斷上均無標(biāo)準(zhǔn)化的方法。因此，至今尚無重復(fù)性好、簡潔易行、被廣泛接受的標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)。一般常用的方法包括瓊脂稀釋法，液體微量稀釋法等。瓊脂稀釋法培育基制備沙氏瓊脂：葡萄糖20g，蛋白胨10g，瓊脂20g，溶于1000mL蒸餾水，調(diào)整pH至6.8，高壓滅菌。

CAS培育基：Casitone9g，酵母浸膏5g，枸櫞酸三鈉10g，磷酸氫二鈉1g，磷酸二氫鈉1g，葡萄糖10g，瓊脂20g，溶于1000mL蒸餾水，高壓滅菌。

瓊脂稀釋法菌液制備

1.將待測菌株接種于PDA上，28℃培育7～10天

2.取約5mg菌量，置于生理鹽水中，Potter研磨器研碎，經(jīng)四層無菌紗布過濾，以血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分生孢子或碎菌絲成分，以滅菌生理鹽水調(diào)節(jié)分生孢子或菌絲成分至103/mL。瓊脂稀釋法藥物工作液的制備

參考酵母樣菌試管液基稀釋法的藥液配制。藥物工作液濃度是測試濃度的10倍。瓊脂稀釋法藥物培育基制備

1.

以不同濃度的藥物2mL加至18mL經(jīng)56℃融化的瓊脂中使之混勻，每個(gè)濃度藥立即分別倒入直徑9cm的培育皿中，待瓊脂固化后，4℃冰箱中保存。也可采納試管法，即不同濃度藥物0.3mL，加入2.7mL培育基，倒入無菌試管制成斜面?zhèn)溆谩?/p>

2.培育基中的藥物最終濃度為：兩性霉素B

0.03~64μg/mL唑類藥物0.125~128μg/mL特比萘芬0.03~128μg/mL阿莫羅芬0.01~100μg/mL瓊脂稀釋法操作步驟

1.取不同菌液以多點(diǎn)接種法接種入培育基，每點(diǎn)為1～5μl菌液。

2.

28℃，培育3～7天。

3.培育期間，每24小時(shí)讀結(jié)果1次，以肉眼判定無菌生長的最低藥物培育皿的濃度為MIC。微量液體稀釋法培育基制備同酵母樣菌試管液基稀釋法，采納含0.33MMOPS的RPMI1640培育基，pH6.9~7.1藥液制備：同酵母樣菌試管液基稀釋法，儲(chǔ)存液濃度至少為1280μg/mL。工作液濃度為2倍測試濃度。微量液體稀釋法菌液制備

1.受試菌株在PDA上35℃培育7天，促進(jìn)小分生孢子生成（鐮刀菌屬先在35℃培育48～72小時(shí)，然后25～28℃培育至7天）。

2.

1mL無菌生理鹽水沖洗菌落，曲霉菌落可在無菌生理鹽水中加入1滴吐溫20。

3.收集沖洗液，靜置3～5分鐘，取上部較均勻混懸液，渦旋混勻，分光光度計(jì)測定OD值。曲霉和申克孢子絲菌調(diào)整OD值至0.09~0.11;根霉、鐮刀菌及波氏假阿什利菌調(diào)整至0.15~0.17。

4.將上述懸液用培育基進(jìn)行1:50稀釋，即得到工作液（2倍最終濃度），約為0.4×104～5×104cfu/mL。微量液體稀釋法試驗(yàn)步驟

1.采納96孔U型板，每排1～10孔依次加入不同濃度待測藥物工作液100μl，第1孔為最高濃度，第10孔為最低濃度。

2.在1～10孔加入100μl菌工作液，第11孔中加入100μl無菌不含藥物的培育基和100μl菌工作液，作為生長對比；12孔僅加入無菌不含藥物培育基作陰性對比。

3.培育板置于35℃孵育。根霉在培育21～26小時(shí)后，鐮刀菌、曲霉和孢子絲菌在46~50小時(shí)，波氏假阿什利菌70～74小時(shí)后讀取結(jié)果。微量液體稀釋法結(jié)果判讀結(jié)果判讀以生長對比孔作為標(biāo)準(zhǔn)，將生長情況進(jìn)行評分。

0：完全透明清亮或無生長；

1：少量生長，大致相當(dāng)于生長對比孔的25％

2：生長明顯削減，相當(dāng)于生長對比孔50％

3：生長輕度削減，相當(dāng)于生長對比孔75％

4：無明顯生長抑制，與生長對比全都微量液體稀釋法結(jié)果判讀

1.兩性霉素B終點(diǎn)易推斷，