滅活方法對冰核活性細菌活性的影響

滅活方法對冰核活性細菌活性的影響

自1973年首次報道冰核活性細菌（簡稱ia）以來。1材料和方法1.1材料表面1.1.1rbicola培養(yǎng)模式草生歐文氏菌10025A(Erwiniaherbicola)來源于中國林業(yè)科學院森林保護研究所。Xanthomonascampestris206菌株,本實驗室從天津市地區(qū)蔬菜葉表分離。1.1.2培養(yǎng)基MPDA培養(yǎng)基見文獻1.1.3超聲波細胞粉碎機HYG-Ш型回轉式恒溫調速搖瓶柜,JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機,J2-21型低溫冷凍離心機,HC21006型低溫恒溫器,玻璃組織研磨器,721分光光度計等。1.2方法1.2.1實驗方法1.2.1.mpda液體培養(yǎng)基將活化后的冰核活性細菌10025A斜面菌種接入到30mlMPDA液體培養(yǎng)基中再活化一代后,按2%的接種量接種到MPDA液體培養(yǎng)基中,在31℃,180r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)24h后轉至18℃下繼續(xù)培養(yǎng)2h。將培養(yǎng)物在4000r/min下低溫離心30min,磷酸緩沖液(50mmol/L,pH=7.0)洗滌兩次后按一定體積懸浮,測定細菌懸液細胞濃度和冰核活性。1.2.1.細菌懸液處理及活菌計數(shù)和凍滴率的測定將含有30ml菌懸液的小燒杯置于冰浴中,超聲波輸出功率為400W、超聲時間2s,間隙時間2s,設計不同的細菌懸液濃度和總的超聲處理時間,定時取樣進行顯微鏡觀察并進行活菌計數(shù)和凍滴率的測定。1.2.1.3-輻射處理按前述方法制備細菌懸液后,分別將70ml細菌懸液置于無菌三角瓶中,包扎好后送到天津市物理所輻照中心進行輻射處理,采用的輻射源為1.2.1.超聲波配合處理按前述方法制得細菌懸液后離心,菌體重新懸浮于溶菌酶濃度為1mg/ml的0.001mol/L的磷酸緩沖液(含0.001mol/LEDTA,0.25mol/L蔗糖)中,28℃下靜置2h,然后激烈震蕩或置于超聲波中配合超聲波進行處理,然后進行活菌計數(shù)和凍滴率的測定。1.2.1.活菌計數(shù)和凍滴率的測定將細菌懸液置于冰箱冷凍室中(-18℃)凍結24h后取出,室溫下緩慢解凍,無菌操作吸取2ml用于活菌計數(shù)和凍滴率的測定,其余繼續(xù)凍結24h后進行活菌計數(shù)和凍滴率的測定。1.2.1.活菌計數(shù)和凍滴率的測定將一定體積得到的濕菌體移入研磨器中,加入2g石英沙,研磨30min后用一定體積的磷酸緩沖液洗出菌體并懸浮,進行活菌計數(shù)和凍滴率的測定。1.2.2測量1.2.2.1.冷凍率的測量采用Lindow改進的小液滴法1.2.2.2.活細菌計算方法在MPDA平板上采用傾注法測定冰核細菌數(shù)2結果與討論2.1超聲破裂法對冰核細菌的死亡和冰核活性的影響2.1.1超聲處理時間對1005a冰核菌的死亡率和冰核活性的影響超聲波輻射時間是影響細菌細胞破碎死亡效果的重要因素。本實驗研究了細胞濃度為1.4×102.1.2超聲處理中的細胞濃度對10025a的死亡率和冰核活性的影響選取不同細胞濃度的菌液(1.4×102.1.3聲波法處理由于溶菌酶可以使細菌細胞壁水解,導致細胞壁疏松或細胞破碎。因此采用溶菌酶配合超聲波法處理冰核細菌,以期獲得更高的死亡率。結果見圖5,該方法使細菌死亡率提高到99.11%,溶菌酶的加入雖然對冰核活性影響不大(見表2,溶菌酶法),但并未使死亡率達到100%的效果,成本的增加大于效果的提高,不太適合實際應用。2.2輻射處理對冰核細菌死亡率和冰核活性的影響溶菌酶法、研磨法和凍融法對冰核細菌死亡率和冰核活性的影響結果見表1。溶菌酶法可使細菌死亡率達到90.7%,研磨法和凍融法的細菌死亡率相對都較低,凍融法還造成凍滴率的顯著下降,可見上述方法均不可取。采用輻射法對前面所用冰核細菌10025A和另一株具冰核活性的黃單胞菌屬的206菌株進行滅活處理,考察輻射處理對冰核細菌死亡率和冰核活性的影響,結果見表2。冰核細菌10025A兩種菌懸液經過20kGy輻射劑量的照射后細菌全部死亡,樣品液在平板上培養(yǎng)幾天仍無菌生長,樣品液的凍滴率稍有下降。提高劑量到25kGy以上時,輻射后的原處理液冰核活性極度下降,OD600nm值為0.1的稀釋液的冰核活性為零。206菌株的兩種菌懸液經過25kGy輻射劑量照射后,在計數(shù)培養(yǎng)的第1d天沒有生長,第2d開始有大量菌生長。因輻射作用機制主要是使微生物DNA受損,從而使細胞喪失繁殖能力,但206菌株對DNA受損有很強的修復能力,所以表現(xiàn)出上述特性,這與有關文獻報道3輻射處理對冰核細菌死亡率的影響探討了幾種滅活方法對冰核活性細菌死亡率和冰核活性的影響,結果表明:超聲波破碎法可以使冰核細菌10025A死亡率達到98%以上,但冰核活性也有所下降。輻射處理可使冰核細菌達到100%的死亡率,不同菌種對輻射的敏感程度不同,冰核活性的變化也有所不同,冰核細菌10025A在20kGy輻射劑量下100%