DB37-T 4415-2021 β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鑒定及牛奶中β-乳球蛋白的檢測技術(shù)

67.050CCS

X

0437 DB

37/T

4415—2021β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鑒定及牛奶中β-乳球蛋白的檢測技術(shù)Detection

of

β-

gene

cow

β

山東省市場監(jiān)督管理局 發(fā)

布DB

37/T

4415—2021本文件按照GB/T

—《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由山東省畜牧獸醫(yī)局提出并組織實(shí)施。本文件由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。蒙天乳業(yè)有限公司、山東省畜牧總站。高亞平、劉文浩、王金鵬、楊春紅、李彥芹、宋明智、高運(yùn)東、侯明海。NY/T

1672—2008 綿羊多胎主效基因Fec

分子檢測技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T

1672—2008 綿羊多胎主效基因Fec

分子檢測技術(shù)規(guī)程

1范圍本文件確立了β-BLG）基因敲除奶牛的定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）鑒定方法，以及牛奶中β-乳球蛋白（）的定性免疫印跡（）和定量酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測方法。本文件適用于β-BLG）基因敲除奶牛以及牛奶中β-乳球蛋白的檢測。2 規(guī)范性引用文件文件。GB/T

6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求GB/T

27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品分子生物學(xué)檢測GB/T

27642—2011牛個體及親子鑒定微衛(wèi)星DNA法NY/T

1663—2008 乳與乳制品中β-乳球蛋白的測定 聚丙烯酰胺凝膠電泳法BNY/T

2695—2015 牛遺傳缺陷基因檢測技術(shù)規(guī)程SN/T

—2010 進(jìn)出口危險化學(xué)品安全試驗(yàn)方法 第16部分：Western-Blot實(shí)驗(yàn)農(nóng)業(yè)部2031號公告

轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品成分檢測

普通牛

(Bos

taurus)

內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1牛β-乳球蛋白基因 Bos

taurus

β

BLGBLG基因（NCBI

Reference

sequence:

NC_037338.1），簡稱PAEP，來源于普通牛（Bos

taurus），編碼β-乳球蛋白的基因。

bp3.2β-乳球蛋白基因敲除奶牛β-lactoglobulin

knockout

利用基因編輯技術(shù)敲除β-乳球蛋白基因的奶牛。4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（-基因定性檢測4.1 原理通過設(shè)計特異引物，擴(kuò)增出包含牛BLG基因全長的片段，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。依據(jù)BLG基因編碼序列是否發(fā)生突變，并提前引入終止密碼子，造成蛋白質(zhì)編碼異常，判斷是否敲除基因。DB

37/T

4415—20214.2 試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。4.2.1 水：GB/T

6682，三級。4.2.2 50×

Tris-base

242.2

g

57.1

mL，

mol/L

EDTA

(pH8.0)100

mL，用水定容至

1

mL。使用時，用水稀釋為

1×。4.2.3 1

%瓊脂糖凝膠：1

g

瓊脂糖充分溶解于

1×，定容至

mL。4.2.4 BLG

基因引物：——上游引物：5′′；——下游引物：5′-AGTTTCAAAGAGCCGTAGATGTGTG-3′；——預(yù)測野生型擴(kuò)增片段大小為

6

bp。4.2.5 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因引物：參照農(nóng)業(yè)部

2031

號公告-14-2013。4.2.6 引物溶液：引物用水稀釋到

10

μmol/L。4.3 儀器設(shè)備4.3.1

PCR

擴(kuò)增儀：溫度范圍

4

℃～99

℃，溫度梯度范圍

20

℃，模塊單元

96×0.2

mL。4.3.2

離心機(jī)：最高轉(zhuǎn)速

000

r/min，最大容量

24×2

。4.3.3

電子天平：量程

0.001

g～100

g，感量

0.001

g。4.3.4

凝膠成像分析系統(tǒng)。4.3.5

穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：輸出電壓

0

V～600

V，輸出電流

0

mA～

mA。4.3.6

高壓滅菌鍋：使用溫度范圍

45

℃～

℃，最高使用壓力

0.255

。4.3.7

微波爐。4.4 樣品4.4.1

采集靜脈血樣

3

mL～5

mL，醫(yī)用抗凝管或

ACD

抗凝，-20

℃以下保存。4.4.2

采集組織（耳組織等）

g～

g

75%的酒精，

℃以下保存。4.4.3

采集帶毛囊的牛毛

～

根，浸入

%的酒精或置于毛囊卡，-20

℃以下保存。4.4.4

采集

mL～

mL

鮮精或

1～2

支細(xì)管冷凍精液，備用。4.5 試驗(yàn)步驟4.5.1 DNA

基因組DNA提取按照GB/T

27642—2011附錄B4.5.2 DNA

濃度和純度檢測DNA濃度和純度檢測按照

1672—2008中7.3的規(guī)定執(zhí)行。4.5.3 PCR

4.5.3.1樣品

4.5.3.1.1內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因

PCR

擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)程序按照農(nóng)業(yè)部2031號公告。4.5.3.1.2 基因特異性序列

PCR

擴(kuò)增DB

37/T

4415—20214.5.3.1.2.1 PCR

Taq

DNA

聚合酶

μL；2×

PCR

buffer

μL；dNTP

Mixture

(2.5

8

μL；上下游引物

(10

μM)

各

μL；模板

200

ng～1

μg；加雙蒸水至總體積

50

μL。4.5.3.1.2.2 PCR

擴(kuò)增程序。94

℃

1

；94

℃

30

s，52

℃

30

s，72

℃

6

，35

個循環(huán)；72

℃

10

，4

℃保存。4.5.3.2 對照

以野生型奶?；蚪MDNA（序列信息見附錄A16

BLG基因敲除奶牛基因組DNA（序列信息見附錄B）作為陽性對照；以水作為空白對照。除DNA模板外，對照擴(kuò)增條件與4.5.3.1.2相同。4.5.4PCR

產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測按照NY/T

2695—2015中的規(guī)定執(zhí)行。4.5.5 測序分析將檢測合格的產(chǎn)物進(jìn)行全長測序分析。4.6 結(jié)果判定與表述4.6.1對照檢測結(jié)果分析BLG基因特異性序列均擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的產(chǎn)物，空白對照無預(yù)期擴(kuò)增片段，則表明反應(yīng)體系正常；否則，需重新擴(kuò)增。4.6.2樣品檢測結(jié)果判定和表述PCR擴(kuò)增的β-乳球蛋白基因片段參考序列（野生型）見附錄A。對測序結(jié)果和參考序列進(jìn)行比對，判定樣品是否發(fā)生基因敲除。4.6.2.1 如果樣品序列與參考序列一致，未造成蛋白質(zhì)編碼異常，表述為“BLG

基因未敲除奶?！?。4.6.2.2 表述為“

基因敲除奶?！薄?免疫印跡（Western-Blot）法-蛋白定性檢測5.1 原理對預(yù)處理的牛奶樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，使用牛β-乳球蛋白特異性第一抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行檢測，根據(jù)條帶位置和著色深度判定樣品中是否含有β-乳球蛋白。5.2 試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。5.2.1 水：GB/T

6682，三級。5.2.2 牛β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品儲液（10

mg/mL）：稱取

g

牛β-乳球蛋白，溶解于

mL

雙蒸水中，分裝，-20

℃以下保存。5.2.3 10

%

10

g

的

SDS

粉末溶于

mL

蒸餾水中，充分溶解后，定容至

mL。5.2.4 30

%

29

g

丙烯酰胺和

1

g

’-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為

mL

的蒸餾水中，充分溶解后，定容至

100

。DB

37/T

4415—20215.2.5 1.5

M

Tris-HCl(pH8.8)

181.65

g

mL

蒸餾水中，加濃鹽酸調(diào)

至

容至

1

000

mL。5.2.6 1

M

Tris-HCl(pH=6.8)

121.1

g

Tris

800

mL

蒸餾水中，加濃鹽酸調(diào)

pH

至

，定容至

1

mL。5.2.7 10

%過硫酸銨：將

10

g

過硫酸銨粉末溶于

80

蒸餾水中，充分溶解后，定容至

mL。5.2.8 15

%

SDS

分離膠（5

mL）：1.1

mL

蒸餾水，

mL

30

%丙烯酰胺溶液，1.3

mL

1.5

MTris-HCl(pH8.8)，0.05

10

%SDS，0.05

mL

10

%過硫酸銨，0.002

mL

。5.2.9 5

%

SDS

濃縮膠（2

mL）：1.4

mL

蒸餾水，0.33

mL

30

%丙烯酰胺溶液，0.25

mL

MTris-HCl(pH6.8)，0.02

10

%SDS，0.02

mL

10

%過硫酸銨，0.002

mL

。5.2.10 10×轉(zhuǎn)膜液（

mL）：15.1

g

Tris，75

g

甘氨酸溶于蒸餾水中至終體積為

500

mL。5.2.11 10×（1

L88

g

氯化鈉，12.1

g

Tris

溶于蒸餾水中至終體積為

1

L，濃鹽酸調(diào)整

pH

至7.6。5.2.12 1×TBST（1

L

mL

10×

緩沖液，

mL

雙蒸水，1

mL

吐溫

。5.2.13 BCA

蛋白濃度測定試劑盒。5.2.14 ECL

化學(xué)發(fā)光顯色液。5.3 儀器設(shè)備5.3.1

離心機(jī)：最高轉(zhuǎn)速

000

r/min，最大容量

24×2

。5.3.2

電子天平：量程

0.001

g～100

g，感量

0.001

g。5.3.3

高壓滅菌鍋：使用溫度范圍

45

℃～

℃，最高使用壓力

0.255

。5.3.4

金屬水浴鍋：控溫范圍

℃～

5.3.5

穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：輸出電壓

0

V～600

V，輸出電流

0

mA～

mA。5.3.6

半干轉(zhuǎn)膜儀。5.3.7

化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)。5.4 樣品5.4.1 液態(tài)樣品取液態(tài)樣品50

，離心

000

g，5

，去除脂肪層，取上清液，待測或-80

℃以下保存。5.4.2 固態(tài)樣品稱取固態(tài)樣品5

g，加適量水溶解，定容至50

，制成液態(tài)樣品，隨后按照操作。5.5 試驗(yàn)步驟5.5.1 樣品蛋白濃度測定使用試劑盒測定樣品中的蛋白濃度。5.5.2 樣品制備分別取總蛋白含量為30

μg-1

μg

β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，加入5×SDS加樣緩沖液，

℃水浴

min。5.5.3 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）采用NY/T

1663—2008中的方法進(jìn)行SDS凝膠電泳。DB

37/T

4415—20215.5.4 轉(zhuǎn)膜按照SN/T

—2010中轉(zhuǎn)膜方法執(zhí)行。5.5.5 封閉將PVDF膜置于封閉液中，室溫水平搖動2

h或4

℃過夜。5.5.6 第一抗體結(jié)合在自封袋中加入適當(dāng)比例稀釋的兔抗牛β-乳球蛋白一抗抗體，放入PVDF膜，排凈氣泡后封口，室溫水平搖動2

h。5.5.7 洗膜用TBST溶液洗膜，10

min/次，3～55.5.8 第二抗體結(jié)合PVDF封口，室溫水平搖動1

h。5.5.9 洗膜用TBST溶液洗膜，10

min/次，3～55.5.10 顯影將ECL顯色液試劑A、B1

～2

min保存結(jié)果。5.6 結(jié)果判定與表述5.6.1 對照檢測結(jié)果分析β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品檢測到預(yù)期大?。?8

kD）的條帶，空白和陰性對照無特異性條帶，則表明Western-Blot檢測方法正常；否則，需重新檢測。5.6.2 樣品檢測結(jié)果判定與表述將樣品進(jìn)行SDS乳球蛋白特異性抗體進(jìn)行Western-Blot18

量處出現(xiàn)和β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品泳道中大小一致的條帶，判定該樣品含β-乳球蛋白，表述為“β-乳球18

kD--6 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA-蛋白定量檢測6.1原理在微孔板上預(yù)包被牛β-乳球蛋白抗體，樣品中的β-乳球蛋白與生物素標(biāo)記的β-乳球蛋白競爭性地和微孔中的抗體結(jié)合，然后加入親和素-辣根過氧化物酶偶聯(lián)物，加入顯色底物，終止液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取450

nm-再乘以稀釋倍數(shù)即可得出樣品中β-乳球蛋白的含量。DB

37/T

4415—20216.2 試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。6.2.1 水：GB/T

6682，三級。6.2.2 預(yù)包被

96

微孔板：已包被人乳鐵蛋白多克隆抗體的

96

孔板（8

孔×12

條）。6.2.3 100×生物素偶聯(lián)物：生物素標(biāo)記的牛β-乳球蛋白偶聯(lián)物，使用前用稀釋緩沖液稀釋

100

倍。6.2.4 100×親和素-辣根過氧化物酶偶聯(lián)物：使用前用稀釋緩沖液稀釋

6.2.5 1×PBS1.44

g磷酸氫二鈉，0.24

g磷酸二氫鉀，8

g氯化鈉和

g氯化鉀溶于800

蒸餾水中，濃鹽酸調(diào)整

至

7.4，加水定容至

1

L。6.2.6稀釋緩沖液：含有

1

%

的

緩沖液：將

1

g

100

mL

PBS

緩沖液中。6.2.7 洗滌緩沖液：含有

0.05

%吐溫

20

的

PBS

50

μL

吐溫

20

溶于

mL

PBS

緩沖液中，震蕩混勻。6.2.8 四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色底物。6.2.9 2

M

硫酸反應(yīng)終止液：10

98

%濃硫酸加入

60

mL

蒸餾水中，定容至

100

mL。6.2.10 β-

μg/mL，5

μg/mL，2.5

μg/mL，1.25

μg/mL，0.625

μg/mL，

μg/mL，0.156

μg/mL

濃度梯度制備β-沖液作為空白對照（0

μg/mL6.3 儀器設(shè)備6.3.1

離心機(jī)：最高轉(zhuǎn)速

000

r/min，最大容量

24×2

。6.3.2

電子天平：量程

0.001

g～100

g，感量

0.001

g。6.3.3

高壓滅菌鍋：使用溫度范圍

45

℃～

℃，最高使用壓力

0.255

。6.3.4

恒溫箱：溫控范圍為室溫

℃～80

6.3.5

酶標(biāo)儀：配備

濾光片。6.4 樣品按照5.4.1和5.4.21

-乳球蛋白含量優(yōu)化稀釋比例）。6.5 試驗(yàn)步驟6.5.1 準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需試劑，并平衡至室溫（20

℃～

6.5.2

μL

標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品。6.5.3 每孔加入

μL

生物素偶聯(lián)物，密封，37

℃孵育

min。6.5.4 吸凈孔中液體，每孔加入洗滌緩沖液

200

μL，浸泡

2

，吸凈孔中液體，重復(fù)

2

次，最后用吸水紙拍干。6.5.5 每孔加入

μL

親和素-辣根過氧化物酶偶聯(lián)物，密封，37

℃孵育

30

min。6.5.6按照

6.5.4

步驟洗板

5

6.5.7 每孔加入

μLTMB

顯色底物，避光，37

℃孵育

min。6.5.8每孔加入

μL

終止液，溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。酶標(biāo)儀

波長下讀取吸光度值。6.6 結(jié)果計算6.6.1 計算樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的平均吸光度值。6.6.2 以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為

軸，對應(yīng)的平均吸光度值為

軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。DB

37/T

4415—20216.6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線上樣品吸光度值對應(yīng)的β-乳球蛋白濃度，乘以樣品稀釋倍數(shù)，即為所測樣品中β-乳球蛋白含量。若檢測的β-乳球蛋白濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高濃度，對樣品進(jìn)行合適倍數(shù)稀釋后再檢測。計算公式如下：X=C×N式中：X——樣品中β-乳球蛋白含量，單位為μg/mL；C——樣品吸光度值對應(yīng)的β-g/mL；N——樣品稀釋倍數(shù)，本文件中使用的稀釋倍數(shù)為1

。6.7 檢出靈敏度本文件ELISA方法的檢出靈敏度為0.13

μg/mL。7 檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T

27403和GB/T

規(guī)定執(zhí)行。8 廢棄物的處理按照GB/T

規(guī)定執(zhí)行。DB

37/T

4415—2021

附 錄 A（資料性）PCR

擴(kuò)增的野生型牛β-乳球蛋白基因序列g(shù)cctctcgcatctgacacttgtgttcaaaccacccatgctggtgttcggggggccacctatggggaaggctcctcactgcaggggtgcccctgtcccctgagagatcagaagtcccagtctggatgtcgaatggccgagctccctccagaggctccagggagggatccttgccccctccgccgccgcctccagctcctggtgccgcacccttgggcccgatctcgtagacgcctcagtccagtctctgcctccgtgttcactggcattctccccatgtcccctctgtgtccccgttttctctcacaaggacaccggacataagattagcccccgttccagcatcacctgaacagctcacatctgtaaagacctagattccaaacaagattccatcctgaagttcctggtggacgtgagttctggagcgacgcccttcaaccccatcacagcttgcggttcatcgcaaaacacggaacctgggatttatcgtaaaacccaggttcttcgtgaaacactgagcttcgaggcttgttgcaagaattaaaggtgctaatacagatcagggcaaggaccgaagctggccaagcctcctctttccatcacaggaaagggaggtctgggggcggccgggggtctgctcccgtgggtgggctctttctggtacagtcaccaacagtctctccgggaaggaaaccagaggccagagagcaagccagagctagtctaggagatccctgagcctccacccaagatgccgaccagccagcgggccccctggaaagaccctacagtctagggggggaacaggagccgacccgccaggcccccgctatcaggagacaccccaaccttgctcctgttcccctaccccagtacgcccacccgacccctgagatgagtggtttacttgcttagaatgtcaattgaaggcttttgtaccccctttgccagtggcacagggcacccacagcccgctgggtactgatgcccatgtggactcagccaggaggactgtcctgcgccctccctgctcgggccccctccatactcagcgacacacccagcaccagcattcccaccactcctgaggtctgaaggcagctcgctgtggtctgagcggtgcggagggaagtgccctgggagatttaaaatgtgagaggtgggaggtgggaggttgggtcctgtaggccttcccatcccacgtgcctgcacggagccctagtgctactcagtcatgcccccgcagcacccctcaggtcactttcccatcctgggggttattatgactgttgtcattgttgttgcctttttgctaccctaactgggcagcgggtgcttgcagagccctcgatactgaccaggttcccccctcggagctcgacctgaaccccatgtcaccctcgccccagcctgcagagggtgaggtgactgcagagataccctttacccaaggccacagtcacatggtttggaggagatggtgcccaaggcagaagccaccctccaggacacacctgcccccagtgctggctctgacctgtccttgtctaagaggctgaccccagaagtgttcctggcgctggcagccagcctggacccagagcctggacaccccctgcgcccccacttctggggcgtaccaggaaccgtccaggcccagagggggcctTCCTGCTTGGCCTCGAATGGAAGAAGGCCTCCTATTGTCCTCGTAGAGGAAGCAACCCCAGGGCCCAAGGATAGGCCAGGGGGGATTCGGGGAACCGCGTGGCTGGGGGCCCGGCCCGGGCTGGCTGGCTGGCCCTCCTCCTGTATAAGGCCCCGAGCCCGCTGTCTCAGCCCTCCACTCCCTGCAGAGCTCAGAAGCGTGACCCCAGCTGCAGCCATGAAGTGCCTCCTGCTTGCCCTGGCCCTCACTTGTGGCGCCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGATATCCAGAAGGTTCGAGGGTGCCCGGGTGGGTGGTGAGTTCGAGGGCTGGCTGGGGAGCTGGGCCTCAGAGACCAAGGGAGGCTGTGACGTCTGGGATTCCCATCAGTCAGCTAGAGCCGCCTGACAAATCGCCCGCCACAGGCTTCAACCAGGCCTTTAGTGTCTTGCATTCTGGAGGCTGGAAGCTGCAATCCGGGCATCGGCCCAGCTGGCTTCTCCTGCGGCCACTCTCCGGGGAGCAGACAGCCATCTTCTCCCTGTGTCCTTTGCGTGCCCTGGTTTCCTCTTCCTGTGAGGTCACCAGGCCTGCTGGATCCACGCCCGCCCACACAGCCTCACGTAACCTTTGTCATCTCTTTAAAGGCCGTGTCTCCAGTCCTGTGTTGAGGTTCTGGGGGTTAATGGGACACAGTTCAGCCCCTAAAAGAGTCCGCTCTGCCCCTCAAATTTTCCCCACCTCCAGCTATGGTCTCCCCAAGATCCAAATGTTGCCACGTGTGCGGGGGCTCATCTGGGTCCCTCTTTGGGCTCAGAGTGAGTCTGGGGAGAGCATTCCTCAGGGTGCCGAGTTGGGGGGAGGCATCTCAGGGCTGCCCAGGCCAGGGTGGGACAGAGAGCCCACTGTGGGGCTGGGGGCCCCTTCCCGCCCCTGGAGTGCAGCTCAAGGTCCCTCCCCAGGTGGCGGGGACTTGGTACTCCTTGGCCATGGCGGCCAGCGACATCTCCCTGCTGGACGCCCAGAGTGCCCCCCTGAGAGTGTATGTGGAGGAGCTGAAGCCCACCCCTGAGGGCGACCTGGAGATCCTGCTGCAGAAATGGTGGGCGTCCCCCCCAAAAAAAGCATGGAACCCCCACTCCCCAGGGATATGGACCCCCCGGGGTGGGGTGCAGGAGGGACCAGGGCCCCAGGGCTGGGGAACGGGGCTTGGAGTTTCCTGGTACCCCTGGAGGTCCACCCAAGGCTGCTTATCCAGGGCTTTCTCTTTCTTTTTTTCCCCCAACTTTTATTAATTTGATGCTTCAGAACATCATCAAACAAATGAACACAAAACATCATTTTCGTTAACTTGGAAGGGGAGATAAAATCCACTGAAGTGGAAATGCATAGGAAAGATACATACAGTAAGGCAGGTATTCTGAATTCGCTGTTAGTTTGAGGATTACAAATGCACTTGAGCAACAGAGAGACGTTTTCATTATTTCTCGGTCTGAACAGCTCAGTATCTAAAATGAACAAGATGTCATGGAGACAAAGCCGGCGGGGGAGAGGCCCGTGTGAAGGCCGCTGGGCGTGCAGACCTGGGTCCTCGGGGCCCAGGCAGTTCCCACTACCAGCCCTGTCCACCCTCAGACGGGGGTCAGAGTGCAGGAGAGAGCTGGGTGGGTGTGGGGCAGAGATGGGGACCTGAACCCCAGGACTGCCTTTTGGGGTGCCTGTGGTCAAGGCTCTCCCCAACCTTTTCTCCCTGGCTCCATCTGACTTCTCCTGGCCCATCCACCCGGTCACCTGTGGCCCCAGAGGTGACAGTGAGTGCAGCCAAGGCCGGTTGGCCAGCCGGCCCCCTATGCCCACGCCACCCGCCTCCAGDB

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4415—2021CCCCTCCTGGGGCCGCCTTCTGCCCCTGGCCCTCAGTTCATCCTGATGAAAATGGTCCATGCCCGTGGCTCAGAAAGCAGCTGTCTTTCAGGGAGAACGGTGAGTGTGCTCAGAAGAAGATCATTGCAGAAAAAACCAAGATCCCTGCGGTGTTCAAGATCGATGGTGAGTGCTGGGTCCCCAGGGGACGCCCACCACCCCCCAGGGACTGTGGGCAGGTGCAGGGGGCTGGCGTCAGGCCCCGAGATGCTAAGGGGCTGGTGGTGATGAAGACACTGCCGTGCCACCTGCTTCCCTGGCCTCCCTGCCACCTGCCCGGGGCCTTGGGCCGGTGGCCGTGGGCAGGTCCCGGCTGGGCAGGTCTGACACCCCAGGGTGACACCCGAGCTCTCTTTGCTGAGGGTGGGGTGGTGCTCGGGGCCCTCAGGCTGAGCTCAGGAGGTCCCTGTGCCCACCCAGGGGTAACCGAGAGCCGCTGCCCGCTCCAGGGGTCCAGGTGCCCCACGATCCCAGCCCACCCCACGGCTCCTTCATCTCCTGAAGACGAACTCTGTCCGCCCTCGCTCATTCACTTGTTTGTCCTAAATCCAAGATGAGAAAGCTTCGAGGTGGGGTTGGGGTTCCATCAGGGCCTGCCCTTCCGCCGGGCAGCCTGGGCCACATCTGCCCTTGGCCTCTTCAGGACTCACTCTGACTGGAGGCCCTGCACTGACTGATGCCAGGGTGCCCAGCCCAGGGTCTCCTGTGCCATCCGGCTGCACGGGGTTTGGATGCTGGTCCTGCCCCCAAGCTGCCCAGACACTGCAGGGCAGCTGGGGCCACCCGCAGGCCTCGGTCAGGGAGAGCCCCAGCTGCCCCCGCTCAGCGCTGCCCCCCAACAATTCCCCAGTCCTCAGGACGCATCCCTCTTCCCTTGCTGGGCAGTGTTCAGCCCCACCCGAGATCGGGGAAGCCCTATTTCTTGACCACTCCGGTCCCTGGGGAGGGCGGCCTCAGACTCAGTGGTGAGTGTTCCCAAGTCCAGGAGGTGGTGGAGGGTCCCTGGCGGATCCAGAGTTGGGCTTCCAGAGTGAGGGCTTCCTGGGCCCCATGTGCCTGGCAGTGGCAGCAGGGAAGGGGCCACACCATTTTGGGGCTGGGGGATGCCAGAGGGCGCTCCCCACCCCGTCCTCACCAAGTGGTGACCCCGGGGGAGCCCCGCTGGTTGTGGGGGGTGCTGGGGGCTGACCAGAAACCCCCCTCCTGCTGGAACTCACTTTCCTCCCGTCTTGATCTCTTCCAGCCTTGAATGAGAACAAAGTCCTTGTGCTGGACACCGACTACAAAAAGTACCTGCTCTTCTGCATGGAGAACAGTGCTGAGCCCGAGCAAAGCCTGGCCTGCCAGTGCCTGGGTGGGTGCCAACCCTGGCTGCCCAGGGAGACCAGCTGTGTGGTCCTCGCTGCAACGGGGCCGGGGGGGACGGTGGGAGCAGGGAGCTTGATTCCCAGGAGGAGGAGGGATGGGGGGTCCCCGAGTCCCGCCAGGAGAGGGTGGTCATATACCGGGAGCCGGTGTCCTGGGGGCCTGTGGGTGACTGGGGACGGGGGCCAGACACACAGGCTGGGAGACGGGGGGCTGCAGCGCTCTGGTGTGACCATCACGATGGAGCCGGCGGTCACTATGAATCTAACAGCCTTTGTTACCGGGGAGTTTCAATTATTTCATCAAATAAGAACTCAGGCACAAAGCTGTCTTTCAACTGTCACGTCCTGAAAACAAATGGCAGGTGACATTTTCCATGCCATAGCAGTGCCACTGGGCATTTTCAGGGCCCATGTGCCAGGAGGGCGTGGGCATCGGCGAGTGGAGGCTCCTGGCCGTGTCAGCTGGCCCAGGGGGAGGAGGGGACCCAGACAGCCAGAGGTGGGGAGCAGGCTTTCCCCCTGTGACGCTGCAGACCCACCGCACTGCCCTGGGAGGAAGGGGAGGGAACTGGGCCAAGGGGGAAGGGCAGGTGTGCTGGAGGCCAAGGCAGACCTGCACACCACCCTGGAGAGCAGGGGTTGACCCCGTCCCGGCCCCACAGTCAGGACCCCGGAGGTGGACGACGAGGCCCTGGAGAAATTCGACAAAGCCCTCAAGGCCCTGCCCATGCACATCCGGCTGTCCTTCAACCCAACCCAGCTGGAGGGTGAGCACCCAGGCCCCACCCTGCTCCTGGGGCAGGAAGCCACCCGGCCCAGGACCACCTCCTCCCATGGTGACCCCCAGCTCCCCAGGCCTCCCGGGAGGATGGAGACGGGGTGCAGGGCCCCGAGGTGGCCCCCTCCCCACCCCCTCCCCAGCTCCCTCTGTCCTGGGGTGTCCAGTCCCATCCTGACGCTCCCCCGCCACGGCTCTCCCTCCCCCACAGAGCAGTGCCACATCTAGGTGAGCCCCTGCCGGCGCCTCTGGGGTAAGCTGCCTGCCCTGCCCCACGTCCTGGGCACACACATGGGGTAGGGGTTCTTGGTTGGGCCCGGGAGCCCCCATTAGGCCCTGGGGTCCCCCGTAGGAATGGCTGGAAGCTGGGGTCCTTCCTGGAGACTACAGAGCCGGCTGGCCACATGCTCGCTCTTGTGGGGTGACCTGTGTCCTGGCCTCACTCACACGCTGATCTCCTCCACCTCCTTCCTGGCAGACCTAAGGGCCAAGGTGGAGGGCTCAGGAAGTGACACCTAAGGGGGAGGCTAGGGGGGTCCTTCTCCCAAAGGAGGGGCCGTCCTGAATCCCCAGCCACGGACAGGCTGGCAAGGGTCTGGCAGGTACCCCAGGAATCACAGGGGAGCCCCATGTCCATTTCAGAGCCCGGGAGCCTTGGCCCCTCTGGGGACAGACGATGTCATCCCCGCCTGCCCCATCAGGGGACCAGGAGGAACCGGGACCACATTCACCCCTCCTGGGACCCAGGCCCCTCCAGGCCCCTCCTGGGGCCTCCTGCTTGGGGCCGCTCCTCCTTCAGCAATAAAGGCATAAACCTGTGCTCTCccttctgagtctttcctggatgatgggccgggggtggagaaggcccgggacagggtggggagtggtctggctcagaggatgatggtagggctgggatccagggcgtctgcattacagtcttgtgacatctgggggcccacacacatctacggctctttgaaact下劃線部分為引物序列位置；大寫字母部分為β乳球蛋白基因序列；大寫加粗斜體為起始密碼子，DB

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附 錄B（資料性）PCR

擴(kuò)增的

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缺失牛β-乳球蛋白基因序列g(shù)cctctcgcatctgacacttgtgttcaaaccacccatgctggtgttcggggggccacctatggggaaggctcctcactgcaggggtgcccctgtcccctgagagatcagaagtcccagtctggatgtcgaatggccgagctccctccagaggctccagggagggatccttgccccctccgccgccgcctccagctcctggtgccgcacccttgggcccgatctcgtagacgcctcagtccagtctctgcctccgtgttcactggcattctccccatgtcccctctgtgtccccgttttctctcacaaggacaccggacataagattagcccccgttccagcatcacctgaacagctcacatctgtaaagacctagattccaaacaagattccatcctgaagttcctggtggacgtgagttctggagcgacgcccttcaaccccatcacagcttgcggttcatcgcaaaacacggaacctgggatttatcgtaaaacccaggttcttcgtgaaacactgagcttcgaggcttgttgcaagaattaaaggtgctaatacagatcagggcaaggaccgaagctggccaagcctcctctttccatcacaggaaagggaggtctgggggcggccgggggtctgctcccgtgggtgggctctttctggtacagtcaccaacagtctctccgggaaggaaaccagaggccagagagcaagccagagctagtctaggagatccctgagcctccacccaagatgccgaccagccagcgggccccctggaaagaccctacagtctagggggggaacaggagccgacccgccaggcccccgctatcaggagacaccccaaccttgctcctgttcccctaccccagtacgcccacccgacccctgagatgagtggtttacttgcttagaatgtcaattgaaggcttttgtaccccctttgccagtggcacagggcacccacagcccgctgggtactgatgcccatgtggactcagccaggaggactgtcctgcgccctccctgctcgggccccctccatactcagcgacacacccagcaccagcattcccaccactcctgaggtctgaaggcagctcgctgtggtctgagcggtgcggagggaagtgccctgggagatttaaaatgtgagaggtgggaggtgggaggttgggtcctgtaggccttcccatcccacgtgcctgcacggagccctagtgctactcagtcatgcccccgcagcacccctcaggtcactttcccatcctgggggttattatgactgttgtcattgttgttgcctttttgctaccctaactgggcagcgggtgcttgcagagccctcgatactgaccaggttcccccctcggagctcgacctgaaccccatgtcaccctcgccccagcctgcagagggtgaggtgactgcagagataccctttacccaaggccacagtcacatggtttggaggagatggtgcccaaggcagaagccaccctccaggacacacctgcccccagtgctggctctgacctgtccttgtctaagaggctgaccccagaagtgttcctggcgctggcagccagcctggacccagagcctggacaccccctgcgcccccacttctggggcgtaccaggaaccgtccaggcccagagggggcctTCCTGCTTGGCCTCGAATGGAAGAAGGCCTCCTATTGTCCTCGTAGAGGAAGCAACCCCAGGGCCCAAGGATAGGCCAGGGGGGATTCGGGGAACCGCGTGGCTGGGGGCCCGGCCCGGGCTGGCTGGCTGGCCCTCCTCCTGTATAAGGCCCCGAGCCCGCTGTCTCAGCCCTCCACTCCCTGCAGAGCTCAGAAGCGTGACCCCAGCTGCAGCCATGAAGTGCCTCCTGCTTGCCCTGGCCCTCACTTGTGGCGCCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGATATCCAGAAGGTTCGAGGGTGCCCGGGTGGGTGGTGAGTTCGAGGGCTGGCTGGGGAGCTGGGCCTCAGAGACCAAGGGAGGCTGTGACGTCTGGGATTCCCATCAGTCAGCTAGAGCCGCCTGACAAATCGCCCGCCACAGGCTTCAACCAGGCCTTTAGTGTCTTGCATTCTGGAGGCTGGAAGCTGCAATCCGGGCATCGGCCCAGCTGGCTTCTCCTGCGGCCACTCTCCGGGGAGCAGACAGCCATCTTCTCCCTGTGTCCTTTGCGTGCCCTGGTTTCCTCTTCCTGTGAGGTCACCAGGCCTGCTGGATCCACGCCCGCCCACACAGCCTCACGTAACCTTTGTCATCTCTTTAAAGGCCGTGTCTCCAGTCCTGTGTTGAGGTTCTGGGGGTTAATGGGACACAGTTCAGCCCCTAAAAGAGTCCGCTCTGCCCCTCAAATTTTCCCCACCTCCAGCTATGGTCTCCCCAAGATCCAAATGTTGCCACGTGTGCGGGGGCTCATCTGGGTCCCTCTTTGGGCTCAGAGTGAGTCTGGGGAGAGCATTCCTCAGGGTGCCGAGTTGGGGGGAGGCATCTCAGGGCTGCCCAGGCCAGGGTGGGACAGAGAGCCCACTGTGGGGCTGGGGGCCCCTTCCCGCCCCTGGAGTGCAGCTCAAGGTCCCTCCCCAGGTGGCGGGGACTTGGTACTCCTTGGCCATGGCGGCCAGCGACATCTCCCTGCTGGACGCCCAGAGTGCCCCCCTGAGAGTGTATGTGGAGGAGCTGAAGCCCACCCCTGAGGGCGACCTGGAGATCCTGCTGCAGAAATGGTGGGCGTCCCCCCCAAAAAAAGCATGGAACCCCCACTCCCCAGGGATATGGACCCCCCGGGGTGGGGTGCAGGAGGGACCAGGGCCCCAGGGCTGGGGAACGGGGCTTGGAGTTTCCTGGTACCCCTGGAGGTCCACCCAAGGCTGCTTATCCAGGGCTTTCTCTTTCTTTTTTTCCCCCAACTTTTATTAATTTGATGCTTCAGAACATCATCAAACAAATGAACACAAAACATCATTTTCGTTAACTTGGAAGGGGAGATAAAATCCACTGAAGTGGAAATGCATAGGAAAGATACATACAGTAAGGCAGGTATTCTGAATTCGCTGTTAGTTTGAGGATTACAAATGCACTTGAGCAACAGAGAGACGTTTTCATTATTTCTCGGTCTGAACAGCTCAGTATCTAAAATGAACAAGATGTCATGGAGACAAAGCCGGCGGGGGAGAGGCCCGTGTGAAGGCCGCTGGGCGTGCAGACCTGGGTCCTCGGGGCCCAGGCAGTTCCCACTACCAGCCCTGTCCACCCTCAGACGGGGGTCAGAGTGCAGGAGAGAGCTGGGTGGGTGTGGGGCAGAGATGGGGACCTGAACCCCAGGACTGCCTTTTGGGGTGCCTGTGGTCAAGGCTCTCCCCAACCTTTTCTCCCTGGCTCCATCTGACTTCTCCTGGCCCATCCACCCGGTCACCTGTGGCCCCAGAGGTGACAGTGAGTGCAGCCAAGGCCGGTTGGCCAGCCGGCCCCCTATGCCCACGCCACCCGCCTCCAG10DB

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4415—2021CCCCTCCTGGGGCCGCCTTCTGCCCCTGGCCCTCAGTTCATCCTGATGAAAATGGTCCATGCCCGTGGCTCAGAAAGCAGCTGTCTTTCAGGGAGAACGGTGAGTGTGCTCAGAAGAAGATCATTGCAGAAAAAACCAAGATCCCTGCGGTGTTCAAGATCGATGGTGAGTGCTGGGTCCCCAGGGGACGCCCACCACCCCCCAGGGACTGTGGGCAGGTGCAGGGGGCTGGCGTCAGGCCCCGAGATGCTAAGGGGCTGGTGGTGATGAAGACACTGCCGTGCCACCTGCTTCCCTGGCCTCCCTGCCACCTGCCCGGGGCCTTGGGCCGGTGGCCGTGGGCAGGTCCCGGCTGGGCAGGTCTGACACCCCAGGGTGACACCCGAGCTCTCTTTGCTGAGGGTGGGGTGGTGCTCGGGGCCCTCAGGCTGAGCTCAGGAGGTCCCTGTGCCCACCCAGGGGTAACCGAGAGCCGCTGCCCGCTCCAGGGGTCCAGGTGCCCCACGATCCCAGCCCACCCCACGGCTCCTTCATCTCCTGAAGACGAACTCTGTCCGCCCTCGCTCATTCACTTGTTTGTCCTAAATCCAAGATGAGAAAGCTTCGAGGTGGGGTTGGGGTTCCATCAGGGCCTGCCCTTCCGCCGGGCAGCCTGGGCCACATCTGCCCTTGGCCTCTTCAGGACTCACTCTGACTGGAGGCCCTGCACTGACTGATGCCAGGGTGCCCAGCCCAGGGTCTCCTGTGCCATCCGGCTGCACGGGGTTTGGATGCTGGTCCTGCCCCCAAGCTGCCCAGACACTGCAGGGCAGCTGGGGCCACCCGCAGGCCTCGGTCAGGGAGAGCCCCAGCTGCCCCCGCTCAGCGCTGCCCCCCAACAATTCCCCAGTCCTCAGGACGCATCCCTCTTCCCTTGCTGGGCAGTGTTCAGCCCCACCCGAGATCGGGGAAGCCCTATTTCTTGACCACTCCGGTCCCTGGGGAGGGCGGCCTCAGACTCAGTGGTGAGTGTTCCCAAGTCCAGGAGGTGGTGGAGGGTCCCTGGCGGATCCAGAGTTGGGCTTCCAGAGTGAGGGCTTCCTGGGCCCCATGTGCCTGGCAGTGGCAGCAGGGAAGGGGCCACACCATTTTGGGGCTGGGGGATGCCAGAGGGCGCTCCCCACCCCGTCCTCACCAAGTGGTGACCCCGGGGGAGCCCCGCTGGTTGTGGGGGGTGCTGGGGGCTGACCA