志賀菌敏感株與誘導(dǎo)耐多藥株蛋白質(zhì)組學(xué)分析

志賀菌敏感株與誘導(dǎo)耐多藥株蛋白質(zhì)組學(xué)分析【摘要】目的對(duì)志賀菌敏感株與誘導(dǎo)耐多藥株全菌蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)比較，尋找細(xì)菌耐多藥相關(guān)蛋白。方法采用4類(lèi)抗生素的次抑菌濃度，對(duì)臨床分離鑒定的志賀菌敏感株進(jìn)行誘導(dǎo)耐多藥試驗(yàn)；對(duì)志賀菌敏感株及誘導(dǎo)耐多藥株全菌蛋白進(jìn)行雙向電泳；電泳圖譜采用ImageMaster2DPlatinum軟件分析；差異表達(dá)蛋白進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜分析。結(jié)果成功獲得志賀菌誘導(dǎo)耐多藥株，在志賀菌敏感株與耐多藥株全菌蛋白質(zhì)圖譜中分別檢測(cè)出個(gè)和個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)；共發(fā)現(xiàn)48個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，其中5個(gè)質(zhì)譜鑒定為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶、天冬氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶、翻譯延長(zhǎng)因子Tu、單鏈DNA結(jié)合蛋白；其中前3個(gè)蛋白中在耐多藥株中表達(dá)量增強(qiáng)，后2個(gè)減弱。結(jié)論5個(gè)耐多藥相關(guān)蛋白中在細(xì)胞代謝中起重要作用的酶類(lèi)表達(dá)量上調(diào)；ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在志賀菌誘導(dǎo)耐多藥機(jī)制中起重要作用。

【關(guān)鍵詞】志賀菌

近年來(lái)，隨著抗生素的廣泛使用甚至濫用，造成志賀菌頻繁發(fā)生變異，產(chǎn)生耐藥株，且耐藥率高、耐藥產(chǎn)生速度快、耐藥范圍廣，給細(xì)菌性痢疾的防治帶來(lái)新的挑戰(zhàn)，因此，深入探討志賀菌的耐多藥機(jī)制成為目前解決志賀菌耐多藥的先決條件。本課題選用對(duì)抗生素敏感的1株志賀菌，以自身藥物誘導(dǎo)方式構(gòu)建出多重耐藥菌株，通過(guò)比較敏感株與藥物自身誘導(dǎo)耐多藥株蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，觀察與志賀菌耐多藥相關(guān)蛋白，并對(duì)部分表達(dá)差異蛋白進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(MOLDITOF-TOF)分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,旨在探索其耐多藥機(jī)制。結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

11材料

111菌株(1)福氏痢疾桿菌標(biāo)準(zhǔn)株：菌株號(hào)51571-9；(2)敏感株：采用改良K-B紙片法，從臨床分離鑒定的志賀菌株中，篩選1株對(duì)頭孢噻吩(CF）、諾氟沙星、慶大霉素、磺胺甲基異惡唑均敏感的福氏志賀菌作為敏感株。誘導(dǎo)耐多藥株：使用志賀菌標(biāo)準(zhǔn)株和分離出的敏感株，參考文獻(xiàn)〔1〕的次抑菌濃度(1/2MIC)誘導(dǎo)耐多藥方法，建立誘導(dǎo)耐多藥株。

112試劑與儀器頭孢噻吩等抗生素均為標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品檢驗(yàn)中心)。固相pH梯度干膠條；IPG緩沖液、IPG覆蓋液、兩性電解質(zhì)pharmalyte(pH3～10)、3-［(3-膽酰胺丙基)-乙二胺］-1-丙磺酸(3-［(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio］-1-propanesulfonate,CHAPS)(美國(guó)AmershamPharmacia公司)。丙烯酰胺、尿素、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、蛋白酶抑制劑丙甲基磺酰氟、亮抑蛋白酶肽(美國(guó)Sigma公司)。固相pH梯度等電聚焦儀IPGphorIEFSystem,垂直板電泳儀、ImageScanner光密度掃描儀、圖像分析系統(tǒng)。

12方法

121蛋白質(zhì)雙向電泳蛋白提取方法：采用超聲兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解提取法〔2〕,略作改進(jìn)?？扇苄钥偟鞍锥浚簯?yīng)用BradFord法〔3〕對(duì)提取的可溶性總蛋白進(jìn)行定量；第一相固相pH梯度等電聚焦:按文獻(xiàn)〔4〕,程序分別為30V7h，60V7h，150V05h，300V1h，600V1h，8000V12h。平衡：按文獻(xiàn)〔3〕。第二相垂直板SDS電泳：按文獻(xiàn)〔3〕。染色：銀染按AmershamBioscience的銀染方案稍作改進(jìn)〔4〕?？捡R斯亮藍(lán)染色按Neuhoff等的方法進(jìn)行〔5〕。圖像掃描分析：用AmershamBioscience的掃描儀投射掃描，分辨率為300dpi。數(shù)字化圖像文件運(yùn)用ImageMaster2DPlatinum軟件分析。圖像分析過(guò)程包括蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)、量化、背景扣除、匹配。蛋白質(zhì)斑點(diǎn)經(jīng)自動(dòng)檢測(cè)后進(jìn)行手工校對(duì)，匹配之前先選一塊膠作為參考凝膠，其他凝膠都與之匹配。

122質(zhì)譜分析質(zhì)譜樣品制備：比較雙向電泳圖譜，找到差異蛋白，切下1mm×1mm×1mm，置于15ml的Eppendorf管中,按文獻(xiàn)〔6〕方法處理樣品。(2)質(zhì)譜鑒定:樣品按照1∶1的比例,與含有α-氰基-羥基苯丙烯酸的50%乙腈/01%甲酸的溶液混合。所有質(zhì)譜在4700型MALDITOF-TOF蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)下獲得。選擇反射式陽(yáng)離子捕獲方式，質(zhì)量精確度為50mg/L;MS光譜質(zhì)量范圍800～4000Da。

123數(shù)據(jù)庫(kù)檢索光譜在全球蛋白服務(wù)工作站進(jìn)行處理和分析；搜索在NCBInr蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行；鑒定GPS可信區(qū)間應(yīng)95％。搜索參數(shù)設(shè)置：相對(duì)分子質(zhì)量誤差范圍±20%，肽片段相對(duì)分子質(zhì)量誤差范圍±05Da，每個(gè)肽允許有1個(gè)不完全裂解位點(diǎn)，物種選擇細(xì)菌；蛋白質(zhì)身份確定：根據(jù)搜索結(jié)果并結(jié)合蛋白質(zhì)在凝膠上的等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行最終確定；要求肽段覆蓋率15%，匹配肽段至少4個(gè)，等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量與觀察值基本相符。

2結(jié)果

21次抑菌濃度(1/2MIC)誘導(dǎo)耐多藥結(jié)果志賀菌出發(fā)菌的抑菌濃度分別為頭孢噻吩32mg/L，諾氟沙星05mg/L，慶大霉素2mg/L，磺胺甲基異惡唑512mg/L。將此出發(fā)菌在1/2MIC的LB培養(yǎng)基中傳代，最終得到MIC≥4倍誘導(dǎo)前的耐多藥菌株，分別是出發(fā)菌株的6，6，8，8倍。

22蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜比較(1)敏感株：相同實(shí)驗(yàn)條件及參數(shù)設(shè)置情況下,對(duì)志賀菌可溶性總蛋白重復(fù)3次進(jìn)行雙向電泳分離，發(fā)現(xiàn)3次雙向電泳圖譜非常相似，蛋白質(zhì)上樣量為100μg，pH3～10,24cm線性干膠條通過(guò)ImageMaster2DPlatinum分析軟件對(duì)其進(jìn)行點(diǎn)檢測(cè)，獲得(946±37)個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)(圖1)。(2)誘導(dǎo)耐多藥株：對(duì)志賀菌誘導(dǎo)耐多藥株可溶性總蛋白重復(fù)3次進(jìn)行雙向電泳分離，獲得3塊凝膠的平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為1096±189。經(jīng)過(guò)背景消減后，將其中1塊凝膠作為參考凝膠進(jìn)行匹配，匹配點(diǎn)數(shù)為1078±26，其匹配率為9836％。

232種菌株蛋白質(zhì)差異表達(dá)譜分析以誘導(dǎo)耐多藥株雙向凝膠圖譜為參考凝膠，與敏感株進(jìn)行匹配，匹配蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為637±16，匹配率為6879％，共發(fā)現(xiàn)48個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)(表達(dá)量相差5倍以上的點(diǎn)為差異蛋白質(zhì)點(diǎn))，其中8個(gè)蛋白點(diǎn)只存在于誘導(dǎo)耐多藥株中，8個(gè)蛋白點(diǎn)只存在于敏感株中；在2種菌株中表達(dá)量相差5倍以上的32個(gè)蛋白點(diǎn)中，有26個(gè)蛋白點(diǎn)隨著志賀菌由敏感株向耐多藥株轉(zhuǎn)變而表達(dá)量增加，其余6個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量下降。蛋白質(zhì)上樣量100μg;第一向pH3～10，24cm非線性干膠條；

第二向應(yīng)用125%聚丙烯酰胺凝膠(銀染)

圖1志賀菌敏感株蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜

蛋白質(zhì)上樣量100μg;第一向pH3～10，24cm非線性干膠條；第二向應(yīng)用125%聚丙烯酰胺凝膠(銀染)

圖2志賀菌誘導(dǎo)耐多藥株蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜

圖3志賀菌敏感株與誘導(dǎo)耐多藥株的差異表達(dá)蛋白

24質(zhì)譜鑒定在考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠上選取5個(gè)差異點(diǎn)進(jìn)行肽指紋圖譜鑒定，結(jié)果可見(jiàn)，200，201，98號(hào)蛋白點(diǎn)表達(dá)量增加，72，14號(hào)表達(dá)量下降。

表1差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

3討論

三磷酸腺苷-組合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-Bmdingcassettestransparters,ABC)外排系統(tǒng)為細(xì)菌耐多藥主動(dòng)流出機(jī)制之一，腫瘤細(xì)胞膜上此蛋白過(guò)量表達(dá)，以便藥物順利進(jìn)入細(xì)胞并很快被泵出，形成多樣抗藥性〔7,8〕。陳川等〔9〕在研究嗜水氣單胞菌耐四環(huán)素的蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)發(fā)現(xiàn)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在耐藥株中表達(dá)量顯著增加；BoriesC等〔10〕在研究利什曼原蟲(chóng)的藥物作用原理及抗藥性中發(fā)現(xiàn)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在利什曼原蟲(chóng)的抗藥性中起重要作用；SiposG等〔11〕也發(fā)現(xiàn)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子在真菌的多藥耐受性中起重要作用。本文結(jié)果顯示，98號(hào)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATPbindingcassettetransporterprotei

n)在志賀菌誘導(dǎo)耐多藥株中表達(dá)量上調(diào)，表明雖然ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也存在于志賀菌敏感株中，但在志賀菌誘導(dǎo)耐多藥株中表達(dá)量明顯增加，將結(jié)構(gòu)不同藥物泵出胞外，導(dǎo)致胞內(nèi)藥物達(dá)不到有效濃度而導(dǎo)致細(xì)菌耐多藥，可見(jiàn)此蛋白在志賀菌的耐多藥機(jī)制中也起重要作用。本文結(jié)果還顯示，200號(hào)谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶表達(dá)量增加，提示在長(zhǎng)期低濃度藥物誘導(dǎo)作用下，轉(zhuǎn)肽酶參與的生物代謝反應(yīng)中形成的一些生物介質(zhì)可能在誘導(dǎo)耐多藥過(guò)程中起重要作用，從而使此酶的表達(dá)量增加，以滿足細(xì)胞在應(yīng)急條件下生存所必需。從雙向電泳圖譜來(lái)看，201號(hào)天冬氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶在誘導(dǎo)耐多藥株中明顯發(fā)生位移，分子量及等電點(diǎn)均增加，表達(dá)量也有所提高，推測(cè)在藥物誘導(dǎo)過(guò)程中，該酶可能發(fā)生某些基團(tuán)的修飾作用，以適應(yīng)新環(huán)境而生存。2006年，Tian-YiYing等〔12〕對(duì)福氏2a志賀菌2457T的外膜免疫性蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳肽指紋圖譜分析及蛋白印跡法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)翻譯延長(zhǎng)因子Tu是志賀菌的外膜抗原蛋白。本次結(jié)果表明，14號(hào)EF-Tu在志賀菌的誘導(dǎo)耐多藥株中表達(dá)量降低，可能是其基因調(diào)控序列在長(zhǎng)期藥物誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)生變異，使產(chǎn)物的表達(dá)量降低，或可能另一類(lèi)能調(diào)節(jié)EF-Tu的翻譯延長(zhǎng)因子Ts表達(dá)量降低，從而使EF-Tu活性降低，以適應(yīng)細(xì)胞在不利環(huán)境環(huán)境中生存。72號(hào)單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)在敏感株向耐多藥株轉(zhuǎn)變過(guò)程中表達(dá)量也有所下降。本文從全蛋白組角度探討了志賀菌的耐多藥機(jī)制，選擇志賀菌敏感株作為實(shí)驗(yàn)菌株，通過(guò)藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生誘導(dǎo)耐多藥株，排除了因菌株不同而導(dǎo)致的差異，可比性好。后續(xù)研究可能會(huì)發(fā)現(xiàn)

〔1〕蘇林光,賈杰,潘光華.次抑菌濃度的藥物誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥與交叉耐藥［J］.中國(guó)抗生素雜志,1997,22(4):301-303.

〔2〕賈繼輝,于修平,郭輝玉,等.幽門(mén)螺桿菌蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜的構(gòu)建及其相關(guān)技術(shù)體系的建立［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2003,41(3):225-227.

〔3〕MarshakDR,KadonagajT,BurgessRR,etal.蛋白質(zhì)純化與鑒定實(shí)驗(yàn)指南［M］//朱厚礎(chǔ),譯.北京:科學(xué)出版社,2000：158-159.

〔4〕BerkelmanT,StenstedtelectrophoresisusingimmobilizedpHgradients:principles&Methods［M］.AmershamPharmaciaBiotechIncPress,1998：36.

〔5〕NeuhoffV,AroldN,TaubeD,etstainingofproteinsinpolyacrylamidegelsincludingisoelectricfocusinggelswithclearbackgroundatnanogramsensitivityusingCoomassieBrilliantBlueG-250andR-250［J］.Electrophoresis,1998,9:255-262.

〔6〕ShevchenkoA,WilmM,VormO,etspectrometricsequencingofproteinsSil-stained［J］.AnalChem,1996,68:850-858.

〔7〕JohnstoneRW,RuefliAA,SmythphysiologicalfunctionsformultidrugtransporterP-glycoprotein［J］.TrendsBiochemSci，2000，25(1):1-6.

〔8〕Kimandxenobioticdisposition［J］.Toxicology,2002,181:291-297.

〔9〕陳川,王三英,彭宣憲.嗜水氣單胞菌耐四環(huán)素的白質(zhì)組學(xué)初步研究［J］.微生物學(xué)報(bào),2004,44(3):396-398.

〔10〕LoiseauPM,Boriesofdrugactionanddrugresistanceinleishmaniaasbasisfortherapeutictargetidentificationanddesignofantileishmanialmodulators［J］.CurrTopMedChem，2006，6(5):539-550.

〔11〕SiposG,Ku