噻托溴銨文獻(xiàn)報(bào)告課件

噻托溴銨對(duì)哮喘模型小鼠氣道炎癥與氣道重塑的治療作用Effectoftiotropiumbromideonairwayinflammationandremodelinginamousemodelofasthma

From：ClinicalandExperimentalAllergy前言

支氣管哮喘是一種有嗜酸性粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞參與的以氣道慢性炎癥為特征的疾病。這種氣道炎癥是易感者對(duì)各種激發(fā)因子具有氣道反應(yīng)性，并可引起氣道狹窄，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性的喘息、呼吸困難、胸悶或咳嗽等癥狀。其存在的病因雜而多，包括遺傳的、環(huán)境的、藥物的、精神的等等。前言哮喘的發(fā)病機(jī)制歸結(jié)為四種：①變態(tài)反應(yīng)②氣道炎癥③氣道高反應(yīng)性④神經(jīng)機(jī)制研究背景一、哮喘特征：①氣流阻塞②氣道炎癥性③氣道高反應(yīng)性

二、炎癥細(xì)胞：①肥大細(xì)胞②淋巴細(xì)胞③嗜酸性粒細(xì)胞研究背景一、哮喘的典型活性介質(zhì)：①IL—4②IL—5③IL—13

④IFN—γ⑤TGF—β二、活性介質(zhì)與哮喘的關(guān)系：①與Th1細(xì)胞的關(guān)系②與Th2細(xì)胞的關(guān)系③與嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）的關(guān)系研究背景

噻托溴銨(商品名思立華)是目前世界上推崇的新型抗膽堿能藥物，它是一種季銨類抗膽堿能類支氣管擴(kuò)張劑，對(duì)支氣管擴(kuò)張作用可持續(xù)24小時(shí)，明顯改善喘鳴及氣促的癥狀，顯著提高肺功能。因而，本實(shí)驗(yàn)的目的是評(píng)估噻托溴銨是否可以抑制哮喘模型小鼠變態(tài)反應(yīng)導(dǎo)致的急性與慢性氣道炎癥、Th2類型細(xì)胞因子產(chǎn)生以及氣道重塑。實(shí)驗(yàn)流程圖檢測(cè)指標(biāo)動(dòng)物造模記錄并分析結(jié)果

給藥↘↓↓↓↓BALF肺病理氣道反應(yīng)離體細(xì)胞PBMCs急性和慢性氣道炎癥小鼠模型的建立↑Day0↑Day12↑Day0↑Day12↑↑↑Day21-23Day23-26↓↓↓↓↑↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↑↑↑Day21-63↑↑↑↑<SensitizationwithOVA>50μg/mouseOVAi.p.↓<TreatmentwithTiotropium>0.1mM(50μg/mL)Inhalationfor3min/mouse

↑<ChallengewithOVA>2.5%OVAinhalationfor20min/mouse氣道反應(yīng)的測(cè)量操作流程：麻醉小鼠→插管→裝箱→測(cè)量→記錄結(jié)果計(jì)算公式：(吸入5-羥色胺后的氣道阻力/

吸入前的氣道阻力)×100%肺組織病理分析

操作流程：提取BALF后→打開胸腔→剪取肺組織→

PBS浸泡過(guò)夜→乙醇脫水→包蠟→染色顯微鏡觀察→分析指標(biāo)—上皮細(xì)胞增生、氣道平滑肌增生、膠原纖維沉積、M3受體脾細(xì)胞因子的測(cè)量操作流程：分離脾細(xì)胞→懸浮培養(yǎng)→添加噻托溴銨→

OVA（100μg/mL)刺激→獲取培養(yǎng)上清液→測(cè)量細(xì)胞因子培養(yǎng)液成分：RPMI1640、胎兒牛血清和抗生素細(xì)胞懸浮濃度：4.0×106個(gè)/mL.人類外周血單核細(xì)胞因子的測(cè)量操作流程：獲取患者全血→分離PBMC

→細(xì)胞培養(yǎng)→植物血凝素（PHA）激發(fā)→噻托溴銨治療→獲取細(xì)胞培養(yǎng)液上清→

ELISA測(cè)量IL—5與IL—13分離方法：運(yùn)用淋巴細(xì)胞分離器采取密度梯度離心法實(shí)驗(yàn)結(jié)果一、對(duì)氣道炎癥反應(yīng)的影響①噻托溴銨能有效地防止變態(tài)反應(yīng)導(dǎo)致的急性炎癥反應(yīng)②噻托溴銨能同樣有效地抑制慢性哮喘模型小鼠的炎癥反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果三、對(duì)氣道重塑的作用氣道重塑涉及到上皮細(xì)胞增生、嗜酸性粒細(xì)胞募集、

α-肌動(dòng)蛋白增多、氣道纖維化等病理改變，因而，可以從這幾項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)噻托溴銨對(duì)氣道重塑的改善作用。同時(shí)由于M3受體的發(fā)現(xiàn)，為闡明其作用機(jī)制提供可能的依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果四、慢性哮喘模型小鼠氣道高反應(yīng)性氣道高反應(yīng)性是哮喘的典型特征，尤其在慢性哮喘中表現(xiàn)明顯，這可通過(guò)測(cè)量氣道阻力來(lái)反映是否具有氣道高反應(yīng)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、對(duì)患者外周血單核細(xì)胞因子的含量的影響

選取哮喘典型的細(xì)胞因子IL—5與IL—13，從臨床患者的角度直接考察噻托溴銨的治療作用。討論一、改善氣道重塑的可能作用機(jī)制

實(shí)驗(yàn)結(jié)果已證實(shí)噻托溴銨能抑制急性與慢性氣道炎癥、降低Th2類型細(xì)胞因子水平，而Th2類型細(xì)胞因子能直接誘導(dǎo)上皮細(xì)胞增生，同時(shí)，上皮細(xì)胞增生是氣道重塑的重要因素，因而其改善氣道重塑可能與其抑制T細(xì)胞分泌Th2類型細(xì)胞因子有一定的關(guān)聯(lián)。另外，TGF-β能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖、分化以及肌纖維母細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成、粘蛋白的形成。因此,降低TGF-β1的生成，也可能與噻托溴銨改善氣道重塑有直接或間接的關(guān)系。

討論二、對(duì)Th2類型細(xì)胞因子可能作用機(jī)制體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)噻托溴銨對(duì)IL—5、IL—13與IFN—γ具有直接抑制作用，但I(xiàn)L—4的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)卻有明顯的區(qū)別，這表明其并非直接作用于IL—4，而IL—4在哮喘發(fā)生發(fā)展中具有重要的調(diào)控作用，因而需要進(jìn)一步研究其對(duì)IL—4的作用機(jī)制。另外，血漿中IgE濃度變化實(shí)驗(yàn)已證實(shí)噻托溴銨的抗炎作用只局限于氣道，并非全身。還有乙酰膽堿能促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，但體外實(shí)驗(yàn)是在缺乏乙酰膽堿下進(jìn)行的，這表明抑制T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)并不只局限于拮抗受體作用。討論三、與M3受體的作用實(shí)驗(yàn)已證實(shí)模型小鼠的M3受體出現(xiàn)在氣道平滑肌細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及嗜酸性粒細(xì)胞上，由于M3受體的輔助，噻托溴銨對(duì)氣道炎癥具有廣譜作用，因此，這促使我們?nèi)パ芯苦缤袖邃@