用熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)及觀察口腔上皮細(xì)胞的

實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理儀器、材料與試劑實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)報(bào)告及思考題第1頁(yè)/共22頁(yè)第一頁(yè)，共23頁(yè)。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鉄晒怙@微鏡的基本構(gòu)造和基本光路了解熒光探針Hoechst33258或33342與細(xì)胞成分的結(jié)合特性和光譜特性第2頁(yè)/共22頁(yè)第二頁(yè)，共23頁(yè)。熒光顯微鏡第3頁(yè)/共22頁(yè)第三頁(yè)，共23頁(yè)。什么是熒光?

物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長(zhǎng)波光。一種光化熒光第4頁(yè)/共22頁(yè)第四頁(yè)，共23頁(yè)。熒光的種類自發(fā)熒光次生熒光自發(fā)熒光：物質(zhì)受光激發(fā)產(chǎn)生的固有熒光次生熒光：物質(zhì)借熒光色素受光激發(fā)產(chǎn)生的熒光第5頁(yè)/共22頁(yè)第五頁(yè)，共23頁(yè)。熒光的性質(zhì)吸收光保持固有的熒光特性熒光波長(zhǎng)＞激發(fā)波長(zhǎng)（STOKES法則）熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度有不同程度的衰減熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率第6頁(yè)/共22頁(yè)第六頁(yè)，共23頁(yè)。落射熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡汞燈紫外線保護(hù)罩孔徑光欄（FS）視場(chǎng)光欄（AS）第7頁(yè)/共22頁(yè)第七頁(yè)，共23頁(yè)。落射熒光顯微鏡各部件特性和作用

汞燈光源:提供激發(fā)光(UV、B、G)

激發(fā)濾色鏡:波長(zhǎng)選擇nmT%BANDPASS第8頁(yè)/共22頁(yè)第八頁(yè)，共23頁(yè)。第9頁(yè)/共22頁(yè)第九頁(yè)，共23頁(yè)。第10頁(yè)/共22頁(yè)第十頁(yè)，共23頁(yè)。落射熒光顯微鏡原理汞燈激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡物鏡

標(biāo)本第11頁(yè)/共22頁(yè)第十一頁(yè)，共23頁(yè)。第12頁(yè)/共22頁(yè)第十二頁(yè)，共23頁(yè)。第13頁(yè)/共22頁(yè)第十三頁(yè)，共23頁(yè)。濾色鏡的選擇熒光素的特性濾色鏡的特性激發(fā)分色吸收—根據(jù)熒光素和濾色鏡的特性選擇濾色鏡第14頁(yè)/共22頁(yè)第十四頁(yè)，共23頁(yè)。實(shí)驗(yàn)原理

熒光顯微鏡技術(shù)是利用一定波長(zhǎng)的光（通常是波長(zhǎng)短的紫外光和藍(lán)紫光）照射被檢樣品，樣品獲得能量，產(chǎn)生能量躍遷，從基態(tài)到汽激發(fā)態(tài)，再?gòu)募ぐl(fā)態(tài)回到原態(tài)，放出光和熱能，產(chǎn)生的光為波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光（相對(duì)于激發(fā)光波長(zhǎng)），此可見光稱為熒光。通過物鏡、目鏡的成像、放大，以供觀察、檢測(cè)和拍攝。

第15頁(yè)/共22頁(yè)第十五頁(yè)，共23頁(yè)。

熒光顯微鏡要求有特殊的光源提供足夠強(qiáng)度和較短波長(zhǎng)的激發(fā)光，誘發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光。視野中所看到的像，主要是樣品的熒光映像。熒光顯微鏡技術(shù)是在光學(xué)顯微鏡水平上對(duì)蛋白質(zhì)和亞細(xì)胞組分進(jìn)行定位的最常用的方法之一。非免疫熒光探針可用來直接標(biāo)記許多特殊的亞細(xì)胞組分及生物大分子。這些探針大多數(shù)能被活細(xì)胞直接攝取并摻入和聚集在特定的細(xì)胞器中，因此我們就可以通過熒光顯微鏡對(duì)這些細(xì)胞器進(jìn)行觀察。第16頁(yè)/共22頁(yè)第十六頁(yè)，共23頁(yè)。Hoechst33258是一種親脂性物質(zhì)，可跨膜進(jìn)入活細(xì)胞，與DNA特異性結(jié)合，它主要結(jié)合在富含AT區(qū)域的DNA小溝部分。結(jié)合DNA后熒光大大增強(qiáng)，最大激發(fā)光波長(zhǎng)約為350nm,最大發(fā)射光波長(zhǎng)約為461nm?？捎糜诨罴?xì)胞觀察，不需要對(duì)細(xì)胞作固定及透化處理。第17頁(yè)/共22頁(yè)第十七頁(yè)，共23頁(yè)。儀器、材料與試劑儀器：熒光顯微鏡，材料：口腔粘膜上皮細(xì)胞，載玻片，牙簽試劑：PBS(pH7.4)Ho.33258orH.33342（10μg/mL，溶于PBS)

第18頁(yè)/共22頁(yè)第十八頁(yè)，共23頁(yè)。

實(shí)驗(yàn)步驟在1張載玻片上分別滴加一滴PBS溶液用牙簽刮取口腔上皮細(xì)胞，分別涂于載玻片上（牙簽在液滴中攪勻）在涂細(xì)胞處分別滴加10μg/mL的Hoechst.33342蓋片——室溫暗處孵育2-3分鐘用紫外光激發(fā)，觀看細(xì)胞DNA熒光第19頁(yè)/共22頁(yè)第十九頁(yè)，共23頁(yè)。注意事項(xiàng)蓋片時(shí)防止產(chǎn)生氣泡滴加的染料不宜太多，否則背景太深，影響觀察注意避光，包括制片、熒光觀察和探針保存操作時(shí)防止污染皮膚和環(huán)境第20頁(yè)/共22頁(yè)第二十頁(yè)，共23頁(yè)。口腔粘膜上皮.jpg第21頁(yè)/共22頁(yè)第二十一頁(yè)，共23頁(yè)。感謝您的觀看！第22頁(yè)/共22頁(yè)第二十二頁(yè)，共23頁(yè)。內(nèi)容總結(jié)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。了解熒光探針Hoechst33258或33342與細(xì)胞成分的結(jié)合特性和光譜特性。熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度。提供激發(fā)光(UV、B、G)?！鶕?jù)熒光素和濾色鏡的特性選擇濾色鏡。通過物鏡、目鏡的成像、放大