南京大學(xué)分子生物學(xué)3-4講課件

1，衛(wèi)星DNA：有些高度重復(fù)DNA序列的堿基組成和浮力密度同主體DNA有區(qū)別，在浮力密度梯度離心時，可形成不同于主DNA帶的，此類DNA稱為衛(wèi)星DNA。2，衛(wèi)星DNA的分類

分類長度重復(fù)單位染色體定位大?。╞p）

衛(wèi)星DNA100kb~數(shù)Mb衛(wèi)星序列2和35整個染色體衛(wèi)序列125~48大多數(shù)染色體著絲點和其他異染色質(zhì)區(qū)域α171所有染色體著絲點β（Sau3A家族）681，9，13~15，21，22及Y染色體的著絲點小衛(wèi)星DNA0.1~20kb端粒家族6所有染色體端粒高變家族9~24所有染色體通?？拷肆Ｎ⑿l(wèi)星DNA

小于150bp1~4所有染色體3，核基因編碼的蛋白細胞器專用的蛋白質(zhì)合成機器組分，及其他蛋白質(zhì)。在細胞質(zhì)中合成好后輸入細胞器（二）酵母線粒體基因的特點1，存在大量非編碼區(qū)2，兩個rRNA基因中，21SrRNA基因有一個內(nèi)元3，細胞色素基因和細胞色素氧化酶亞基1基因是不連續(xù)基因（三）人類線粒體的分子遺傳學(xué)特點1，基因的組織情況（1）有37個基因13個蛋白質(zhì)基因2個rRNA基因22個tRNA基因（2）DNA利用效率極高2，轉(zhuǎn)錄大部分基因（28個）從重鏈上轉(zhuǎn)錄兩條鏈的轉(zhuǎn)錄各產(chǎn)生一個轉(zhuǎn)錄元tRNA基因位于蛋白質(zhì)和rRNA基因之間，其產(chǎn)物在轉(zhuǎn)錄后處理中的起重要作用rRNA的合成多于mRNA重鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄后處理比輕鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物更為及時3，翻譯由線粒體內(nèi)的蛋白質(zhì)翻譯機器完成自身基因的翻譯有特殊的起始密碼子（AUA，AUU）mRNA的非翻譯區(qū)極少對抑制原核生物蛋白質(zhì)合成的抗生素敏感2，117bp重復(fù)亞單位推測：兩者由基因擴增形成，差異是基因擴增之后積累的3，四分之一（58bp）重復(fù)亞單位最大差異為40%4，八分之一重復(fù)亞單位分α（28bp）、β（30bp）兩種亞單位，兩者差異為61%5，最小重復(fù)亞單位（9bp）八分之一重復(fù)亞單位由3種最小重復(fù)單位構(gòu)成GAAAAACGTGAAAAATGAGAAAAAACT

三者可能來源于共同的祖先序列（二）衛(wèi)星DNA可能的進化過程1，27bp重復(fù)亞單位的形成兩種亞單位只有19%的差異9bp重復(fù)亞單位經(jīng)躍進式復(fù)制（saltatoryreplication）形成27bp重復(fù)亞單位隨后發(fā)生突變積累2，58bp重復(fù)亞單位的形成27bp重復(fù)單位發(fā)生躍進式復(fù)制，形成54bp二聚體插入突變形成α、β亞單位（三）重復(fù)序列一致性的形成機制1，不均等交換（unequalcrossing-over)（1）原理：姐妹染色體上的非等位重復(fù)序列之間發(fā)生配對并交換，導(dǎo)致非對等的交換3，基因轉(zhuǎn)換（1）概念：通過異源雙鏈區(qū)內(nèi)不配對堿基的修復(fù)而進行的基因矯正過程（2）過程：圖2-14c第四節(jié)基因定位與基因克隆一、基因定位（一）連鎖定位（二）原位雜交（三）染色體步行1，基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫：將基因組DNA切割成宜于操作的片段，然后與適當(dāng)?shù)妮d體重組連接。由此建立的包含一整套基因組DNA片段的克隆群叫基因組文庫2，染色體步行（1）基本原理：通過一系列的雜交，確定按基因組原來順序排列的相互重疊的基因組克?。ㄖ丿B群），以獲得目標(biāo)序列所對應(yīng)的基因組DNA序列（2）過程：標(biāo)記目標(biāo)DNA（探針制備）菌落雜交測定陽性克隆DNA序列亞克隆陽性克隆末端DNA序列利用亞克隆制備新的DNA探針進行新的一輪菌落雜交重復(fù)上述過程（3）存在的問題：重復(fù)序列使步行出錯；克隆過程中基因組片段的發(fā)生突變（四）染色體跳躍染色體跳躍文庫（chromosomejumpinglibrary）的制作：（1）用識別長序列的限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA和克隆載體DNA（2）用脈沖電場梯度電泳分離DNA酶切片段（3）將DNA片段導(dǎo)入克隆載體，連接成環(huán)（4）用另一種限制性內(nèi)切酶（載體DNA無此酶識別位點）將大部分基因組DNA切除后，再將之連接起來二、基因克?。ㄒ唬┕δ芸寺±没虻漠a(chǎn)物（RNA或蛋白質(zhì)）所包含的功能信息來推知相應(yīng)基因的序列（二）候選基因克隆法根據(jù)遺傳疾病可能相關(guān)的生理特征，去進一步確定與這些生理特征相關(guān)的侯選基因，再在這些侯選基因中尋找與疾病表型可能相關(guān)的數(shù)據(jù)，以次確定疾病基因（三）位置候選基因克隆法通過連鎖圖譜與連鎖分析，先將致病基因定位于某些染色體的某一狹窄的區(qū)域，再對該區(qū)域中分布的基因位點進行篩選和確認，從而找到與疾病相關(guān)的基因。其過程為：1，利用低密度DNA標(biāo)記進行染色體掃描定位利用全基因組內(nèi)均勻分布的具有一定密度的多態(tài)性DNA標(biāo)記來作為連鎖分析中的參考點，快速達到初步基因定位的目的2，精確定位在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)選擇更多的標(biāo)記作進一步分析，以確認先前的連鎖分析結(jié)果，并將待克隆基因范圍進一步縮小3，確定基因從靶區(qū)域中得到的候選基因中，確定由其突變而導(dǎo)致發(fā)病的基因第四章

以修復(fù)作用為中心的DNA的安全保障體系導(dǎo)致DNA不穩(wěn)定的因素1，偶然的復(fù)制錯誤2，環(huán)境紫外線、電離輻射化學(xué)物質(zhì)（突變劑）造成的核酸分子損傷3，外源遺傳物質(zhì)的侵入保證DNA穩(wěn)定性的機制1，復(fù)制修復(fù)系統(tǒng)2，損傷修復(fù)系統(tǒng)3，限制-修復(fù)系統(tǒng)第一節(jié)復(fù)制修復(fù)一、尿嘧啶糖基酶系統(tǒng)（一）DNA中尿嘧啶的產(chǎn)生1，dUTP滲入2，胞嘧啶脫氨氧化生成（二）尿嘧啶糖基酶系統(tǒng)的組成1，尿嘧啶-N-糖基酶2，無嘌呤（AP）內(nèi)切核酸酶3，DNA聚合酶I（PolI）4，DNA連接酶（三）修復(fù)過程1，尿嘧啶-N-糖基酶將DNA雙鏈中的尿嘧啶切除2，AP內(nèi)切核酸酶切除無堿基核糖3，DNA聚合酶I（PolI）在缺口（gap）的3’端，以互補鏈為模板合成DNA鏈，同時其5’→3’外切核酸酶活性不斷將缺口下游的5’端核苷酸切除4，DNA連接酶將切刻（nick）封閉二、錯配修復(fù)系統(tǒng)（mismatchrepairsystem）DNA聚合酶偶爾能催化不能與模板配對的錯誤堿基的滲入，這種復(fù)制錯誤絕大多數(shù)由DNA聚合酶3’→5’校對功能立即得以修正。然而在某些條件下，會有頻率為10-8的錯誤的不到立即糾正。錯配修復(fù)系統(tǒng)使這種復(fù)制錯誤的頻率降至10-10~10-11（一）錯配修復(fù)系統(tǒng)的組成1，錯配矯正酶（mismatchcorrectionenzyme）是核酸內(nèi)切酶由基因mutH，mutL，和mutS所編碼可識別新生鏈上的錯配堿基及未甲基化的GATC2，DNA聚合酶I3，DNA連接酶（二）錯配修復(fù)的過程1，錯配矯正酶與未甲基化的GATC及同一條鏈上的錯配堿基結(jié)合2，錯配矯正酶在兩者之間切除一段包括錯配堿基的DNA單鏈3，DNA聚合酶III進行缺口充填4，DNA連接酶連接切刻（三）錯配修復(fù)系統(tǒng)其他作用1，去除滲入DNA的堿基類似物2，在基因轉(zhuǎn)換中起重要作用第二節(jié)損傷修復(fù)致?lián)p傷因素電離輻射紫外線化學(xué)突變劑等DNA分子損傷的類型嘧啶二聚體堿基修飾堿基丟失鏈的斷裂堿基交聯(lián)一、胸腺嘧啶二聚體的產(chǎn)生及其后果相鄰胸腺嘧啶在理、化因素作用下形成二聚體，產(chǎn)生破壞堿基平面的環(huán)丁基在以有胸腺嘧啶二聚體的DNA為模板時，DNA聚合酶I反復(fù)連接和切割腺嘌呤核苷酸（空耗），消耗大量dATP而不能繼續(xù)復(fù)制DNA，最后導(dǎo)致細胞死亡二、胸腺嘧啶二聚體修復(fù)的生物學(xué)指征（一）細菌的活存曲線（二）修復(fù)類型1，光復(fù)活（photoreactivation）只作用于紫外線照射所形成的產(chǎn)物只需要光復(fù)活酶（photoreactivatingenzyme）2，暗修復(fù)除了可作用于胸腺嘧啶二聚體外，還可以修復(fù)其他類型的損傷，包括：（1）切除修復(fù)（2）重組修復(fù)（3）SOS修復(fù)（4）二聚體糖基酶修復(fù)三、胸腺嘧啶二聚體修復(fù)的分子生物學(xué)機制(一）光復(fù)活（photoreactivation）1，光復(fù)活的定義在可見光（300nm~600nm）的活化之下由光復(fù)活酶催化胸腺嘧啶二聚體分解成為單體的過程2，光復(fù)活的過程光復(fù)活酶（PR酶）與DNA鏈上的胸腺嘧啶二聚體結(jié)合成復(fù)合物復(fù)合物吸收光能并切斷胸腺嘧啶二聚體之間的C-C鍵胸腺嘧啶二聚體變?yōu)閱误w，PR酶從DNA上解離下來光復(fù)活作用還可以修復(fù)紫外線照射形成的其他嘧啶二聚體（二）切除修復(fù)1，切除修復(fù)一般過程修復(fù)內(nèi)切酶識別損傷引起的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的變形，并在DNA損傷的兩側(cè)切開糖-磷酸骨架外切核酸酶去除切刻之間的DNADNA聚合酶合成一條新的DNA鏈置換損傷的DNA片段DNA連接酶封合新合成的DNA片段和原有DNA鏈之間的切刻2，大腸桿菌的切除修復(fù)（1）修復(fù)過程UvrA識別引起DNA雙螺旋變形的損傷，并與UvrB結(jié)合UvrA解離（需ATP)，Uvr加入UvrBC復(fù)合體在損傷DNA的兩側(cè)切開一個切刻。5’端和3’端離損傷位點分別為7個和3~4個核苷酸（需ATP）UvrD（解旋酶）解開DNA雙鏈，釋放損傷DNA片段DNA聚合酶I進行缺口的充填最后由DNA連接酶將切刻連接起來（2）大腸桿菌切除修復(fù)的類型短補丁修復(fù)（short-patchrepair）切除的DNA不超過30個核苷酸約占99%長補丁修復(fù)（long-patchrepair）切除的DNA大多數(shù)在1500核苷酸左右，少數(shù)可達9000核苷酸以上約占1%3，真核生物的切除修復(fù)（1）TFIIH打開DNA雙螺旋（2）XPG內(nèi)切核酸酶切開損傷的3’端（3）ERCC1內(nèi)切核酸酶切開損傷的5’端（三）重組修復(fù)1，除Uvr系統(tǒng)之外，還存在其他的暗修復(fù)系統(tǒng)證據(jù)1：對于uvrA-的細菌，UV致死劑量能在細胞內(nèi)產(chǎn)生300個胸腺嘧啶二聚體。而一個未被修復(fù)的胸腺嘧啶二聚體就可使細胞死亡證據(jù)2：recA-細菌比uvrA-細菌對紫外線更敏感2，重組修復(fù)（復(fù)制后修復(fù)）的機制（1）重組修復(fù)的姐妹鏈交換假說（圖4-10）DNA分子的a鏈和b鏈上各有一個胸腺嘧啶二聚體并開始復(fù)制通過二聚體后起始機制，復(fù)制出包含缺口的子鏈a’和b’a’，a姐妹鏈發(fā)生交換，即從a鏈上切下a’鏈上所缺少的一段，由DNA連接酶連接在a’鏈上。在下一輪復(fù)制時，a’鏈成為完整的模板a鏈上的缺口由PolI和DNA連接酶補好。b’鏈可以按同樣的方式進行修復(fù)。但是a鏈上的二聚體如果被其他機制所修復(fù)，那么只要由DNA聚合酶I補齊就行了（2）重組修復(fù)所涉及的基因recArecBCD其他不詳（四）SOS修復(fù)1,SOS反應(yīng)細菌在DNA受損或其他因素使DNA復(fù)制受到抑制時,會產(chǎn)生一系列的表型變化,包括對損傷DNA的修復(fù)能力迅速增強,誘變率的提高,細胞分裂停止以及原噬菌體的誘導(dǎo)釋放等.這些反應(yīng)通稱為SOS反應(yīng)2,SOS修復(fù)的概念是DNA損傷修復(fù)的一種旁路系統(tǒng)，它能引起DNA復(fù)制校對系統(tǒng)松懈,從而允許新生DNA鏈能夠越過胸腺嘧啶二聚體（超越二聚體合成，transdimersynthesis）完成全鏈的合成3,SOS修復(fù)的結(jié)果在DNA鏈?zhǔn)艿綋p傷時仍能完成復(fù)制DNA復(fù)制的錯誤率增高4,RecA蛋白在SOS修復(fù)中的作用(1)RecA蛋白的主要生化活性重組活性單鏈DNA結(jié)合活性蛋白酶活性(2)RecA蛋白的作用當(dāng)DNA合成受阻時,細胞中的RecA蛋白大量表達并被激活RecA是一種特異的內(nèi)肽酶,只切割少數(shù)蛋白質(zhì)的丙氨酸-甘氨酸之間的肽鍵.其識別特異性還與底物的空間結(jié)構(gòu)有關(guān).DNA合成轉(zhuǎn)入正常,RecA蛋白失去蛋白酶活性5,LexA蛋白在在SOS修復(fù)中的作用(1)LexA蛋白的作用是一種阻遏蛋白,結(jié)合于SOS系統(tǒng)中各基因的操作子上,使得這些基因不能產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對自身基因