細胞培養(yǎng)講課ppt

細胞培養(yǎng)技術(shù)主要內(nèi)容1.細胞培養(yǎng)技術(shù)的相關(guān)概念2.細胞培養(yǎng)過程中的污染3.如何應(yīng)對這些問題基本概念

細胞培養(yǎng)：指細胞在體外條件下，摸擬體內(nèi)生長環(huán)境，使其在體外繼續(xù)培養(yǎng)和增值。

原代培養(yǎng)：培養(yǎng)的動物細胞大都取自動物胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織，將組織取出來后，先用胰蛋白酶等使組織分散成單個細胞，然后配制成一定濃度的細胞懸浮液，再將該懸浮液放入培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，這個過程稱為原代培養(yǎng)。

傳代培養(yǎng)：將原代細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。細胞株：原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)的細胞在傳至10代左右時就由于很多細胞不適應(yīng)外界環(huán)境而不分裂，但有些細胞適應(yīng)外界環(huán)境而仍然分裂生長，這樣的細胞稱細胞株，細胞系：當細胞培養(yǎng)至50代左右后，一般的細胞再也培養(yǎng)下去了，只有遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的細胞而變成不死細胞繼續(xù)活下去了。這樣形成的細胞叫細胞系。細胞株和細胞系的區(qū)別：細胞系的遺傳物質(zhì)改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養(yǎng)?；靖拍罴毎麍D樣低倍顯微鏡高倍顯微鏡體外培養(yǎng)細胞的分型（一）貼附型細胞貼附在支持物表面生長，只依賴貼附才能生長的細胞叫做貼附型細胞(Anchorrage-dependentcells)這種現(xiàn)象與細胞分化有關(guān)。按照培養(yǎng)細胞的主要形態(tài)可分為成纖維細胞型，上皮型細胞，游走細胞型，多形型細胞細胞貼壁過程（二）懸浮型

特點：不貼附在支持物生長，胞體圓形，在培養(yǎng)液中生長空間大，可長時間的生長，繁殖旺盛便于做細胞代謝研究。S180肉瘤、血液里的白細胞、K562、HL－60。分型的目的：方便描述細胞在培養(yǎng)過程中的形態(tài)變化。培養(yǎng)條件好時，細胞相對穩(wěn)定，可反映出起源、正常異常的區(qū)別，作為判定細胞生物學(xué)性狀指標。細胞培養(yǎng)中的污染一、細菌污染

細菌污染是實驗室細胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預(yù)防劑量)，也可能因為操作不慎而引起污染。培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。所以，每天應(yīng)仔細觀察。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成試驗失敗和細胞株(系)丟失。細胞培養(yǎng)中的污染二、真菌污染

真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，尤其在霉雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)更易污染。最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培養(yǎng)細胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點，有的散在生長，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細胞周邊和細胞之間。個體細小，有增多趨勢。鏡下看時，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。細胞培養(yǎng)中的污染三、支原體污染支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件(pH7.6-8.0)下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。電鏡下可見其有三層結(jié)構(gòu)，無細胞壁，中央有電子密度大的密集顆?；蚪z狀的中心囊。培養(yǎng)細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。常用的排除微生物污染的方法細菌污染小可用慶大霉素50~100ug/ml，萬古霉素50ug/ml，氨卡青霉50~100ug/ml加入培養(yǎng)液中，次日換液。重度污染只有倒掉。支原體呈淺黑色“泥沙狀”，可影響細胞的生長，使用卡那霉50~100ug/ml加入培養(yǎng)液中，次日換液，連續(xù)2周，能控制支原體。如果重度污染只有倒掉。真菌污染一般用氨卡青霉素50~100ug/ml，慶大霉素50~100ug/ml，制霉菌素1.5ug/ml加入培養(yǎng)液中對霉菌污染的細胞進行大劑量沖擊處理，10小時后換液，能有效抑制霉菌的污染。應(yīng)對方法

一、無菌的培養(yǎng)環(huán)境和齊全的設(shè)備----細胞培養(yǎng)房的條件是關(guān)鍵TextTextTextText超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅(qū)動空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。主要設(shè)備主要設(shè)備按構(gòu)造分：正置顯微鏡

倒置顯微鏡二、規(guī)范的操作程序--所用器械要嚴按照規(guī)范的操作過程執(zhí)行酒精燈離心管培養(yǎng)瓶鑷子

三、常用試劑的制備酒精燈TEXTTEXT培養(yǎng)瓶1、常用培養(yǎng)基。我們實驗中的均有公司提供

注：關(guān)注實際試驗操作中的經(jīng)驗，關(guān)注PH值變化2、血清的選擇與配置。小牛血清或胎牛血清培養(yǎng)細胞時從-20℃到4℃逐漸溶解，避免冷熱變化3、EDTA的配置4、胰蛋白酶配置-20℃冰箱保存四、貼壁細胞的培養(yǎng)細胞培養(yǎng)過程中應(yīng)注意的事項一：

細胞復(fù)蘇過程中的一系列操作，要求動作迅速，復(fù)蘇的時間的長短與細胞存活率成正比，并且要先在37度水浴鍋中預(yù)熱，復(fù)蘇前細胞房嚴格消毒。四、貼壁細胞的培養(yǎng)細胞培養(yǎng)過程中應(yīng)注意的事項二：

在細胞的傳代培養(yǎng)中不能太多，細胞生長旺盛達到瓶底四分之三，但也不能太少。傳代時把培養(yǎng)瓶內(nèi)的液體輕輕倒掉，按胰蛋白酶與EDTA按1：1的混合物，（細胞消化的時間短，消化徹底且對細胞損傷小）對細胞進行消化。置室溫內(nèi)消化3~5分鐘后按常規(guī)操作進行傳代。四、貼壁細胞的培養(yǎng)細胞培養(yǎng)過程中應(yīng)注意的事項三：

冷凍經(jīng)過水液態(tài)—冰態(tài)加水態(tài)—冰態(tài)三個階段，降溫的速率十分重要，按照4℃冰箱40min，-20℃冰箱60min，-80℃冰箱內(nèi)過存或液氮罐長期保存

注意：上述過程中要去掉上清液的時一定輕輕倒掉或用移液管吸掉培養(yǎng)液，過重、過快容易把細胞也去掉。五污染的防治（見前面）六細胞室要制定嚴格的規(guī)章制度，每天進行消毒，保持