人I型膠原蛋白Col

人I型膠原蛋白（Col-1）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用。檢測范圍：96T1.5yg/L-40yg/L使用目的：本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中I型膠原蛋白（Col-I）含量。實(shí)驗(yàn)原理本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人I型膠原蛋白（Col-I）水平。用純化的人I型膠原蛋白（Col-I）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入I型膠原蛋白（Col-I），再與HRP標(biāo)記的I型膠原蛋白（Col-I）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的I型膠原蛋白（Col-I）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人I型膠原蛋白（Col-I）濃度。試劑盒組成130倍濃縮洗滌液20mlX1瓶7終止液6mlX1瓶2酶標(biāo)試劑6mlX1瓶8標(biāo)準(zhǔn)品（80yg/L）0.5mlX1瓶3酶標(biāo)包被板12孔X8條9標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5mlX1瓶4樣品稀釋液6mlX1瓶10說明書1份5顯色劑A液6mlX1瓶11封板膜2張6顯色劑B液6mlX1/瓶12密封袋1個(gè)標(biāo)本要求1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20°C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。40gg/L5號標(biāo)準(zhǔn)品150山的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150gl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液20gg/L4號標(biāo)準(zhǔn)品150山的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入150gl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液10gg/L3號標(biāo)準(zhǔn)品150山的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入150gl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液5gg/L2號標(biāo)準(zhǔn)品150山的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入150gl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2.5yg/L1號標(biāo)準(zhǔn)品150山的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入150gl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50卩1,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40卩1,然后再加待測樣品10卩1（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。溫育：用封板膜封板后置37°C溫育30分鐘。配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用洗滌：小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50卩1，空白孔除外。溫育：操作同3。洗滌：操作同5。顯色：每孔先加入顯色劑A50yl，再加入顯色劑B50yl，輕輕震蕩混勻，37C避光顯色15分鐘.終止：每孔加終止液50卩1，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。操作程序總結(jié)：計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。注意事項(xiàng)1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)伍倍）后再測定，計(jì)算時(shí)請最后乘以總稀釋倍數(shù)（XnX5）o封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。底物請避光保存。嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)