分子生物學第四章

第四章DNA復制DNA的復制（replication）是指以原來的DNA分子為模板合成出相同的DNA分子的過程。遺傳信息通過親代DNA分子的復制傳遞給子代。DNA復制在保持生物物種遺傳的穩(wěn)定性方面起著重要的作用。DNA復制和細胞周期的關系：DNA復制是細胞周期的決定因素，DNA復制完成以前，細胞不會發(fā)生分裂。DNA復制的完成是細胞分裂的觸發(fā)點，復制后的基因組被平均分配到兩個子細胞中去。細胞周期調(diào)控基因控制DNA的復制并觸發(fā)細胞分裂。第一節(jié)復制概況半保留復制復制起點、方向和方式DNA聚合酶和DNA聚合反應復制的基本過程復制的半不連續(xù)性一、半保留復制理論上，DNA的復制可以采取半保留復制、全保留復制和混合復制（散布式）三種方式。半保留復制機制的證明—Meselson-Stahl實驗1958年，MatthewMeselson和FranklinStahl設計了一個很巧妙的實驗，證明了DNA復制采取半保留復制機制。

兩個子代DNA分子通過細胞分裂平均分配到兩個子代細胞中。由于每個子代細胞中只有一半的遺傳物質(zhì)是來自親代細胞，而另一半是新合成的，這種復制方式被稱為半保留復制（semiconservativereplication）。15Nlabelingexperiment15Nlabeling:growcellsin??CollectDNA:growcellsin??Separation:method??Resultinterpretation15NlabeledDNAunlabeledDNASemi-conservativemechanism半保留復制是雙鏈DNA普遍采用的復制機制。即使是單鏈DNA分子，在其復制過程中也要先形成雙鏈的復制形式。半保留復制機制說明了DNA在代謝上的穩(wěn)定性。半保留復制作為一個復雜的過程，需要多種細胞組分的參與。同時為保持遺傳的穩(wěn)定性，要有高度的忠實性。如:M13phage由于特異單鏈結合蛋白的作用,只大量合成(+)鏈二、DNA復制的起點、方向和方式

DNA復制的起點

原核生物DNA的復制是在DNA分子的特定位點開始的，這一位點稱為復制起點，常用ori來表示。

原核生物的染色體只有一個復制起點，復制從起點開始，進行到終點結束，完成整個染色體DNA分子的復制。OriCinE.colichromosomalDNA復制子（replicon）

復制子是基因組中能夠獨立進行復制的單位。每個復制子都有控制復制開始的復制起點（origin）以及終止復制的終點（terminus）。任何起點和終點之間的序列都作為復制子的一部分參與復制。

在一個細胞周期中，每個復制子只啟動一次。

原核生物只有一個復制子。噬菌體、病毒的DNA也是單復制子。參與復制的DNA分子上有兩個區(qū)域，未復制的區(qū)域由親代DNA組成，已復制的區(qū)域由兩條子代鏈組成。復制正在發(fā)生的位點叫做復制叉（replicationfork）或生長點（growingpoint）。ReplicatedDNAisseenasareplicationeyeflankedbynonreplicatedDNA.Originscanbemappedbyautoradiographyandelectrophoresis

AreplicationeyeformsathetastructureincircularDNA.將一段來自起點的DNA序列與缺失起點的DNA分子克隆到一起，如果來自起點的DNA片段包括一個復制起點所必須具備的序列，它將支持與其連接的任何DNA序列的復制。由此可以鑒定起點的DNA序列。細菌、酵母以及葉綠體、線粒體的DNA復制起點現(xiàn)均已經(jīng)被克隆，其核酸序列也被確定了，它們的共同特點是富含A-T序列。

真核生物DNA的復制也是從特定的位點開始的，以雙向延伸的方式進行，直到終點為止。真核生物DNA的復制是從多個位點開始的，所以真核生物的DNA分子上有多個復制單位同時進行DNA的復制。

真核生物的多個復制子（replicon）DNA復制的方向復制可單向進行，也可以雙向進行，這取決于在起點有一個還是兩個復制叉。Repliconsmaybeunidirectionalorbidirectional,dependingonwhetheroneortworeplicationforksareformedattheorigin.DNA復制的方向復制可單向進行，也可以雙向進行，這取決于在起點有一個還是兩個復制叉。Differentdensitiesofradioactivelabelingcanbeusedtodistinguishunidirectionalandbidirectionalreplication.DNA復制的方式大多數(shù)生物體內(nèi)DNA的復制都以雙向等速方式進行。但枯草桿菌兩個復制叉的移動是不對稱的。質(zhì)粒ColEI的復制完全是單向進行的。大多數(shù)生物體內(nèi)的DNA復制都以對稱方式進行，即DNA分子的兩條鏈同時復制。但也有在一定時期內(nèi)DNA只復制一條鏈的情況。例如線粒體的D－環(huán)復制和一些細菌噬菌體的滾環(huán)復制方式。D環(huán)復制原核生物在一個復制結束前,后代復制已開始

三、DNA聚合酶與DNA聚合反應DNA的復制是由DNA聚合酶（DNApolymerase）負責完成的，它具有按照模板的指令在模板鏈上催化新DNA鏈合成的活性。DNA聚合酶是一種模板指導的聚合酶，產(chǎn)物DNA與模板的堿基組成相同。說明在DNA聚合酶的作用下，DNA的兩條鏈都能復制。

在適量DNA和鎂離子存在下，DNA聚合酶催化4種脫氧核糖核苷酸合成DNA，每次在DNA的3’-OH末端加入一個核苷酸使DNA鏈由5’向3’方向延長，同時釋放無機焦磷酸。四、復制的基本過程DNA的復制包括起始、延伸和終止三個步驟。復制調(diào)控主要發(fā)生在起始階段，復制子增殖依賴于起始過程起點處發(fā)生的相互作用。一般復制開始后，就會進行到底，直到整個基因組都復制完畢。五、DNA復制的半不連續(xù)性當復制叉前進時，在兩個暴露的親鏈上都要進行子鏈的合成。但是DNA分子的兩條鏈是反向平行的，而且所有已知的DNA聚合酶的合成方向都是5’3’，即新生鏈的方向只能是5’3’。

半不連續(xù)復制SynthesisofOkazakifragmentsrequirespriming,extension,removalofRNA,gapfilling,andnickligation

第二節(jié)DNA的復制體系一、復制體系的鑒定人們一般通過突變體表型的變化來考察基因的功能，如果某個基因突變導致細胞DNA不能復制，就可以說這個基因與DNA復制有關。利用大腸桿菌的溫度敏感突變體已經(jīng)鑒定了一系列的dna基因座。對參與DNA復制的蛋白質(zhì)進行識別和鑒定的方法有三種：純化、突變、重建。體外互補實驗是鑒定復制體系組分的重要手段。二、DNA聚合酶（包括DNA復制酶及參與復制的附屬反應或損傷DNA的修復合成）

1大腸桿菌的DNA聚合酶

大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了三種DNA聚合酶：DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅱ、DNA聚合酶Ⅲ。DNA聚合酶Ⅰ參與損傷DNA的修復，并在半保留復制中起切除RNA引物的作用。DNA聚合酶Ⅱ也參與修復。DNA聚合酶Ⅲ是一個多亞基的蛋白質(zhì)，是合成DNA新鏈的主要復制酶。DNA聚合酶Ⅰ大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ是第一個被鑒定的DNA聚合酶，它是由polA基因編碼的103kDa的單鏈多肽。當?shù)孜锖湍０宕嬖跁r，DNA聚合酶Ⅰ可使脫氧核糖核苷酸依次加到具有3’－OH末端的多核苷酸鏈上。它的催化需要引物鏈（DNA或RNA）的存在。DNA聚合酶Ⅰ是一個多功能酶，它可以催化以下的反應：1、DNA鏈沿5’→3’方向的延長（DNA聚合酶活性）。2、從3’端水解DNA鏈（3’→5’外切核酸酶活性）。3、從5’端水解DNA鏈（5’→3’外切核酸酶活性）。

用蛋白水解酶將DNA聚合酶Ⅰ作有限水解，可得到分子量為68kDa和36kDa的兩個片段。大片段（68kDa，也叫Klenow片段）在體外可以催化合成反應。Klenow片段C端的2/3片段具有聚合酶活性，而N端的1/3片段具有3’→5’外切核酸酶活性。兩個活性位點的距離為3nm，表明堿基的加入和去除功能在空間上是分開的。DNAPolymeraseI的缺口平移作用體外的切刻移位（nicktranslation）是實現(xiàn)在DNA分子上引入放射性標記核苷酸的重要技術。

小片段（35KDa）有5’→3’外切核酸酶活性，可以切除少量的核苷酸。該酶片段在切除由紫外線照射而形成的嘧啶二聚體中起重要作用。DNA的半不連續(xù)合成中，崗崎片段5’端RNA引物的切除可能也依賴于該外切酶活性。小片段的外切酶活性和大片段的聚合校對功能協(xié)同作用，使DNA聚合酶Ⅰ具有從切口處起始復制的獨特功能。在雙鏈DNA的磷酸二酯鍵斷裂（nick）處，DNA聚合酶Ⅰ可延伸3’末端，合成新的DNA片段后，置換雙螺旋中已有的同源鏈（切口移位）。DNA聚合酶Ⅱ

DNA聚合酶Ⅱ是一條分子量為120,000的多肽鏈。這個酶的活性很低，只有DNA聚合酶Ⅰ的5％。DNA聚合酶Ⅱ也以4種脫氧核糖核苷酸為底物，從5’-3’方向合成DNA。DNA聚合酶Ⅱ具有3’-5’外切核酸酶活性，但無5’-3’外切酶活性。DNA聚合酶Ⅱ在DNA的修復中起一定作用。DNA聚合酶ⅢDNA聚合酶Ⅲ是真正負責大腸桿菌細胞內(nèi)合成DNA的復制酶。DNA聚合酶Ⅲ是多亞基組成的蛋白質(zhì)。DNA聚合酶Ⅲ全酶由α、β、γ、δ、ε、θ、τ、δ’、χ和ψ10種不同的亞基組成。DNA聚合酶Ⅲ至少含有3種重要的酶活性。即5’3’DNA聚合酶活性、3’5’外切核酸酶活性和依賴DNA的ATP酶活性。DNA聚合酶Ⅲ不具有5’3’外切核酸酶活性。DNA聚合酶Ⅲ全酶在細胞中的含量很少，在每個細胞中只有10－20個拷貝的全酶（holoenzyme）。DNA聚合酶Ⅲ含有以下4個不同的功能組分：1）核心聚合酶（corepolymerase）核心聚合酶由α、ε、θ三種亞基組成。α亞基具有5’-3’方向合成DNA的催化活性。ε亞基具有3’-5’外切核酸酶的校對功能，控制復制的忠實性。ε亞基與α亞基形成一個緊密的1：1復合物，協(xié)同發(fā)揮作用。θ亞基促進ε亞基的作用。2）β二聚體

β亞基是以二聚體的形式存在的。β二聚體是環(huán)狀的，環(huán)繞著DNA并在DNA上自由滑動，構成一個滑動鉗?；瑒鱼Q可以把全酶束縛在模板DNA上，從而保證高度的進行性。鉗的存在對于大腸桿菌的高效復制是十分必要的。POLIII,bsubunitTheβsubunitofDNApolymeraseIIIholoenzymeconsistsofaheadtotaildimer(thetwosubunitsareshowninredandorange)thatformsaringcompletelysurroundingaDNAduplex(showninthecenter).SlidingDNAclampsarefoundacrossallorganismandshareasimilarstructure3）γ復合物γ復合物含有5種不同的亞基，形成一種化學計量為γ2δ1δ’1χ1ψ1的結構。γ復合物是β滑動鉗的載體，它可以幫助β滑動鉗結合到DNA上，也可從DNA上卸載β滑動鉗。γ復合物有依賴DNA的ATP酶活性。β二聚體自己并不能組裝到DNA上，它是通過γ復合物與ATP協(xié)同作用催化ATP的水解而組裝到DNA上的。γ復合物是一個不對稱的結構，它們相對兩個核心聚合酶不對稱分布使全酶具有不對稱結構，導致在全酶上兩個核心聚合酶功能上的不對稱性。兩個聚合酶功能上的不對稱性使DNA兩條鏈合成表現(xiàn)出不同的性質(zhì)。4）τ二聚體

連接蛋白（τ2）可結合兩個核心酶分子和一個γ復合物。τ亞基是一個依賴于DNA的ATP酶，τ二聚體可結合兩個核心酶，每個τ亞基結合一個核心酶。在一個分子結構中存在兩個聚合酶表明復制性的聚合酶成對起作用，協(xié)同復制雙螺旋DNA的兩條鏈。DNA聚合酶Ⅲ全酶的功能是復制大腸桿菌的染色體。DNA聚合酶Ⅲ與DNA聚合酶Ⅰ的不同之處：(1)DNA聚合酶Ⅲ具有多亞基的結構。(2)聚合反應需要ATP的存在。(3)反應有很高的速度和高度的進行性。ThecompositionoftheDNAPolIIIholoenzyme

2DNA復制的忠實性復制過程的忠實性是保證生物體遺傳信息準確傳遞的一個必要條件，它取決于堿基配對的專一性。DNA聚合酶可以通過兩種方式提高互補堿基選擇的專一性。第一，通過專一性識別使即將加入的堿基與模板的堿基嚴格互補，這種方式用來控制合成前的錯誤。第二，當發(fā)現(xiàn)存在著錯配堿基時，可切除新加入的堿基，這種方式叫校對控制。兩種方式既可單獨起作用，也可共同起作用。復制過程中堿基配對受雙重核對作用控制：聚合酶的選擇作用和3’5’外切核酸酶的校正（proofreading）作用。不同的聚合酶以不同的方式處理聚合與校對的關系。DNA聚合酶在復制過程中造成的錯誤除了不正確配對造成的核苷酸取代外，還包括由于插入或缺失額外的核苷酸造成的框架移位。

3其他生物的聚合酶噬菌體也編碼DNA聚合酶，它們是T4、T5、T7、SPIO1。這些酶都有5’-3’合成酶活性和3’-5’外切校正活性。

真核生物中發(fā)現(xiàn)了5種不同的DNA聚合酶，分別為α、β、γ、δ、ε。α、β、δ、ε位于細胞核中，而γ是線粒體酶。ExonucleasedomaintemplatephageT7DNApolymerase晶體結構

4DNA聚合酶的引物DNA聚合酶的一個共同特征是它們只能催化脫氧核糖核苷酸加到已有核酸鏈的游離3’－OH上，而不能從游離核苷酸起始DNA鏈的合成。DNA聚合酶需要引物來提供3’－OH末端，然后在其上加入核苷酸來延伸DNA鏈。通常細胞先在模板上合成一段RNA序列，然后通過DNA聚合酶延伸RNA鏈的3’－OH。

5DNA聚合酶催化的分子機制來源于病毒、原核生物和真核生物的聚合酶、反轉錄酶甚至RNA聚合酶的聚合酶區(qū)域都有一個類似手指、手掌和拇指的基本結構，存在相似的折疊結構。通過晶體結構和模型研究發(fā)現(xiàn)，

手指區(qū)域可與未復制的單鏈模板相互作用，同時手指區(qū)域的一部分也參與結合進入底物dNTP。

拇指亞區(qū)可與模板－引物DNA雙螺旋相互作用。聚合酶通過保守的氨基酸殘基與引物模板復合物相互作用使引物的3’末端定位在手掌和手指的會合點，并與dNTP相對。Sideview:PolymeraseactivesiteTopviewwithtemplate-primer:PolymerasesiteAndproofreadingsiteDNAPolresembleahandthatgripstheprimer-templatejunction

SchematicdrawingT7DNApolExonucleasedomaintemplatephageT7DNApolymerase晶體結構DNApol的聚合和校對

研究還發(fā)現(xiàn)，dNTP的進入伴隨著兩個Mg2＋離子的作用，由此提出了核苷酸加入（聚合）反應的雙金屬離子機制（twometal-ionmechanism)。核苷酸的摻入是受模板指導的，所以DNA聚合酶在每個催化循環(huán)中都要改變它的核苷酸底物專一性。錯誤核苷酸的摻入可引發(fā)DNA聚合酶從DNA合成到校正的轉變。三、DNA連接酶

DNA聚合酶只能催化多核苷酸鏈的延長反應，不能使鏈與鏈之間連接。

DNA連接酶能催化雙鏈DNA切口處的5’－磷酸基和3’－羥基生成磷酸二酯鍵。這種反應需要供給能量。大腸桿菌和其他細菌的DNA連接酶以NAD作為能量來源，動物細胞和噬菌體的連接酶以ATP作為能量來源。

四、螺旋酶在DNA復制、修復、重組以及接合過程中，DNA兩條互補鏈必須部分分開以形成單鏈DNA中間體，即解旋。該過程是由DNA螺旋酶催化完成的。DNA螺旋酶(helicase)是DNA復制、重組、修復過程中關鍵的發(fā)動蛋白。螺旋酶具有依賴DNA的ATPase活性，可把ATP水解產(chǎn)生的自由能轉化為解旋DNA并使螺旋酶本身沿DNA鏈移動的機械能。DNA螺旋酶都以寡聚體的形式發(fā)揮功能，通常是二聚體或六聚體。每一個亞基具有一個潛在的DNA結合位點，從而每個螺旋酶分子具有多個DNA結合位點，這是螺旋酶實現(xiàn)催化功能的關鍵。盡管RNA聚合酶也可熔解DNA雙螺旋，但復制叉是由復制性的DNA螺旋酶的作用下形成的。

五、DNA拓撲異構酶復制過程中，DNA雙螺旋的解旋使復制叉前面產(chǎn)生正超螺旋，將妨礙復制叉的前進。DNA拓撲異構酶則可以使超螺旋分子松弛。大腸桿菌中起主要作用的是拓撲異構酶Ⅱ，它能夠產(chǎn)生負超螺旋以抵消復制叉移動所產(chǎn)生的正超螺旋，防止正超螺旋的積累，使DNA片段以負超螺旋的形式存在。II型DNA拓撲異構酶的作用機制

StrandPass