除草劑丁草胺對(duì)高產(chǎn)水稻土微生物群落功能多樣性的影響講義

會(huì)計(jì)學(xué)1除草劑丁草胺對(duì)高產(chǎn)水稻土微生物群落功能多樣性的影響講義目錄1.背景介紹2.材料和方法3.結(jié)果和分析4.結(jié)論第1頁(yè)/共26頁(yè)介紹1.丁草胺的概況：

丁草胺是亞洲生產(chǎn)和應(yīng)用最廣泛的除草劑，與乙草胺和草甘膦并稱我國(guó)三大除草劑，每年用量超過8000t，且呈持續(xù)增加的趨勢(shì)。丁草胺主要應(yīng)用于水稻田，對(duì)禾本科雜草有較好的防除效果，但由于使用量大，且直接毒土，不可避免地會(huì)在土壤和環(huán)境中殘留，破壞土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，影響水稻產(chǎn)量。丁草胺在環(huán)境中的殘留污染主要有三種情況：一是丁草胺隨生產(chǎn)廢水、排灌水及降水的縱向淋溶和橫向擴(kuò)散會(huì)造成地表水和地下水的污染；二是丁草胺會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中的植物、動(dòng)物和微生物產(chǎn)生不利影響，從而影響到整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)；三是丁草胺具有致突變性和遺傳毒性，能通過食物鏈和生物富集將毒性逐級(jí)傳遞并不斷擴(kuò)大，最終影響到人類健康。因此，丁草胺在生態(tài)環(huán)境中的安全性問題已經(jīng)逐漸引起人們的關(guān)注，深入了解丁草胺的環(huán)境生態(tài)效應(yīng)顯得極為重要。第2頁(yè)/共26頁(yè)2.高產(chǎn)水稻區(qū)概況：

云南永勝濤源鄉(xiāng)是保持我國(guó)水稻小面積超高產(chǎn)紀(jì)錄的特殊生態(tài)區(qū)，1983年常規(guī)稻“桂朝2號(hào)”在濤源創(chuàng)下畝產(chǎn)1075.4kg的全國(guó)高產(chǎn)紀(jì)錄，使我國(guó)首次實(shí)現(xiàn)單季水稻畝產(chǎn)超噸糧的突破；2001雜交稻“特優(yōu)175”驗(yàn)收畝產(chǎn)達(dá)1185.5kg，超級(jí)稻“Ⅱ優(yōu)明86”驗(yàn)收畝產(chǎn)達(dá)1196.5kg，雙雙打破印度畝產(chǎn)1184.8kg的世界水稻紀(jì)錄；從2004年到2006年，濤源連續(xù)三年創(chuàng)造1畝以上面積水稻單產(chǎn)突破1200kg大關(guān)的歷史性突破，“協(xié)優(yōu)107”畝產(chǎn)達(dá)1287kg。光照、溫度和當(dāng)?shù)貎?yōu)越的土壤微環(huán)境是造成濤源水稻頻頻高產(chǎn)的重要生態(tài)因素。濤源特殊生態(tài)區(qū)常年使用丁草胺作為水稻選擇性芽前除草劑，大量施用的除草劑究竟會(huì)對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)造成多大影響成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。第3頁(yè)/共26頁(yè)

本試驗(yàn)采用BIOLOGECO微平板，通過測(cè)定土壤微生物對(duì)單一碳源的利用能力和利用程度，研究不同濃度丁草胺對(duì)高產(chǎn)水稻土微生物群落功能多樣性的影響。BIOLOG碳素利用法是由美國(guó)BIOLOG公司于1989年開發(fā)成功的一種用于微生物純種鑒定的研究方法。BIOLOG方法的原理是：微生物在利用碳源的過程中會(huì)產(chǎn)生自由電子，自由電子可引起四唑鹽染料發(fā)生氧化還原顯色反應(yīng)，由于微生物對(duì)不同碳源的利用能力很大程度上取決于微生物的種類及其代謝活性，從而達(dá)到鑒定純種微生物或比較分析微生物群落結(jié)構(gòu)的目的。

ECO微平板是BIOLOG碳素利用法中以碳源利用能力為基礎(chǔ)的描述微生物群落功能特征的定量分析方法。ECO微平板共96個(gè)孔，每32孔為一組重復(fù)，包含1個(gè)對(duì)照孔和31個(gè)反應(yīng)孔。對(duì)照孔中加入水和指示劑，反應(yīng)孔分別加入31種單一碳源和指示劑。將微生物接種到ECO微平板后，各孔中微生物利用碳源底物，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，使指示劑變色，然后根據(jù)反應(yīng)孔中顏色變化的吸光值來指示微生物對(duì)31種不同碳源的利用情況，得到土壤微生物特有的“代謝指紋”，從而反映微生物群落功能代謝能力的差異。此方法靈敏度高，無需分離培養(yǎng)純種微生物，可最大限度保留微生物群落的原有代謝特征，且操作簡(jiǎn)便，數(shù)據(jù)量大，在研究空間及時(shí)間尺度上微生物群落變化方面得到廣泛應(yīng)用。研究思路：第4頁(yè)/共26頁(yè)材料和方法

1.供試藥品丁草胺，上海升聯(lián)化工有限公司生產(chǎn)，農(nóng)藥登記號(hào)：D20091403，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：HG3292-2001，施用方法：藥土法。2.土壤含水量測(cè)定稱取30-40g（精確到0.01g）新鮮土樣置于培養(yǎng)皿中，放入110℃烘箱烘烤6h，取出稱重；之后重新放回烘箱繼續(xù)烘烤，每隔30min重復(fù)稱重一次，直至恒重，設(shè)置三個(gè)重復(fù)。土壤含水量計(jì)算公式為：其中，m0表示烘干前樣品重，g；m1表示烘干后樣品重，g。第5頁(yè)/共26頁(yè)3.丁草胺處理試驗(yàn)設(shè)計(jì)

丁草胺的合理施用標(biāo)準(zhǔn)為有效成分濃度747-1278g/hm2（GB/T8321.1-2000），折算合0.216-0.370mg/kg干土，本研究取中間濃度0.30mg/kg干土作為100%推薦劑量。稱取相當(dāng)于500g干重的新鮮土樣，加入超純水使其含水量為田間最大持水量的60%，在室內(nèi)模擬條件下，添加以超純水稀釋的丁草胺，使其在土樣中的有效成分濃度分別為50%推薦劑量(0.15mg/kg，簡(jiǎn)稱B15)、100%推薦劑量（0.30mg/kg，簡(jiǎn)稱B30）和500%推薦劑量（1.5mg/kg，簡(jiǎn)稱B150），攪拌均勻，另設(shè)不加丁草胺的處理為對(duì)照（0mg/kg，簡(jiǎn)稱CK），每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。所有處理密封，置于恒溫培養(yǎng)箱（25±1℃）中避光培養(yǎng)，于藥劑處理后的7、15、30、45d取樣測(cè)定，每隔2-3d用差減法補(bǔ)充水分以調(diào)節(jié)含水量。第6頁(yè)/共26頁(yè)4.土壤微生物功能多樣性測(cè)定方法ECO微平板的測(cè)定方法參照Garland（1991），具體步驟為：①0.1mol/L磷酸緩沖液：KH2PO4/K2HPO4，pH7.0，分裝至250mL三角瓶中，每瓶90mL，121℃滅菌備用；②0.85%生理鹽水：NaCl8.5g，蒸餾水1000mL，分裝至玻璃試管，每管9mL，121℃滅菌備用；③稱取相當(dāng)于10g干土重的處理土樣，加入90mL0.1mol/L磷酸緩沖液中，180r/min振蕩30min，靜置10min；④取土壤浸出液上清1mL，加入9mL0.85%生理鹽水，混勻，梯度稀釋成10-3土壤菌懸液；⑤用移液器接種土壤菌懸液至ECO微平板，每孔150μL，每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)；⑥25℃恒溫培養(yǎng)箱溫育7d，在培養(yǎng)24、48、72、96、120、144、168h后用BIOLOG自動(dòng)讀板儀讀取590nm波長(zhǎng)下的吸光值。

第7頁(yè)/共26頁(yè)5.數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS17.0軟件處理，采用單因素（onewayANOVA）方差分析和LSD法進(jìn)行多重比較（р＜0.05）。第8頁(yè)/共26頁(yè)3.數(shù)據(jù)處理

微生物代謝活性采用微平板每孔顏色平均變化率（AverageWellColorDevelopment，AWCD）描述，采用Shannon指數(shù)（Shannonindex）和Simpson指數(shù)（Simpsonindex）表征土壤微生物群落功能多樣性（表4-1）；使用SPSS17.0軟件處理AWCD值、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)計(jì)算結(jié)果，采用單因素（onewayANOVA）方差分析和LSD法進(jìn)行多重比較（р＜0.05）。第9頁(yè)/共26頁(yè)結(jié)果與分析1.不同處理微生物群落代謝活性分析

第10頁(yè)/共26頁(yè)圖土壤微生物群落溫育過程中AWCD值的變化

施藥7d，B30的AWCD值明顯高于其它處理，其次為B15。B150和CK差別不明顯，說明中低劑量丁草胺可刺激微生物生長(zhǎng)，高濃度丁草胺影響不顯著；各處理均在溫育72-120h期間表現(xiàn)出較強(qiáng)的碳源利用能力。第11頁(yè)/共26頁(yè)

施藥15d，B30仍然保持最強(qiáng)的代謝活性，B15在溫育96h后降至CK以下，B30在溫育168h時(shí)與CK持平，而B150始終保持相對(duì)較低的代謝狀況，說明隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，中低濃度丁草胺對(duì)微生物的刺激作用逐漸消退，高濃度則表現(xiàn)出抑制作用；第12頁(yè)/共26頁(yè)

施藥30d，CK表現(xiàn)出對(duì)碳源最強(qiáng)的利用能力，溫育96h時(shí)，其AWCD值與B15和B30差異不明顯，但比B150高出40.5%，說明隨著農(nóng)藥的自然降解，中低濃度丁草胺的刺激作用已不存在，高濃度的抑制作用尚未解除；第13頁(yè)/共26頁(yè)

施藥45d，所有處理整體代謝活性無明顯差別，隨著溫育時(shí)間延長(zhǎng)，B150碳源利用能力逐漸增強(qiáng)，說明高濃度丁草胺對(duì)微生物的抑制作用正逐漸消除。

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施用丁草胺會(huì)改變高產(chǎn)水稻土微生物群落代謝活性，中低濃度對(duì)微生物有促生長(zhǎng)作用，高濃度有抑制作用，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，促進(jìn)和抑制作用逐漸減緩，直至完全消失。小結(jié)：第15頁(yè)/共26頁(yè)2.不同處理微生物群落多樣性指數(shù)分析施藥7d，除B30的Shannon指數(shù)明顯偏高外，其余處理與CK均無顯著差異，說明100%推薦劑量可提高微生物碳源利用能力，與AWCD值分析結(jié)果一致。施藥15d，所有處理Shannon指數(shù)與CK均無顯著差異，丁草胺未表現(xiàn)出明顯影響。施藥30d，B150的Shannon指數(shù)首先顯著下降。施藥45d，B30也表現(xiàn)出Shannon指數(shù)顯著下降，據(jù)此趨勢(shì)推測(cè)，若繼續(xù)培養(yǎng)，B15的Shannon指數(shù)很可能也會(huì)下降。說明施用丁草胺會(huì)導(dǎo)致微生物群落可利用碳源種類數(shù)顯著下降，施藥濃度越高，發(fā)生微生物群落可利用碳源種類數(shù)減少所需時(shí)間越短。第16頁(yè)/共26頁(yè)施藥7d，除B30的Simpson指數(shù)明顯偏低外，其余處理與CK均無顯著差異，說明100%推薦劑量可提高微生物碳源利用能力，與AWCD值和Shannon指數(shù)分析結(jié)果一致。施藥15d，B150最早出現(xiàn)Simpson指數(shù)的明顯升高，與CK達(dá)到差異顯著，說明高濃度處理最早引起微生物碳源利用能力集中，可利用碳源種類數(shù)減少。施藥30d，B150的Simpson指數(shù)進(jìn)一步提高，比CK高出33.3%，達(dá)到差異顯著；而B30和B15與CK雖未達(dá)到差異顯著，但其Simpson指數(shù)也表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，比CK分別高出15.9%和11.6%。施藥45d，B30的Simpson指數(shù)與CK達(dá)到差異顯著，說明中等濃度處理也引起了微生物碳源利用能力集中。據(jù)此趨勢(shì)推測(cè)，若繼續(xù)培養(yǎng)，B15很可能也會(huì)引起微生物碳源利用能力集中。施用丁草胺會(huì)導(dǎo)致微生物群落碳源利用能力集中，施藥濃度越高，發(fā)生微生物群落碳源利用能力集中所需時(shí)間越短。第17頁(yè)/共26頁(yè)兩個(gè)多樣性指數(shù)分析結(jié)果均表明，施用丁草胺會(huì)對(duì)高產(chǎn)水稻土微生物群落碳源利用能力產(chǎn)生不利影響，施藥濃度是導(dǎo)致微生物群落碳源利用能力集中、可利用碳源種類數(shù)減少的直接原因，且施藥濃度越高，發(fā)生微生物群落碳源利用能力減弱所需時(shí)間越短。小結(jié)：第18頁(yè)/共26頁(yè)3.不同處理微生物碳源利用特征主成分因子分析施藥7d，主成分因子PC1和主成分因子PC2貢獻(xiàn)率分別為47.14%和32.36%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率79.50%；PC1能較好區(qū)分CK、B15和B30，PC2能較好區(qū)分CK和B15，說明施用丁草胺會(huì)造成高產(chǎn)水稻土微生物群落碳源利用能力的差別，B15和B30首先獲得響應(yīng)，考慮到PC1和PC2貢獻(xiàn)率不同，綜合評(píng)價(jià)應(yīng)為B30變化最顯著。第19頁(yè)/共26頁(yè)施藥15d，主成分因子PC1和主成分因子PC2貢獻(xiàn)率分別為47.71%和32.43%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率80.14%；PC1能較好地將三個(gè)農(nóng)藥處理與CK區(qū)分開，PC2能較好區(qū)分CK、B30和B150，說明隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，高濃度處理微生物碳源利用能力也開始發(fā)生改變，但不及中低濃度處理變化明顯。第20頁(yè)/共26頁(yè)施藥30d，主成分因子PC1和主成分因子PC2貢獻(xiàn)率分別為41.15%和29.92%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率71.06%；PC1能較好地將CK與其他三個(gè)處理區(qū)分開，PC2則只能明顯區(qū)分CK和B150，說明丁草胺對(duì)微生物碳源利用能力的影響仍存在，但中低濃度影響力開始減弱。第21頁(yè)/共26頁(yè)施藥45d，主成分因子PC1和主成分因子PC2貢獻(xiàn)率分別為41.38%和32.38%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率74.21%；PC1和PC2均能夠較好區(qū)分CK、B15和B150，而無法區(qū)分CK和B30。說明隨著丁草胺的自然降解，農(nóng)藥對(duì)土微生物碳源利用能力的影響逐漸消退。按此趨勢(shì)推測(cè)，若繼續(xù)培養(yǎng)，其它濃度處理微生物碳源利用能力也會(huì)逐漸恢復(fù)。第22頁(yè)/共26頁(yè)結(jié)論1）施用丁草胺會(huì)改變高產(chǎn)水稻土微生物群落代謝活性，中低濃度對(duì)微生物有促生長(zhǎng)作用，高濃度有抑制作用，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，促進(jìn)和抑制作用逐漸減緩，直至完全消失。2）施用丁草胺會(huì)對(duì)高產(chǎn)水稻土微生物群落碳源利用能力產(chǎn)生不利影響，施藥濃度是導(dǎo)致微生物群落碳源利用能力集中、可利用碳源種類數(shù)減