間接免疫熒光法測(cè)教學(xué)課件

抗核抗體【自身抗體】：指抗自身組織、器官、細(xì)胞及其成分的抗體【ANA】：指抗細(xì)胞核成分（DNA，RNA，蛋白質(zhì)和酶）的抗體。ANA存在一個(gè)譜ANA新概念：抗核酸（Nucleicacid）和核蛋白（Nucleoprotein）抗體的總稱某些核抗原成分在核仁和胞漿內(nèi)比核質(zhì)內(nèi)更豐富抗核抗體【自身抗體】：指抗自身組織、器官、細(xì)胞及其成分的抗體1ANA檢測(cè)的意義有助于疾病的診斷如抗Sm是SLE標(biāo)記抗體；

抗ScL-70是SD的標(biāo)記抗體；抗Jo-1是PM/DM的標(biāo)記抗體；觀察疾病活動(dòng)度和治療反應(yīng)研究發(fā)病機(jī)理ANA檢測(cè)的意義有助于疾病的診斷2【ANA分類】抗DNA（dsDNA,ssDNA)抗組蛋白（Histone)抗非組蛋白（Nonhistone,ExtractableNuclearAntigen,ENA）抗核仁（Nucleolus）【ANA分類】抗DNA（dsDNA,ssDNA)3幾種ENA的由來(lái)及同義詞Sm：病人名：SmithRNP:u1RNP或nRNPNuclearRibonucleoproteinSSA:ROSjogren’ssyndromeASSB:La,Ha,Sjogren’ssyndromeBJo-1:病人JohnScL-70:Scleroderma幾種ENA的由來(lái)及同義詞Sm：病人名：Smith4【ANA由來(lái)】中性粒細(xì)胞DNP(DNA-Histone)+抗DNP+補(bǔ)體均質(zhì)體LE細(xì)胞LE細(xì)胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等結(jié)締組織病，藥物過(guò)敏，慢活肝等亦可陽(yáng)性。抗DNP取代LE細(xì)胞的檢測(cè)+【ANA由來(lái)】中性粒細(xì)胞DNP(DNA-Histone)5ANA的篩選：間接免疫熒光法++抗原抗體（血清）抗原—抗體第二抗體ANA的篩選：間接免疫熒光法++抗原抗體（血清）抗原—抗體第6ANA的篩選：間接免疫熒光法ANA的篩選：間接免疫熒光法7幾種ENA的由來(lái)及同義詞藥物誘導(dǎo)的紅斑狼瘡 （100%）過(guò)敏，慢活肝等亦可陽(yáng)性。LE細(xì)胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等結(jié)締組織病，藥物檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，然后繼續(xù)下一張。在蓋玻片上滴加甘油/PBS。RNP:u1RNP或nRNPNuclearRibonucleoprotein熒光顯微鏡下觀察熒光。ANA陽(yáng)性者進(jìn)一步檢測(cè)各亞類ANA抗體對(duì)明確診斷、臨床分型、病情觀察、預(yù)后及治療評(píng)價(jià)有重要意義。隨后，結(jié)合抗體可與標(biāo)記熒光的二抗進(jìn)行反應(yīng)，并可在熒光顯微鏡下觀察。幾種ENA的由來(lái)及同義詞注意：為防止破壞基質(zhì)，不要擦拭反應(yīng)區(qū)的間隙。按照要求用記號(hào)筆對(duì)玻片進(jìn)行標(biāo)記。DNP(DNA-Histone)抗非組蛋白（Nonhistone,ExtractableNuclearAntigen,ENA）滴度定義：與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清相比，能觀察到特異性熒光反應(yīng)的最高稀釋度只有當(dāng)載片平衡到室溫后方可打開袋子。ANA陽(yáng)性者進(jìn)一步檢測(cè)各亞類ANA抗體對(duì)明確診斷、臨床分型、病情觀察、預(yù)后及治療評(píng)價(jià)有重要意義。Jo-1:病人John生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體可以與抗核抗原反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)原理：生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體可以與抗核抗原反應(yīng)；隨后，結(jié)合抗體可與標(biāo)記熒光的二抗進(jìn)行反應(yīng)，并可在熒光顯微鏡下觀察。幾種ENA的由來(lái)及同義詞實(shí)驗(yàn)原理：生物薄膜載片上的IgA、I8抗原人特異性抗體FITC標(biāo)記的抗人抗體FITC

FITC載片實(shí)驗(yàn)原理：抗原人特異性抗體FITC標(biāo)記的抗人抗體FITCFITC載片9生物薄片馬賽克TM技術(shù)生物薄片馬賽克TM技術(shù)10【實(shí)驗(yàn)步驟】【實(shí)驗(yàn)步驟】11實(shí)驗(yàn)步驟一：準(zhǔn)備檢查加樣板是否反應(yīng)區(qū)親水而周邊疏水？如果不是，可用濕紙巾擦拭，必要時(shí)可使用家用洗滌劑，再用水徹底沖洗。需要消毒時(shí)，可于3％的SekuseptExtra（漢高公司）中浸泡1小時(shí)。只有當(dāng)載片平衡到室溫后方可打開袋子。不要觸及生物薄片。按照要求用記號(hào)筆對(duì)玻片進(jìn)行標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)步驟一：準(zhǔn)備檢查加樣板是否反應(yīng)區(qū)親水而周邊疏水？如果不是12實(shí)驗(yàn)步驟二：樣品準(zhǔn)備1:100稀釋血清標(biāo)本。每次實(shí)驗(yàn)均需加入陽(yáng)性和陰性對(duì)照。對(duì)照血清使用前必須混勻。實(shí)驗(yàn)步驟二：樣品準(zhǔn)備1:100稀釋血清標(biāo)本。每次實(shí)驗(yàn)均需加入13實(shí)驗(yàn)步驟三：加樣在加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣泡。滴加完所有待測(cè)標(biāo)本后才開始溫育。使用聚苯乙烯加樣板。加樣體積:25μl/反應(yīng)區(qū)(5x5mm)12345樣品1樣品2樣品3陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)步驟三：加樣在加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣14實(shí)驗(yàn)步驟四：孵育將載片蓋在加樣板對(duì)應(yīng)的凹槽里，反應(yīng)即開始。確保每個(gè)標(biāo)本均能夠與生物薄片相接觸，而標(biāo)本之間不相互接觸。室溫（18-25℃）溫育30分鐘。實(shí)驗(yàn)步驟四：孵育將載片蓋在加樣板對(duì)應(yīng)的凹槽里，反應(yīng)即開始。確15實(shí)驗(yàn)步驟五：沖洗

用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘。實(shí)驗(yàn)步驟五：沖洗用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗16實(shí)驗(yàn)步驟六：加樣

將20μl熒光標(biāo)記的抗人球蛋白（熒光二抗）加入潔凈加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)。完全加完所有的二抗后，方可繼續(xù)溫育（最多可加50個(gè)載片）。建議使用連續(xù)加樣器。加樣前應(yīng)使用加樣器混勻。為節(jié)約時(shí)間，可在第一步溫育的同時(shí)滴加酶結(jié)合物至另一個(gè)加樣板的反應(yīng)區(qū)中。實(shí)驗(yàn)步驟六：加樣將20μl熒光標(biāo)記的抗人球蛋白（熒光二抗）17實(shí)驗(yàn)步驟七：孵育

從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，5秒鐘內(nèi)用吸水紙擦一下背面和邊緣后，立即將載片覆有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里。注意：為防止破壞基質(zhì)，不要擦拭反應(yīng)區(qū)的間隙。檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，然后繼續(xù)下一張。從現(xiàn)在開始，注意避免陽(yáng)光直射載片。室溫溫育30分鐘。實(shí)驗(yàn)步驟七：孵育從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張18實(shí)驗(yàn)步驟八：沖洗用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘?？稍诿?50ml磷酸鹽緩沖液中加10滴(150μl)伊文氏藍(lán)進(jìn)行復(fù)染。實(shí)驗(yàn)步驟八：沖洗用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載19實(shí)驗(yàn)步驟九：封片

在蓋玻片上滴加甘油/PBS。封片體積:10μl/反應(yīng)區(qū)(5x5mm)從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，用紙擦干背面和四邊，注意不要擦拭反應(yīng)區(qū)間隙。將載片的生物薄片朝下置于準(zhǔn)備好的蓋玻片上，立即檢查蓋玻片是否放入載片的凹槽里，如有必要，需調(diào)整位置，正確放置。然后再進(jìn)行下一個(gè)載片的操作。實(shí)驗(yàn)步驟九：封片在蓋玻片上滴加甘油/PBS。20實(shí)驗(yàn)步驟十：結(jié)果判斷熒光顯微鏡下觀察熒光。實(shí)驗(yàn)步驟十：結(jié)果判斷熒光顯微鏡下觀察熒光。21生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體可以與抗核抗原反應(yīng)；加樣體積:25μl/反應(yīng)區(qū)(5x5mm)DNP(DNA-Histone)只有當(dāng)載片平衡到室溫后方可打開袋子。LE細(xì)胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等結(jié)締組織病，藥物將載片蓋在加樣板對(duì)應(yīng)的凹槽里，反應(yīng)即開始。滴度定義：與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清相比，能觀察到特異性熒光反應(yīng)的最高稀釋度抗原片中出現(xiàn)陽(yáng)性染色細(xì)胞為ANA陽(yáng)性，否則為陰性。LE細(xì)胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等結(jié)締組織病，藥物幾種ENA的由來(lái)及同義詞對(duì)于核均質(zhì)性、著絲點(diǎn)、核點(diǎn)型等熒光模式，提示某種風(fēng)濕性疾病或其他疾病混合結(jié)締組織病 （100%）FITC標(biāo)記的抗人抗體將20μl熒光標(biāo)記的抗人球蛋白（熒光二抗）加入潔凈加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)?？狗墙M蛋白（Nonhistone,ExtractableNuclearAntigen,ENA）潰瘍性結(jié)腸炎 （26%）室溫（18-25℃）溫育30分鐘。將20μl熒光標(biāo)記的抗人球蛋白（熒光二抗）加入潔凈加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)。陰性，標(biāo)本中未檢測(cè)到抗核抗體細(xì)胞核發(fā)黃綠色熒光為陽(yáng)性染色細(xì)胞，不發(fā)熒光為陰性。從現(xiàn)在開始，注意避免陽(yáng)光直射載片。結(jié)果判讀：熒光顯微鏡下觀察

細(xì)胞核發(fā)黃綠色熒光為陽(yáng)性染色細(xì)胞，不發(fā)熒光為陰性?？乖谐霈F(xiàn)陽(yáng)性染色細(xì)胞為ANA陽(yáng)性，否則為陰性。陽(yáng)性待檢血清可作進(jìn)一步稀釋后測(cè)定效價(jià)。生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體可以與抗核22【均質(zhì)型】

細(xì)胞核呈均勻一致的熒光

【均質(zhì)型】

細(xì)胞核呈均勻一致的熒光

23【核仁型】

核仁部分呈現(xiàn)熒光【核仁型】

核仁部分呈現(xiàn)熒光24【斑點(diǎn)型】(顆粒型)

細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀熒光【斑點(diǎn)型】(顆粒型)

細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀熒光25【胞漿型】【胞漿型】26【著絲點(diǎn)型】【著絲點(diǎn)型】27

混合型：存在兩種以上的類型

混合型：存在兩種以上的類型

混合型：存在兩種以上的類型

混合型：存在兩種以上的類型28提示某種風(fēng)濕病或其他疾病抗組蛋白（Histone)提示某種風(fēng)濕病或其他疾病過(guò)敏，慢活肝等亦可陽(yáng)性。抗非組蛋白（Nonhistone,ExtractableNuclearAntigen,ENA）FITC標(biāo)記的抗人抗體【ANA】：指抗細(xì)胞核成分（DNA，RNA，蛋白質(zhì)和酶）的抗體。熒光顯微鏡下觀察熒光。生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體可以與抗核抗原反應(yīng)；混合結(jié)締組織病 （100%）SSB:La,Ha,Sjogren’ssyndromeB非活動(dòng)性SLE （80-100%）過(guò)敏，慢活肝等亦可陽(yáng)性。滴度定義：與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清相比，能觀察到特異性熒光反應(yīng)的最高稀釋度只有當(dāng)載片平衡到室溫后方可打開袋子。1:100稀釋血清標(biāo)本。可在每150ml磷酸鹽緩沖液中加10滴(150μl)伊文氏藍(lán)進(jìn)行復(fù)染。按照要求用記號(hào)筆對(duì)玻片進(jìn)行標(biāo)記?？狗墙M蛋白（Nonhistone,ExtractableNuclearAntigen,ENA）陰性，標(biāo)本中未檢測(cè)到抗核抗體ANA結(jié)果判斷1：100陰性陰性，標(biāo)本中未檢測(cè)到抗核抗體1：100陽(yáng)性微量對(duì)于核均質(zhì)性、著絲點(diǎn)、核點(diǎn)型等熒光模式，提示某種風(fēng)濕性疾病或其他疾病1：320陽(yáng)性陽(yáng)性提示某種風(fēng)濕病或其他疾病滴度定義：與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清相比，能觀察到特異性熒光反應(yīng)的最高稀釋度提示某種風(fēng)濕病或其他疾病ANA結(jié)果判斷1：100陰性陰性，29【臨床意義】總的ANA檢測(cè)在臨床診斷與鑒別診斷中是一個(gè)極為重要的篩選試驗(yàn)。絕大多數(shù)自身免疫性疾病均可呈陽(yáng)性。ANA陽(yáng)性者進(jìn)一步檢測(cè)各亞類ANA抗體對(duì)明確診斷、臨床分型、病情觀察、預(yù)后及治療評(píng)價(jià)有重要意義。未經(jīng)治療的、活動(dòng)性SLE的陽(yáng)性率為80%－100%。藥物性狼瘡100%、全身硬皮病、混合性結(jié)綈組織病、狼瘡性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化等。干燥綜合癥（SS）、類風(fēng)關(guān)、橋本甲狀腺炎等?！九R床意義】30活動(dòng)性SLE

（95-100%）非活動(dòng)性SLE

（80-100%）藥物誘導(dǎo)的紅斑狼瘡 （100%）混合結(jié)締組織病 （100%）類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 （20-40%）其他風(fēng)濕性疾病 （20-50%）進(jìn)行性系統(tǒng)硬化癥 （85-95%）多肌炎、皮肌炎 （30-50%）干燥綜合征 （70-80%）慢性活動(dòng)性肝炎 （30-40%）潰瘍性結(jié)腸炎 （26%）活動(dòng)性SLE （95-1031ThankYou!ThankYou!32實(shí)驗(yàn)步驟三：加樣在加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣泡。滴加完所有待測(cè)標(biāo)本后才開始溫育。使用聚苯乙烯加樣板。加樣體積:25μl/反應(yīng)區(qū)(5x5mm)12345樣品1樣品2樣品3陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)步驟三：加樣在加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣33實(shí)驗(yàn)步驟七：孵育

從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，5秒鐘內(nèi)用吸水紙擦一下背面和邊緣后，立即將載片覆有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里。注意：為防止破壞基質(zhì)，不要擦拭反應(yīng)區(qū)的間隙。檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，然后繼續(xù)下一張。從現(xiàn)在開始，注意避免陽(yáng)光直射載片。室溫溫育30分鐘。實(shí)驗(yàn)步驟七：孵育從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張34抗原片中出現(xiàn)陽(yáng)性染色細(xì)胞為ANA陽(yáng)性，否則為陰性。某些核抗原成分在核仁和胞漿內(nèi)比核質(zhì)內(nèi)更豐富未經(jīng)治療的、活動(dòng)性SLE的陽(yáng)性率為80%－100%。對(duì)照血清使用前必須混勻。多肌炎、皮肌炎 （30-50%）將載片的生物薄片朝下置于準(zhǔn)備好的蓋玻片上，立即檢查蓋玻片是否放入載片的凹槽里，如有必要，需調(diào)整位置，正確放置。隨后，結(jié)合抗體可與標(biāo)記熒光的二抗進(jìn)行反應(yīng)，并可在熒光顯微鏡下觀察。將20μl熒光標(biāo)記的抗人球蛋白（熒光二抗）加入潔凈加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)。細(xì)胞核發(fā)黃綠色熒光為陽(yáng)性染色細(xì)胞，不發(fā)熒光為陰性。細(xì)胞核發(fā)黃綠色熒光為陽(yáng)性染色細(xì)胞，不發(fā)熒光為陰性。檢查加樣板是否反應(yīng)區(qū)親水而周邊疏水？如果不是，可用濕紙巾擦拭，必要時(shí)可使用家用洗滌劑，再用水徹底沖洗。將載片的生物薄片朝下置于準(zhǔn)備好的蓋玻片上，立即檢查蓋玻片是否放入載片的凹槽里，如有必要，需調(diào)整位置，正確放置。幾種ENA的由來(lái)及同義詞幾種ENA的由來(lái)及同義詞混合結(jié)締組織病 （100%）抗DNP取代LE細(xì)胞的檢測(cè)提示某種風(fēng)濕病或其他疾病1:100稀釋血清標(biāo)本。藥物誘導(dǎo)的紅斑狼瘡 （100%）檢查加樣板是否反應(yīng)區(qū)親水而周邊疏水？如果不是，可用濕紙巾擦拭，必要時(shí)可使用家用洗滌劑，再用水徹底沖洗。實(shí)驗(yàn)步驟十：結(jié)果判斷熒光顯微鏡下觀察熒光。抗原片中出現(xiàn)陽(yáng)性染色細(xì)胞為ANA陽(yáng)性，否則為陰性。實(shí)驗(yàn)步驟十35【胞漿型】【胞漿型】36ANA結(jié)果判斷1：100陰性陰性，標(biāo)本中未檢測(cè)到抗核抗體1：100陽(yáng)性微量對(duì)于核均質(zhì)性、著絲點(diǎn)、核點(diǎn)型等熒光模式，提示某種風(fēng)濕性疾病或其他疾病1：320陽(yáng)性陽(yáng)性提示某種風(fēng)濕病或其他疾病滴度定義：與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清相比，能觀察到特異性熒光反應(yīng)的最高稀釋度ANA結(jié)果判斷1：100陰性陰性，標(biāo)本中未檢測(cè)到抗核抗體137陰性，標(biāo)本中未檢測(cè)到抗核抗體對(duì)于核均質(zhì)性、著絲點(diǎn)、核點(diǎn)型等熒光模式，提示某種風(fēng)濕性疾病或其他疾病細(xì)胞核發(fā)黃綠色熒光為陽(yáng)性染色細(xì)胞，不發(fā)熒光為陰性。FITC標(biāo)記的抗人抗體【自身抗體】：指抗自身組織、器官、細(xì)胞及其成分的抗體只有當(dāng)載片平衡到室溫后方可打開袋子。檢查加樣板是否反應(yīng)區(qū)親水而周邊疏水？如果不是，可用濕紙巾擦拭，必要時(shí)可使用家用洗滌劑，再用水徹底沖洗。抗核仁（Nucleolus）1:100稀釋血清標(biāo)本?？乖谐霈F(xiàn)陽(yáng)性染色細(xì)胞為ANA陽(yáng)性，否則為陰性。ANA陽(yáng)性者進(jìn)一步檢測(cè)各亞類ANA抗體對(duì)明確診斷、臨床分型、病情觀察、預(yù)后及治療評(píng)價(jià)有重要意義。過(guò)敏，慢活肝等亦可陽(yáng)性。隨后，結(jié)合抗體可與標(biāo)記熒光的二抗進(jìn)行反應(yīng)，并可在熒光顯微鏡下觀察。生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體可以與抗核抗原反應(yīng)；檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，然后繼續(xù)下一張。陰性，標(biāo)本中未檢測(cè)到抗核抗體用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘。干燥綜合征 （70-80%）慢性活動(dòng)性肝炎 （30-40%）加樣體積:25μl/反應(yīng)區(qū)(5x5mm)【斑點(diǎn)型】(顆粒型)

細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀熒光為節(jié)約時(shí)間，可在第一步溫育的同時(shí)滴加酶結(jié)合物至另一個(gè)加樣板的反應(yīng)區(qū)中。ANA的篩選：間接免疫熒光法陰性，標(biāo)本中未檢測(cè)到抗核抗體滴度定義：與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清相比，能觀察到特異性熒光反應(yīng)的最高稀釋度提示某種風(fēng)濕病或其他疾病隨后，結(jié)合抗體可與標(biāo)記熒光的二抗進(jìn)行反應(yīng)，并可在熒光顯微鏡下觀察。陰性，標(biāo)本中未檢測(cè)到抗核抗體生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體可以與抗核抗原反應(yīng)；抗原片中出現(xiàn)陽(yáng)性染色細(xì)胞為ANA陽(yáng)性，否則為陰性。熒光顯微鏡下觀察熒光。用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘。RNP:u1RNP或nRNPNuclearRibonucleoprotein檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，然后繼續(xù)下一張。ANA陽(yáng)性者進(jìn)一步檢測(cè)各亞類ANA抗體對(duì)明確診斷、臨床分型、病情觀察、預(yù)后及治療評(píng)價(jià)有重要意義。生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體可以與抗核抗原反應(yīng)；注意：為防止破壞基質(zhì)，不要擦拭反應(yīng)區(qū)的間隙。幾種ENA的由來(lái)及同義詞Jo-1:病人John將載片蓋在加樣板對(duì)應(yīng)的凹槽里，反應(yīng)即開始?！続NA】：指抗細(xì)胞核成分（DNA，RNA，蛋白質(zhì)和酶）的抗體。ThankYou!陰性，標(biāo)本中未檢測(cè)到抗核抗體為節(jié)約時(shí)間，可在第一步溫育的同時(shí)38抗核抗體【自身抗體】：指抗自身組織、器官、細(xì)胞及其成分的抗體【ANA】：指抗細(xì)胞核成分（DNA，RNA，蛋白質(zhì)和酶）的抗體。ANA存在一個(gè)譜ANA新概念：抗核酸（Nucleicacid）和核蛋白（Nucleoprotein）抗體的總稱某些核抗原成分在核仁和胞漿內(nèi)比核質(zhì)內(nèi)更豐富抗核抗體【自身抗體】：指抗自身組織、器官、細(xì)胞及其成分的抗體39ANA檢測(cè)的意義有助于疾病的診斷如抗Sm是SLE標(biāo)記抗體；

抗ScL-70是SD的標(biāo)記抗體；抗Jo-1是PM/DM的標(biāo)記抗體；觀察疾病活動(dòng)度和治療反應(yīng)研究發(fā)病機(jī)理ANA檢測(cè)的意義有助于疾病的診斷40【ANA分類】抗DNA（dsDNA,ssDNA)抗組蛋白（Histone)抗非組蛋白（Nonhistone,ExtractableNuclearAntigen,ENA）抗核仁（Nucleolus）【ANA分類】抗DNA（dsDNA,ssDNA)41幾種ENA的由來(lái)及同義詞Sm：病人名：SmithRNP:u1RNP或nRNPNuclearRibonucleoproteinSSA:ROSjogren’ssyndromeASSB:La,Ha,Sjogren’ssyndromeBJo-1:病人JohnScL-70:Scleroderma幾種ENA的由來(lái)及同義詞Sm：病人名：Smith42【ANA由來(lái)】中性粒細(xì)胞DNP(DNA-Histone)+抗DNP+補(bǔ)體均質(zhì)體LE細(xì)胞LE細(xì)胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等結(jié)締組織病，藥物過(guò)敏，慢活肝等亦可陽(yáng)性。抗DNP取代LE細(xì)胞的檢測(cè)+【ANA由來(lái)】中性粒細(xì)胞DNP(DNA-Histone)43ANA的篩選：間接免疫熒光法++抗原抗體（血清）抗原—抗體第二抗體ANA的篩選：間接免疫熒光法++抗原抗體（血清）抗原—抗體第44ANA的篩選：間接免疫熒光法ANA的篩選：間接免疫熒光法45幾種ENA的由來(lái)及同義詞藥物誘導(dǎo)的紅斑狼瘡 （100%）過(guò)敏，慢活肝等亦可陽(yáng)性。LE細(xì)胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等結(jié)締組織病，藥物檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，然后繼續(xù)下一張。在蓋玻片上滴加甘油/PBS。RNP:u1RNP或nRNPNuclearRibonucleoprotein熒光顯微鏡下觀察熒光。ANA陽(yáng)性者進(jìn)一步檢測(cè)各亞類ANA抗體對(duì)明確診斷、臨床分型、病情觀察、預(yù)后及治療評(píng)價(jià)有重要意義。隨后，結(jié)合抗體可與標(biāo)記熒光的二抗進(jìn)行反應(yīng)，并可在熒光顯微鏡下觀察。幾種ENA的由來(lái)及同義詞注意：為防止破壞基質(zhì)，不要擦拭反應(yīng)區(qū)的間隙。按照要求用記號(hào)筆對(duì)玻片進(jìn)行標(biāo)記。DNP(DNA-Histone)抗非組蛋白（Nonhistone,ExtractableNuclearAntigen,ENA）滴度定義：與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清相比，能觀察到特異性熒光反應(yīng)的最高稀釋度只有當(dāng)載片平衡到室溫后方可打開袋子。ANA陽(yáng)性者進(jìn)一步檢測(cè)各亞類ANA抗體對(duì)明確診斷、臨床分型、病情觀察、預(yù)后及治療評(píng)價(jià)有重要意義。Jo-1:病人John生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體可以與抗核抗原反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)原理：生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體可以與抗核抗原反應(yīng)；隨后，結(jié)合抗體可與標(biāo)記熒光的二抗進(jìn)行反應(yīng)，并可在熒光顯微鏡下觀察。幾種ENA的由來(lái)及同義詞實(shí)驗(yàn)原理：生物薄膜載片上的IgA、I46抗原人特異性抗體FITC標(biāo)記的抗人抗體FITC

FITC載片實(shí)驗(yàn)原理：抗原人特異性抗體FITC標(biāo)記的抗人抗體FITCFITC載片47生物薄片馬賽克TM技術(shù)生物薄片馬賽克TM技術(shù)48【實(shí)驗(yàn)步驟】【實(shí)驗(yàn)步驟】49實(shí)驗(yàn)步驟一：準(zhǔn)備檢查加樣板是否反應(yīng)區(qū)親水而周邊疏水？如果不是，可用濕紙巾擦拭，必要時(shí)可使用家用洗滌劑，再用水徹底沖洗。需要消毒時(shí)，可于3％的SekuseptExtra（漢高公司）中浸泡1小時(shí)。只有當(dāng)載片平衡到室溫后方可打開袋子。不要觸及生物薄片。按照要求用記號(hào)筆對(duì)玻片進(jìn)行標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)步驟一：準(zhǔn)備檢查加樣板是否反應(yīng)區(qū)親水而周邊疏水？如果不是50實(shí)驗(yàn)步驟二：樣品準(zhǔn)備1:100稀釋血清標(biāo)本。每次實(shí)驗(yàn)均需加入陽(yáng)性和陰性對(duì)照。對(duì)照血清使用前必須混勻。實(shí)驗(yàn)步驟二：樣品準(zhǔn)備1:100稀釋血清標(biāo)本。每次實(shí)驗(yàn)均需加入51實(shí)驗(yàn)步驟三：加樣在加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣泡。滴加完所有待測(cè)標(biāo)本后才開始溫育。使用聚苯乙烯加樣板。加樣體積:25μl/反應(yīng)區(qū)(5x5mm)12345樣品1樣品2樣品3陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)步驟三：加樣在加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣52實(shí)驗(yàn)步驟四：孵育將載片蓋在加樣板對(duì)應(yīng)的凹槽里，反應(yīng)即開始。確保每個(gè)標(biāo)本均能夠與生物薄片相接觸，而標(biāo)本之間不相互接觸。室溫（18-25℃）溫育30分鐘。實(shí)驗(yàn)步驟四：孵育將載片蓋在加樣板對(duì)應(yīng)的凹槽里，反應(yīng)即開始。確53實(shí)驗(yàn)步驟五：沖洗

用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘。實(shí)驗(yàn)步驟五：沖洗用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗54實(shí)驗(yàn)步驟六：加樣

將20μl熒光標(biāo)記的抗人球蛋白（熒光二抗）加入潔凈加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)。完全加完所有的二抗后，方可繼續(xù)溫育（最多可加50個(gè)載片）。建議使用連續(xù)加樣器。加樣前應(yīng)使用加樣器混勻。為節(jié)約時(shí)間，可在第一步溫育的同時(shí)滴加酶結(jié)合物至另一個(gè)加樣板的反應(yīng)區(qū)中。實(shí)驗(yàn)步驟六：加樣將20μl熒光標(biāo)記的抗人球蛋白（熒光二抗）55實(shí)驗(yàn)步驟七：孵育

從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，5秒鐘內(nèi)用吸水紙擦一下背面和邊緣后，立即將載片覆有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里。注意：為防止破壞基質(zhì)，不要擦拭反應(yīng)區(qū)的間隙。檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，然后繼續(xù)下一張。從現(xiàn)在開始，注意避免陽(yáng)光直射載片。室溫溫育30分鐘。實(shí)驗(yàn)步驟七：孵育從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張56實(shí)驗(yàn)步驟八：沖洗用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載片，然后立即放入裝有PBS-Tween緩沖液的小杯中浸洗至少5分鐘?？稍诿?50ml磷酸鹽緩沖液中加10滴(150μl)伊文氏藍(lán)進(jìn)行復(fù)染。實(shí)驗(yàn)步驟八：沖洗用燒杯盛PBS-Tween緩沖液，流水沖洗載57實(shí)驗(yàn)步驟九：封片

在蓋玻片上滴加甘油/PBS。封片體積:10μl/反應(yīng)區(qū)(5x5mm)從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，用紙擦干背面和四邊，注意不要擦拭反應(yīng)區(qū)間隙。將載片的生物薄片朝下置于準(zhǔn)備好的蓋玻片上，立即檢查蓋玻片是否放入載片的凹槽里，如有必要，需調(diào)整位置，正確放置。然后再進(jìn)行下一個(gè)載片的操作。實(shí)驗(yàn)步驟九：封片在蓋玻片上滴加甘油/PBS。58實(shí)驗(yàn)步驟十：結(jié)果判斷熒光顯微鏡下觀察熒光。實(shí)驗(yàn)步驟十：結(jié)果判斷熒光顯微鏡下觀察熒光。59生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體可以與抗核抗原反應(yīng)；加樣體積:25μl/反應(yīng)區(qū)(5x5mm)DNP(DNA-Histone)只有當(dāng)載片平衡到室溫后方可打開袋子。LE細(xì)胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等結(jié)締組織病，藥物將載片蓋在加樣板對(duì)應(yīng)的凹槽里，反應(yīng)即開始。滴度定義：與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清相比，能觀察到特異性熒光反應(yīng)的最高稀釋度抗原片中出現(xiàn)陽(yáng)性染色細(xì)胞為ANA陽(yáng)性，否則為陰性。LE細(xì)胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等結(jié)締組織病，藥物幾種ENA的由來(lái)及同義詞對(duì)于核均質(zhì)性、著絲點(diǎn)、核點(diǎn)型等熒光模式，提示某種風(fēng)濕性疾病或其他疾病混合結(jié)締組織病 （100%）FITC標(biāo)記的抗人抗體將20μl熒光標(biāo)記的抗人球蛋白（熒光二抗）加入潔凈加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)?？狗墙M蛋白（Nonhistone,ExtractableNuclearAntigen,ENA）潰瘍性結(jié)腸炎 （26%）室溫（18-25℃）溫育30分鐘。將20μl熒光標(biāo)記的抗人球蛋白（熒光二抗）加入潔凈加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)。陰性，標(biāo)本中未檢測(cè)到抗核抗體細(xì)胞核發(fā)黃綠色熒光為陽(yáng)性染色細(xì)胞，不發(fā)熒光為陰性。從現(xiàn)在開始，注意避免陽(yáng)光直射載片。結(jié)果判讀：熒光顯微鏡下觀察

細(xì)胞核發(fā)黃綠色熒光為陽(yáng)性染色細(xì)胞，不發(fā)熒光為陰性。抗原片中出現(xiàn)陽(yáng)性染色細(xì)胞為ANA陽(yáng)性，否則為陰性。陽(yáng)性待檢血清可作進(jìn)一步稀釋后測(cè)定效價(jià)。生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體可以與抗核60【均質(zhì)型】

細(xì)胞核呈均勻一致的熒光

【均質(zhì)型】

細(xì)胞核呈均勻一致的熒光

61【核仁型】

核仁部分呈現(xiàn)熒光【核仁型】

核仁部分呈現(xiàn)熒光62【斑點(diǎn)型】(顆粒型)

細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀熒光【斑點(diǎn)型】(顆粒型)

細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)斑點(diǎn)狀熒光63【胞漿型】【胞漿型】64【著絲點(diǎn)型】【著絲點(diǎn)型】65

混合型：存在兩種以上的類型

混合型：存在兩種以上的類型

混合型：存在兩種以上的類型

混合型：存在兩種以上的類型66提示某種風(fēng)濕病或其他疾病抗組蛋白（Histone)提示某種風(fēng)濕病或其他疾病過(guò)敏，慢活肝等亦可陽(yáng)性?？狗墙M蛋白（Nonhistone,ExtractableNuclearAntigen,ENA）FITC標(biāo)記的抗人抗體【ANA】：指抗細(xì)胞核成分（DNA，RNA，蛋白質(zhì)和酶）的抗體。熒光顯微鏡下觀察熒光。生物薄膜載片上的IgA、IgG、IgM類特異性抗體可以與抗核抗原反應(yīng)；混合結(jié)締組織病 （100%）SSB:La,Ha,Sjogren’ssyndromeB非活動(dòng)性SLE （80-100%）過(guò)敏，慢活肝等亦可陽(yáng)性。滴度定義：與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清相比，能觀察到特異性熒光反應(yīng)的最高稀釋度只有當(dāng)載片平衡到室溫后方可打開袋子。1:100稀釋血清標(biāo)本?？稍诿?50ml磷酸鹽緩沖液中加10滴(150μl)伊文氏藍(lán)進(jìn)行復(fù)染。按照要求用記號(hào)筆對(duì)玻片進(jìn)行標(biāo)記。抗非組蛋白（Nonhistone,ExtractableNuclearAntigen,ENA）陰性，標(biāo)本中未檢測(cè)到抗核抗體ANA結(jié)果判斷1：100陰性陰性，標(biāo)本中未檢測(cè)到抗核抗體1：100陽(yáng)性微量對(duì)于核均質(zhì)性、著絲點(diǎn)、核點(diǎn)型等熒光模式，提示某種風(fēng)濕性疾病或其他疾病1：320陽(yáng)性陽(yáng)性提示某種風(fēng)濕病或其他疾病滴度定義：與相同稀釋倍數(shù)的陰性血清相比，能觀察到特異性熒光反應(yīng)的最高稀釋度提示某種風(fēng)濕病或其他疾病ANA結(jié)果判斷1：100陰性陰性，67【臨床意義】總的ANA檢測(cè)在臨床診斷與鑒別診斷中是一個(gè)極為重要的篩選試驗(yàn)。絕大多數(shù)自身免疫性疾病均可呈陽(yáng)性。ANA陽(yáng)性者進(jìn)一步檢測(cè)各亞類ANA抗體對(duì)明確診斷、臨床分型、病情觀察、預(yù)后及治療評(píng)價(jià)有重要意義。未經(jīng)治療的、活動(dòng)性SLE的陽(yáng)性率為80%－100%。藥物性狼瘡100%、全身硬皮病、混合性結(jié)綈組織病、狼瘡性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化等。干燥綜合癥（SS）、類風(fēng)關(guān)、橋本甲狀腺炎等?！九R床意義】68活動(dòng)性SLE

（95-100%）非活動(dòng)性SLE

（80-100%）藥物誘導(dǎo)的紅斑狼瘡 （100%）混合結(jié)締組織病 （100%）類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 （20-40%）其他風(fēng)濕性疾病 （20-50%）進(jìn)行性系統(tǒng)硬化癥 （85-95%）多肌炎、皮肌炎 （30-50%）干燥綜合征 （70-80%）慢性活動(dòng)性肝炎 （30-40%）潰瘍性結(jié)腸炎 （26%）活動(dòng)性SLE （95-1069ThankYou!ThankYou!70實(shí)驗(yàn)步驟三：加樣在加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣泡。滴加完所有待測(cè)標(biāo)本后才開始溫育。使用聚苯乙烯加樣板。加樣體積:25μl/反應(yīng)區(qū)(5x5mm)12345樣品1樣品2樣品3陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)步驟三：加樣在加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)加入稀釋血清，避免產(chǎn)生氣71實(shí)驗(yàn)步驟七：孵育

從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張載片，5秒鐘內(nèi)用吸水紙擦一下背面和邊緣后，立即將載片覆有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里。注意：為防止破壞基質(zhì)，不要擦拭反應(yīng)區(qū)的間隙。檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，然后繼續(xù)下一張。從現(xiàn)在開始，注意避免陽(yáng)光直射載片。室溫溫育30分鐘。實(shí)驗(yàn)步驟七：孵育從PBS-Tween清洗緩沖液中取出一張72抗原片中出現(xiàn)陽(yáng)性染色細(xì)胞為ANA陽(yáng)性，否則為陰性。某些核抗原成分在核仁和胞漿內(nèi)比核質(zhì)內(nèi)更豐富未經(jīng)治療的、活動(dòng)性SLE的陽(yáng)性率為80%－100%。對(duì)照血清使用前必須混勻。多肌炎、皮肌炎 （30-50%）將載片的生物薄片朝下置于準(zhǔn)備好的蓋玻片上，立即檢查蓋玻片是否放入載片的凹槽里，如有必要，需調(diào)整位置，正確放置。隨后，結(jié)合抗體可與標(biāo)記熒光的二抗進(jìn)行反應(yīng)，并可在熒光顯微鏡下觀察。將20μl熒光標(biāo)記的抗人球蛋白（熒光二抗）加入潔凈加樣板的每個(gè)反應(yīng)區(qū)。細(xì)胞核發(fā)黃綠色熒光為陽(yáng)性染色細(xì)胞，不發(fā)熒光為陰性。細(xì)胞核發(fā)黃綠色熒光為陽(yáng)性染色細(xì)胞，不發(fā)熒光為陰性。檢查加樣板是否反應(yīng)區(qū)親水而周邊疏水？如果不是，可用濕紙巾擦拭，必要時(shí)可使用家用洗滌劑，再用水徹底沖洗。將載片的生物薄片朝下置于準(zhǔn)備好的蓋玻片上，立即檢查蓋玻片是否放入載片的凹槽里，如有必要，需調(diào)整位置，正確放置。幾種ENA的由來(lái)及同義詞幾種ENA的由來(lái)及同義詞混合結(jié)締組織病 （100%）