食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 畜肉食品中鴨源性成分PCR檢測(cè)方法

畜肉食品中中鴨源性成分檢測(cè)方法PCR法范圍本方法規(guī)定了畜肉食品中鴨源性成分檢測(cè)方法。本方法適用于新鮮、冰凍畜肉和肉干、肉醬、醬肉、火腿、肉松等畜肉加工食品中鴨成分定性檢測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。術(shù)語(yǔ)和定義鴨源性成分duck-derivedmaterials鴨種屬特異性DNA片段。原理對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取，使之適用于PCR檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)PCR擴(kuò)增，檢測(cè)其中是否含有鴨特異性基因序列，達(dá)到對(duì)畜肉食品中鴨源性成分定性PCR檢測(cè)的目的。試劑和材料除特別說(shuō)明以外，所用試劑均為分析純，水為按照GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。所有試劑均用無(wú)DNA酶污染的容器分裝。鴨源性成分檢測(cè)用引物（對(duì)）序列為：F：5’-CATCTATCCTGCTAGCCGCC-3’R：5’-GGCTTGAGTGGAAGAATGCC-3’CTAB提取緩沖液：CTAB20g/L，氯化鈉1.4mol/L，Triso.1mol/L，EDTA20mmol/L，pH8.0，高壓滅菌。使用前加入終濃度為2%的β-巰基乙醇。CTAB沉淀液：CTAB5g/L，氯化鈉0.04mol/L，pH8.0，高壓滅菌。氯化鈉溶液：1.2mol/L。蛋白酶K溶液：凍干品，用高壓滅菌的去離子水或雙蒸水溶解為20mg/mL的溶液，分裝后于-20℃保存，避免反復(fù)凍融。無(wú)水乙醇、異丙醇等有機(jī)試劑。食物基因組DNA提取純化試劑盒。10×PCR緩沖液：200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化鉀，15mmol/L氯化鎂。dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。TaqDNA聚合酶。分子量標(biāo)記：100bpDNAMarker。瓊脂糖：電泳純。儀器和設(shè)備天平：感量0.01g。PCR儀。電泳儀。凝膠成像系統(tǒng)。高速冷凍離心機(jī)：最高轉(zhuǎn)速12000r/min以上。核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。振蕩器。恒溫水浴鍋。冰箱：2℃～-20℃。微量可調(diào)移液器及配套吸頭：0.5μL~10μL、10μL~100μL、20μL~200μL、200μL~1000μL。離心管：1.5mL。抽樣采樣工具下列采樣工具應(yīng)經(jīng)180℃±2℃，2h高溫滅菌：剪刀、鑷子、釬子。樣品采集待檢樣品裝入一次性塑料袋或其他滅菌容器，編號(hào)，送實(shí)驗(yàn)室。樣品儲(chǔ)運(yùn)樣品采集后，將采集的樣品放入密閉的塑料袋內(nèi)（一個(gè)采樣點(diǎn)的樣品放入一個(gè)塑料袋），于保溫箱中加冰、密封，送實(shí)驗(yàn)室。試樣制備與保存試樣制備從原始樣品中取出部分有代表性樣品，將可食部分用絞碎機(jī)絞碎，充分混勻，用四分法縮分出不少于500g作為試樣。裝入清潔容器中，加封后，標(biāo)明標(biāo)記。試樣保存將試樣于-20℃冷凍保存。檢測(cè)步驟待檢樣品的制備樣品的設(shè)置檢測(cè)過(guò)程中設(shè)置核酸提取空白對(duì)照、PCR擴(kuò)增空白對(duì)照、PCR擴(kuò)增陰性對(duì)照、PCR擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照。樣品前處理加工食品可能富含鹽、糖、植物色素和發(fā)酵產(chǎn)生的有色物質(zhì)等，會(huì)影響下游實(shí)驗(yàn)操作，應(yīng)通過(guò)洗滌方式的樣品前處理盡量去除樣品中的鹽、糖和色素。具體步驟是：取約500mg樣品加入50mL離心管，加入約2倍體積的雙蒸水，上下顛倒充分混勻，8000g離心5min并棄去上清夜，重新加入約2倍體積的雙蒸水，上下顛倒混勻，8000g離心5min并棄去上清夜，必要時(shí)用三氯甲烷清洗樣品1次。懸乳濁或濁狀的液體食品樣品，如醬汁等，可以通過(guò)物理方式破壞膠體穩(wěn)定性并分離、濃縮。取適量樣品加入2mL離心管，8000g離心5min并棄去上清液，再次加入適量樣品，8000g離心5min并棄去上清液，必要時(shí)用三氯甲烷清洗樣品1次。樣品均質(zhì)采用均質(zhì)器、攪拌機(jī)、研缽等實(shí)驗(yàn)器具對(duì)樣品進(jìn)行均質(zhì)處理。DNA提取和純化CTAB法稱取500mg待檢樣品于15mL離心管中，加入5mLCTAB裂解液和20μL蛋白酶K溶液，65℃溫育1h，期間不時(shí)震蕩混勻，應(yīng)保證樣品自由懸浮于液體中，必要時(shí)，再加入適量CTAB裂解液；8000g離心5min，取1mL上清于2mL離心管中，加700μL三氯甲烷，漩渦震蕩30s，14500g離心10min，收集600μL~650μL上清液到新的2mL離心管中，加入2倍體積的CTAB沉淀液，室溫60min；14500g離心5min，去除上清液，加350μL氯化鈉溶液溶解沉淀，加等體積三氯甲烷，漩渦震蕩30s，14500g離心10min，轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管。加0.8倍體積異丙醇，室溫20min，14500g離心10min，加500μL70%乙醇水溶液，漩渦震蕩30s，14500g離心10min，去除上清液，室溫條件下過(guò)夜或者60℃烘15min~25min，注意不要讓沉淀過(guò)干。加50μL雙蒸水溶解沉淀，-20℃保存。試劑盒法采用商品化的食品基因組DNA提取純化試劑盒，按照試劑盒使用說(shuō)明提取DNA。DNA濃度測(cè)定采用紫外分光光度法測(cè)定DNA，所測(cè)得OD值為核酸總量。紫外分光光度法檢測(cè)核酸濃度的最佳范圍是2μg/mL~50μg/mL，值應(yīng)該在0.05~1的區(qū)間內(nèi)。將DNA溶液做適當(dāng)?shù)南♂?，放入紫外分光光度?jì)的比色皿中，于260nm處測(cè)定其吸收值，1OD260nm=50μg/mL雙鏈DNA或38μg/mL單鏈DNA。PCR級(jí)DNA溶液的OD260nm/OD280nm比值為1.7~2.0。PCR檢測(cè)PCR反應(yīng)體系表1PCR反應(yīng)體系試劑加入量（）10×PCRbuffer2.5dNTP溶液（10mmol/L）0.5TaqDNA聚合酶（5U/）0.2上游引物（10μmol/L）1.0下游引物（10μmol/L）1.0DNA模板（100ng/）2.0補(bǔ)水至25PCR擴(kuò)增條件94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。不同儀器、不同TaqDNA聚合酶可根據(jù)要求將反應(yīng)條件做適當(dāng)調(diào)整。凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物用電泳緩沖液（1×TAE）制備1.0%~1.2%瓊脂糖凝膠（55℃~60℃時(shí)加入溴化乙錠至終濃度為0.5g/mL，也可在電泳后進(jìn)行染色）。取8L~15LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別和2L上樣緩沖液混合，進(jìn)行點(diǎn)樣，用100bpDNAMarker作參照。9V/cm恒壓電泳，電泳20min~40min，電泳檢測(cè)結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)記錄并保存。限制性內(nèi)切酶酶切及產(chǎn)物電泳檢測(cè)如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)。反應(yīng)體系（20L）：Stu

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酶2U，酶切緩沖液2L，加入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物至總體積20L。酶切在37℃下進(jìn)行，20min。酶切完成后電泳，方法見(jiàn)8.4.3。結(jié)果判斷與表述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為201bp（序列參考附錄A）。酶切性內(nèi)切酶酶切結(jié)果陽(yáng)性樣品PCR產(chǎn)物采用內(nèi)切酶Stu

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酶切后，酶切片段大小為118bp和83bp。結(jié)果表述PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物都為陽(yáng)性者判定含有鴨源性成分，表述為檢出鴨源性成分；PCR產(chǎn)物為陰性者判定不含有鴨源性成分，表述為未檢出鴨源性成分。檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403執(zhí)行。廢棄物處理檢測(cè)過(guò)程中的廢棄物，收集后在焚燒爐中焚燒處理。附錄A（資料性附錄）PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果CATCTATCCTGCTAGCCGCCGGCCTCTTATCAATGCTCCT