DNA的生物合成1課件

第三章DNA的生物合成BiosynthesisofDNA(ReplicationofDNA)第三章DNA的生物合成1第一節(jié)DNA復(fù)制的一般特征一、DNA的生物學(xué)功能1、儲(chǔ)存遺傳信息

2、復(fù)制遺傳信息3、表達(dá)遺傳信息4、遺傳變異第一節(jié)DNA復(fù)制的一般特征一、DNA的生物學(xué)功能2Watson(Nature):我們假設(shè)的特異的（堿基）配對(duì)方式提示了遺傳物質(zhì)可能的復(fù)制機(jī)制：每一條鏈均可作為合成一條新鏈的模板，就使子代雙螺旋與母本完全一致。他們?cè)诹硪黄撐闹校河纱水a(chǎn)生了在當(dāng)時(shí)難于解決的解開(kāi)雙鏈結(jié)構(gòu)的困難。許多科學(xué)家難于接受Watson提出的機(jī)制。Watson(Nature):我們假設(shè)的特異的（堿基）配對(duì)3二、DNA復(fù)制方式

全保留半保留分散式DNA如何進(jìn)行復(fù)制？可能的三種方式二、DNA復(fù)制方式全保留半保留分散式DNA如何進(jìn)行復(fù)4DNA的生物合成1課件5根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第一代的DNA僅有一條帶否定了全保留復(fù)制的可能，第二代出現(xiàn)兩條帶，一條完全輕帶一條中帶否定了分散式復(fù)制的可能，證明DNA只能是半保留方式進(jìn)行復(fù)制1、DNA的半保留復(fù)制SemiconservativeReplicationDNA雙鏈解開(kāi)，以單鏈做模板，堿基互補(bǔ)原則，各自合成一條鏈。在新合成的DNA雙鏈分子中，一條是原來(lái)的老鏈，一條是新鏈。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第一代的DNA僅有一條帶否定了全保留復(fù)制的可能6DNA的生物合成1課件7如果是半保留復(fù)制，必須解決解開(kāi)雙螺旋的問(wèn)題。

250Mb的1號(hào)染色體，需要旋轉(zhuǎn)250萬(wàn)次。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶解決了解開(kāi)DNA雙螺旋的問(wèn)題如果是半保留復(fù)制，必須解決解開(kāi)雙螺旋的問(wèn)題。

250Mb的8DNA復(fù)制速率大腸桿菌完成復(fù)制需40分鐘。大腸桿菌基因組有400萬(wàn)bp，復(fù)制速率：1700bp/秒。真核生物復(fù)制速率：60bp/秒。但完成整個(gè)基因組復(fù)制所需的時(shí)間比大腸桿菌短。原因是大腸桿菌基因組僅有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)，而真核基因組有多個(gè)起始位點(diǎn)。DNA復(fù)制速率大腸桿菌完成復(fù)制需40分鐘。92DNA復(fù)制的半不連續(xù)性復(fù)制時(shí)DNA鏈延伸可能有三種方式：123日本科學(xué)家岡崎用實(shí)驗(yàn)證明復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生100～1000bp的短片段，然后又消失沒(méi)有從3’5’延長(zhǎng)DNA鏈的聚合酶2DNA復(fù)制的半不連續(xù)性復(fù)制時(shí)DNA鏈延伸可能有三種102DNA復(fù)制的半不連續(xù)性一條鏈連續(xù)合成，稱主導(dǎo)鏈，LeadingStrand另一條鏈分段合成，稱隨從鏈（隨后鏈）LaggingStrand。原因：DNA雙螺旋分子兩條鏈方向相反，新鏈合成的方向只能5’→3’一個(gè)方向合成。2DNA復(fù)制的半不連續(xù)性一條鏈連續(xù)合成，稱主導(dǎo)鏈，L11DNA的生物合成1課件123DNA復(fù)制的雙向性

在兩個(gè)方向同時(shí)進(jìn)行，形成兩個(gè)復(fù)制叉ReplicationFork.3DNA復(fù)制的雙向性

在兩個(gè)方向同時(shí)進(jìn)行，形成兩個(gè)復(fù)制13復(fù)制子RepliconReplicon基因組中能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的結(jié)構(gòu)單位稱復(fù)制子,或者說(shuō)單個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)控制的DNA。復(fù)制的起始位點(diǎn)控制并起始復(fù)制的特定位點(diǎn)。終止位點(diǎn)終止復(fù)制的位點(diǎn)復(fù)制子包含起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)，從起始位點(diǎn)至終止位點(diǎn)的全部DNA。復(fù)制子RepliconReplicon基因組14DNA的生物合成1課件15DNA的生物合成1課件16第二節(jié)DNA復(fù)制的基本過(guò)程一復(fù)制的起始（一）起始部位的序列特征

復(fù)制在特定部位起始。原核生物僅有一個(gè)起始部位。真核生物有多個(gè)起始部位。第二節(jié)DNA復(fù)制的基本過(guò)程一復(fù)制的起始171、M13噬菌體的起始部位順序特征59bp的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。1、M13噬菌體的起始部位順序特征182、大腸桿菌的起始部位順序特征2個(gè)區(qū)域：起始蛋白識(shí)別區(qū)：4個(gè)9bp重復(fù)順序和鄰近的AT富含區(qū)3個(gè)13bp重復(fù)順序。2、大腸桿菌的起始部位順序特征2個(gè)區(qū)域：起始蛋白識(shí)別區(qū)19大腸桿菌基因組復(fù)制起始部位大腸桿菌基因組復(fù)制起始部位203、酵母起始部位順序特征酵母3、酵母起始部位順序特征酵母214、SV40起始部位的順序特征52115220523052401102030CACTACTTCTGGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTGCATAAATAAAAAAATTAGTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCGGCTCCGCCGGAGCCGGAGACGTATTTATTTTTTTAAT

反轉(zhuǎn)重復(fù)序列

大T抗原結(jié)合部位IIA/T富含區(qū)

圖3-7SV40復(fù)制起始部位結(jié)構(gòu)4、SV40起始部位的順序特征225、起始部位的順序特征（高等真核生物）多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，有人發(fā)現(xiàn)任何大于15kb的DNA就能自主復(fù)制。起始不是隨機(jī)的，但未發(fā)現(xiàn)起始位點(diǎn)的特征序列。5、起始部位的順序特征（高等真核生物）多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，有人發(fā)23

（二）起始需要多種蛋白因子參與

1噬菌體（X174）

priA識(shí)別起始位點(diǎn)，ATP酶活性priB起始引發(fā)priC起始引發(fā)DnaT起始引發(fā)DnaB起始引發(fā)DnaC起始引發(fā),與DnaB一起作用DnaGRNA引物合成

（二）起始需要多種蛋白因子參與

1噬菌體242大腸桿菌

DnaA結(jié)合于oriC區(qū)，有ATP酶活性，使AT富含區(qū)解鏈，促進(jìn)DnaB結(jié)合形成起始復(fù)合物。DnaBDNA螺旋酶，有解旋和解鏈作用。DnaC運(yùn)輸DnaB，形成起始復(fù)合物。DnaGDNA復(fù)制引發(fā)酶，合成引物。Hu促進(jìn)復(fù)制復(fù)合物的形成?；匦杆沙谡菪?，促進(jìn)單鏈DNA產(chǎn)生。單鏈結(jié)合蛋白促進(jìn)DNA解鏈，穩(wěn)定單鏈DNA。2大腸桿菌253、真核細(xì)胞（SV40）真核細(xì)胞（SV40）的DNA復(fù)制至少需要6個(gè)蛋白因子參與。T抗原：N端為DNA結(jié)合區(qū)，識(shí)別起始位點(diǎn)，C端具有螺旋酶活性，在RFA的協(xié)助下解開(kāi)雙鏈。RFA：人單鏈結(jié)合蛋白拓補(bǔ)異構(gòu)酶I或II：解開(kāi)超螺旋。復(fù)制因子C（replicationfacterC,RFC）：形成起始復(fù)合物。DNA聚合酶α-引物酶復(fù)合物：合成引物，起始DNA合成。3、真核細(xì)胞（SV40）真核細(xì)胞（SV40）的DNA復(fù)制至少264、真核細(xì)胞（Yeast）（1）ORC（OriginRecognitionComplex）

6個(gè)亞基組成在真核生物中相當(dāng)保守特異識(shí)別ARS（Autonomouslyreplicatingsequence）ORC1p，ORC2p，ORC4p與A元件結(jié)合，ORC5p與B元件結(jié)合結(jié)合過(guò)程需要ATP4、真核細(xì)胞（Yeast）（1）ORC（OriginR27（2）Cdc6/Cdc18（3）微染色體支持蛋白（Minichromosomemaintenanceproteins，MCMp）（4）Cdc45（2）Cdc6/Cdc1828（三）復(fù)制的起始－－引發(fā)（Priming）（三）復(fù)制的起始－－引發(fā)（Priming）29SSB的作用無(wú)SSB結(jié)合非特異引發(fā)有SSB結(jié)合特異引發(fā)1、M13噬菌體SSB的作用無(wú)SSB結(jié)合非特異引發(fā)有SSB結(jié)合特異引發(fā)1、M30

單鏈結(jié)合蛋白SSB與M13噬菌體單鏈DNA結(jié)合，在發(fā)夾結(jié)構(gòu)前6bp處，RNA聚合酶合成20~30個(gè)堿基的RNA.破壞發(fā)夾結(jié)構(gòu)；SSB結(jié)合；DNA聚合酶III在3’－OH延長(zhǎng)DNA鏈。DNA聚合酶I水解RNA，并補(bǔ)平缺口，連接酶連接。單鏈結(jié)合蛋白SSB與M13噬菌體單鏈DNA結(jié)合，在31SSB與DNA結(jié)合priA,priB,priC識(shí)別起始點(diǎn)在DnaT幫助下DnaB,DnaC復(fù)合物結(jié)合形成前引發(fā)體引發(fā)體引發(fā)體可沿著DNA鏈移動(dòng)，在合適的位點(diǎn)起始引物RNA的合成引發(fā)體的裝配只能在起始點(diǎn)，引物合成可在多處。引發(fā)體移動(dòng)的方向與DNA鏈延長(zhǎng)的方向相反。類似岡崎片段的合成2、

ФX174DNASSB與DNA結(jié)合priA,priB,priC識(shí)別起始點(diǎn)在D32復(fù)制叉前進(jìn)方向3‘ATCGGAATCGGAACCTGCGTTAAGCAAAC-5’

鏈延長(zhǎng)方向

TTCGTTTG-3’GACGCAATAGCCTTG5’TAGCCT5’3’

復(fù)制叉前進(jìn)方33

3、大腸桿菌

DnaA與起始位點(diǎn)OriC結(jié)合形成起始復(fù)合物DnaA與A-T富含區(qū)作用，解鏈，形成開(kāi)放復(fù)合物SSB與單鏈DNA結(jié)合DnaA指導(dǎo)DnaB-DnaC復(fù)合物結(jié)合到解鏈區(qū)，形成前引發(fā)復(fù)合物。DnaB引導(dǎo)DnaG引物合成酶的結(jié)合形成引發(fā)復(fù)合物，合成RNA引物Hu因子促進(jìn)引發(fā)過(guò)程3、大腸桿菌

DnaA與起始位點(diǎn)OriC結(jié)合形344SV40T抗原識(shí)別起始點(diǎn)和解鏈RFA結(jié)合到單鏈DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶參與下形成前引發(fā)體DNApol-引物酶結(jié)合形成引發(fā)體4SV40T抗原識(shí)別起始點(diǎn)和解鏈RFA結(jié)合到單鏈DN35ORC：OriginRecognitionComplex5、真核生物復(fù)制的起始ORC：OriginRecognitionComplex36二DNA鏈的延長(zhǎng)（一）原核生物DNA鏈的延伸延伸反應(yīng)：在RNA引物的OH端由DNA聚合酶III，按堿基互補(bǔ)規(guī)則延伸。主導(dǎo)鏈的延長(zhǎng)：3’→5’方向這條鏈做模板鏈的新鏈合成可以隨著復(fù)制叉向前移動(dòng)，連續(xù)合成（5’→3’）。

二DNA鏈的延長(zhǎng)（一）原核生物DNA鏈的延伸37DNA的生物合成1課件38隨從鏈的延長(zhǎng)5’→3’方向這條鏈做模板鏈的新鏈合成則不能隨著復(fù)制叉向前移動(dòng)進(jìn)行連續(xù)合成，只能分段合成一小段，這一小段新合成的DNA鏈稱岡奇片段。每一段新合成的一小段中有RNA，由RNA酶水解，DNA聚合酶I補(bǔ)平，最后由連接酶連接。隨從鏈的延長(zhǎng)5’→3’方向這條鏈做模板鏈的新鏈合成則不能39DNA的生物合成1課件40DNA的生物合成1課件41DNA的生物合成1課件42DNA鏈延長(zhǎng)的要點(diǎn)1)DNA聚合酶不能從頭合成新鏈，只能在3’-OH羥基端延長(zhǎng)。復(fù)制起始時(shí)的3’-OH羥基端是RNA。2)按照堿基互補(bǔ)原則合成新鏈。3)兩條鏈同時(shí)復(fù)制，新鏈的延伸方向是5’→3’，一條鏈連續(xù)合成，稱主導(dǎo)鏈，另一條鏈不連續(xù)合成，稱隨從鏈（后隨鏈）。DNA鏈延長(zhǎng)的要點(diǎn)1)DNA聚合酶不能從頭合成新鏈，只434)復(fù)制以雙向進(jìn)行，復(fù)制正在進(jìn)行的部位稱復(fù)制叉（Replicationfork）,復(fù)制叉從起始點(diǎn)沿著DNA移動(dòng)。復(fù)制能夠發(fā)生的DNA單位稱復(fù)制子（Replicon）.4)復(fù)制以雙向進(jìn)行，復(fù)制正在進(jìn)行的部位稱復(fù)制叉（Rep44DNA的生物合成1課件45（二）SV40的DNA延伸1、前導(dǎo)鏈的延伸Pol合成一段新鏈在RFC和PCNA協(xié)助下，PolPol轉(zhuǎn)換由Pol完成全部前導(dǎo)鏈的合成（二）SV40的DNA延伸1、前導(dǎo)鏈的延伸462、后隨聯(lián)的延伸2、后隨聯(lián)的延伸47DNA的生物合成1課件48三復(fù)制的終止對(duì)于線性DNA復(fù)制例如噬菌體等比較簡(jiǎn)單，復(fù)制到分子末端終止。對(duì)于環(huán)狀的大腸桿菌DNA復(fù)制和真核生物的DNA復(fù)制就比較復(fù)雜。復(fù)制叉到達(dá)終止區(qū)，完成復(fù)制前，復(fù)制暫停。兩個(gè)子代DNA纏繞在一起，需要分開(kāi)。在大腸桿菌：有復(fù)制起始點(diǎn)，也有復(fù)制終止點(diǎn)。三復(fù)制的終止對(duì)于線性DNA復(fù)制例如噬菌體等比較簡(jiǎn)單，復(fù)49終止子（Terminator)）含22bpTus:Terminusutilizationsubstance復(fù)制叉到達(dá)終止區(qū)，完成復(fù)制前，復(fù)制暫停。兩個(gè)子代DNA纏繞在一起，需要分開(kāi)。終止子（Terminator)）含22bpTus:Term50第三節(jié)參與DNA復(fù)制的酶類參與DNA復(fù)制的酶或蛋白因子主要有以下幾種：1DNA聚合酶催化DNA的合成。2引物酶起始DNA的合成3連接酶連接崗奇片段4DNA解鏈，解旋酶5DNA結(jié)合蛋白。第三節(jié)參與DNA復(fù)制的酶類51一DNA聚合酶(Polymerase)（一）作用機(jī)制以DNA做模板，堿基互補(bǔ)配對(duì)，催化4種dNTP

之間形成磷酸二酯鍵，從而延長(zhǎng)DNA鏈。

一DNA聚合酶(Polymerase)（一）作用機(jī)制52DNA的生物合成1課件53

在模板鏈上進(jìn)行

不能從頭合成，在引物的3’OH端上延長(zhǎng)新鏈延長(zhǎng)方向?yàn)?’→3’延長(zhǎng)在模板鏈上進(jìn)行54（二）原核生物DNA聚合酶

有3種：DNA聚合酶I，II，III。多功能酶：合成DNA的活性聚合酶作用,延長(zhǎng)DNA鏈。水解DNA的活性外切核酸酶活性。切除不配對(duì)堿基，起校讀作用（二）原核生物DNA聚合酶

551DNA聚合酶I5’-3’延長(zhǎng)DNA鏈（DNA聚合酶活性）從3’端水解水解DNA（5’→3外切酶活性）從5’端水解水解DNA（5’→3外切酶活性），只作用于雙鏈DNA。大片段（Klenow片段）：含、活性小片段：含活性1DNA聚合酶I5’-3’延長(zhǎng)56DNA聚合酶I在DNA復(fù)制中所起的作用不是主要的復(fù)制酶RNA引物的切除DNA損傷的修復(fù)：紫外線作用形成的TT二聚體的切除鏈置換：可能參與遺傳重組切口平移（nicktranslation）探針標(biāo)記DNA聚合酶I在DNA復(fù)制中所起的作用不是主要的復(fù)57切口平移(NickTranslation)切口平移(NickTranslation)582DNA聚合酶II不是復(fù)制酶，主要在DNA修復(fù)中起作用，無(wú)5’→3外切酶活性。2DNA聚合酶II593DNA聚合酶III催化效率高，主要復(fù)制酶。由10種亞基組成：

‘（1）核心聚合酶：：DNA聚合酶活性：3‘-5’外切酶活性，控制復(fù)制忠實(shí)性：3DNA聚合酶III催化效率高，主要復(fù)制酶。由60（2）二聚體：構(gòu)成滑動(dòng)鉗，將全酶固定在DNA模板上，提高合成速率（20/秒----750/秒。（3）復(fù)合物：2‘協(xié)助二聚體結(jié)合到DNA（2）二聚體：構(gòu)成滑動(dòng)鉗，將全酶固定在61DNA聚合酶III形成不對(duì)稱的二聚體，與DNA雙鏈結(jié)合，后隨鏈折疊1800，使后隨鏈的物理方向與主導(dǎo)鏈一致，同時(shí)催化兩條鏈的復(fù)制。DNA聚合酶III62DNA的生物合成1課件63（三）

真核生物DNA聚合酶

（三）真核生物DNA聚合酶

64DNA聚合酶的作用DNA聚合酶:多亞基、多功能酶。大亞基：DNA聚合酶活性。100nt/次小亞基：引物酶活性，合成RNA。

起始DNA的合成：合成RNA引物和在RNA3’羥基端合成一段DNA。DNA聚合酶的作用DNA聚合酶:多亞基、多功能酶。65DNA聚合酶的作用DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)多亞基組成：P125大亞基，催化亞基，含聚合酶和外切酶活性P50小亞基與PCNA結(jié)合相關(guān)P66P12DNA聚合酶的作用DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)66DNA聚合酶的功能主要DNA復(fù)制酶：DNA聚合酶活性，延伸DNA鏈。

與RFC和PCNA形成“全酶”，在RFC和PCNA等的協(xié)同下，促使DNA聚合酶的解離，DNA聚合酶接替DNA聚合酶繼續(xù)DNA鏈的合成-------DNA聚合酶向DNA聚合酶的轉(zhuǎn)換。復(fù)制校正功能：3‘-5’外切核酸酶活性DNA聚合酶的功能主要DNA復(fù)制酶：DNA聚合酶活性，延伸67在DNA修復(fù)、重組、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷檢測(cè)中也起重要作用。在DNA修復(fù)、重組、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷檢測(cè)中也起重要作68DNA聚合酶、、主要功能：DNA修復(fù)。DNA聚合酶、、主要功能：DNA修復(fù)。69二、真核生物DNA聚合酶附屬蛋白1、RFC：復(fù)制因子C(ReplicationFactorC)。多亞基復(fù)合物，DNA聚合酶的附屬蛋白，識(shí)別引物末端,參與鏈的延長(zhǎng)。類似復(fù)合物。2、PCNA：增殖細(xì)胞核抗原（ProliferatingCellNuclearAntigen)，DNA聚合酶的附屬蛋白，參與DNA的合成，類似二聚體。二、真核生物DNA聚合酶附屬蛋白1、RFC：復(fù)制因子C(Re703、PRP1和PRP2PrimerRecognitionProtein

增加DNA聚合酶與模板－引物末端的親和力，增加DNA聚合酶的活性。3、PRP1和PRP271三

引物酶primase

DNA聚合酶不能引發(fā)DNA新生鏈的合成，只能在已存在的DNA鏈或RNA鏈上延長(zhǎng)DNA。引物酶催化引物RNA的合成。三引物酶primase

72

四連接酶ligase

催化岡奇片段間磷酸二酯鍵的形成，二個(gè)片段必須都與完整的模板鏈結(jié)合。大腸桿菌的連接酶需NAD+，真核細(xì)胞的連接酶需要ATP?？蛇B接雙鏈DNA中的單鏈切口，RNA-DNA雜交體雙鏈單鏈切口，不能連接雙鏈RNA中的單鏈切口。

四連接酶ligase

催化岡奇片段間磷酸二73五與DNA解鏈和解旋有關(guān)的酶（一）DNA螺旋酶（Helicase）催化雙螺旋解旋和解鏈需消耗ATP五與DNA解鏈和解旋有關(guān)的酶（一）DNA螺旋酶（74（二）拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topoisomerase)促進(jìn)DNA雙鏈的解開(kāi)。需消耗ATP。（二）拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topoisomerase)75（三）復(fù)制蛋白A（ReplicationProteinA，RPA）

也稱DNA單鏈結(jié)合蛋白（SingleStrandBindingprotein，SSB）主要功能：與單鏈親和力大，穩(wěn)定單鏈結(jié)構(gòu)，保護(hù)單鏈免受核酸酶水解和阻止雙鏈形成，有利復(fù)制進(jìn)行。在復(fù)制起始階段,在細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)信號(hào)作用下,起始復(fù)合物被激活,解螺旋酶解開(kāi)DNA雙鏈,RPA特異地結(jié)合到暴露的DNA單鏈上促進(jìn)DNApolα/引發(fā)酶復(fù)合物合成第一個(gè)RNA引物和DNA短鏈;在延長(zhǎng)階段,RPA解開(kāi)雙鏈維持DNA模板處于單鏈狀態(tài),并保護(hù)單鏈的完整性,使DNA連續(xù)復(fù)制。（三）復(fù)制蛋白A（ReplicationProte76DNA的生物合成1課件77DNA復(fù)制的忠實(shí)性

保證復(fù)制忠實(shí)性的因素：1堿基之間的氫鍵配對(duì)作用10-4~10-52DNA聚合酶選擇正確堿基的作用3DNA聚合酶的校正作用和3’→5’外切酶活性。延長(zhǎng)之前先校正，切除3’-末端錯(cuò)配的堿基。PolyIII和Poly.

DNA復(fù)制的忠實(shí)性保證復(fù)制忠實(shí)性的因素：78DNA的生物合成1課件794、錯(cuò)配修復(fù)(mismatchrepair)半甲基化DNA。新合成鏈未甲基化。箭頭所指處為錯(cuò)配堿基起始位點(diǎn)外切酶切除錯(cuò)配堿基DNA聚合酶III等修復(fù)甲基化酶甲基化人類細(xì)胞中存在類似的錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制4、錯(cuò)配修復(fù)(mismatchrepair)半甲基化DNA80

第四節(jié)DNA復(fù)制的調(diào)控DNA復(fù)制是細(xì)胞增殖的一個(gè)關(guān)鍵事件，因此，DNA復(fù)制與細(xì)胞分裂是互相協(xié)調(diào)、互相調(diào)控的。無(wú)論原核還市真核細(xì)胞中DNA復(fù)制都只發(fā)生在細(xì)胞周期中特定時(shí)期，在一個(gè)細(xì)胞周期中，DNA必須也只能復(fù)制一次。第四節(jié)DNA復(fù)制的調(diào)控DNA復(fù)制是細(xì)胞81一大腸桿菌復(fù)制的調(diào)節(jié)1，起始體（orisome，起始復(fù)合物，蛋白質(zhì)-oriC復(fù)合物）的裝配

參與形成orisome的組分：DnaA,Hu,IHF，F(xiàn)is，Dpi，IciA，Cnu，Hha，Rob，SeqA，ArcA相互作用：Fis,IHF調(diào)節(jié)

DnaA-ATP與oriC

的結(jié)合，HU調(diào)節(jié)DnaA,IHF結(jié)合到oriC,并增強(qiáng)DnaA解鏈能力。一大腸桿菌復(fù)制的調(diào)節(jié)1，起始體（orisome，起822，防止復(fù)制再次起始(1)DnaA活性的抑制

DnaA-ADPDnaA-ATP無(wú)活性RIDA有活性2，防止復(fù)制再次起始83oriC(2)降低游離形式的DnaA水平DnaA結(jié)合位點(diǎn)datA區(qū)在復(fù)制后極短時(shí)間內(nèi)降低DnaA水平可以結(jié)合300分子的DnaAoriC(2)降低游離形式的DnaA水平DnaA結(jié)合84隔離oriC

oriCGATCCTAG甲基化未甲基化摸板鏈新合成鏈SeqA特異識(shí)別,并結(jié)合于半甲基化oriC的GATC序列,使oriC被隔離,防止復(fù)制再次發(fā)生oriCGATCCTAG甲基化未甲基化摸板鏈新合成鏈Seq85二真核生物復(fù)制起始調(diào)空1、DNA復(fù)制起始的調(diào)控2、細(xì)胞周期監(jiān)控點(diǎn)機(jī)制二真核生物復(fù)制起始調(diào)空1、DNA復(fù)制起始的調(diào)控86(一)、DNA復(fù)制起始的調(diào)節(jié)1、復(fù)制起始點(diǎn)的選擇復(fù)制起始點(diǎn)數(shù)量的調(diào)控真核細(xì)胞有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，起用多少起始點(diǎn)決定于S期的長(zhǎng)短。S期短，起始點(diǎn)多。S期長(zhǎng)，起始點(diǎn)少。遺傳性起始點(diǎn)：DNA上的起始元件功能性起始點(diǎn)：實(shí)際起始點(diǎn)遺傳性起始點(diǎn)多于功能性起始點(diǎn)(一)、DNA復(fù)制起始的調(diào)節(jié)1、復(fù)制起始點(diǎn)的選擇87酵母細(xì)胞3號(hào)染色體上有14個(gè)遺傳性復(fù)制起始點(diǎn)，只有6個(gè)功能性復(fù)制起始點(diǎn)。將Ura3基因處的強(qiáng)復(fù)制起始點(diǎn)突變后，在其附近的弱復(fù)制起始點(diǎn)就成為強(qiáng)復(fù)制起始點(diǎn)。酵母細(xì)胞3號(hào)染色體上有14個(gè)遺傳性復(fù)制起始點(diǎn)，只有6個(gè)功能性88高等真核生物細(xì)胞至今未發(fā)現(xiàn)遺傳性復(fù)制起始點(diǎn)的序列特征，但確實(shí)存在功能性的復(fù)制起始點(diǎn)。CHO細(xì)胞核蟾蜍卵細(xì)胞抽提物損壞CHO細(xì)胞核或裸露DNA非隨機(jī)起始，同正常隨機(jī)起始CHO細(xì)胞

復(fù)制起始點(diǎn)的選擇與細(xì)胞核或染色體結(jié)構(gòu)密切相關(guān)高等真核生物細(xì)胞至今未發(fā)現(xiàn)遺傳性復(fù)制起始點(diǎn)的序列特征，但確實(shí)892、復(fù)制起始調(diào)控機(jī)制（1）復(fù)制的允許機(jī)制（Licensingmodel）

（2）蛋白激酶的調(diào)控2、復(fù)制起始調(diào)控機(jī)制（1）復(fù)制的允許機(jī)制（Licens90

（1）復(fù)制的允許機(jī)制（Licensingmodel）

一個(gè)細(xì)胞周期中DNA復(fù)制發(fā)生一次且只能發(fā)生一次蟾蜍卵細(xì)胞外源細(xì)胞核

Licensingcontrol復(fù)制復(fù)制機(jī)制如何識(shí)別已經(jīng)復(fù)制過(guò)一次的DNA復(fù)制起始點(diǎn)？

（1）復(fù)制的允許機(jī)制（Lic91DNA的生物合成1課件92復(fù)制后，LicensingFactor失活，失活的LicensingFactor不能再次啟動(dòng)復(fù)制。核膜破裂后（細(xì)胞分裂后），新的LicensingFactor進(jìn)入核，啟動(dòng)下一周期的DNA復(fù)制。復(fù)制后，LicensingFactor失活，失活的93（2）蛋白激酶的調(diào)控真核細(xì)胞復(fù)制起始絕對(duì)必須的蛋白激酶：CDK和Cdc7-Dbf4激酶(1)、前復(fù)制起始復(fù)合物的形成組成成分：ORC(OriginRecognitionComplex)含6種蛋白質(zhì)，Cdc6，RLF（ReplicationLicensingFactor,復(fù)制允許因子）。(2)、CDK激活前復(fù)制起始復(fù)合物復(fù)制前復(fù)合物受蛋白激酶的調(diào)控，或變成起始復(fù)合物，起始復(fù)制，或在復(fù)制過(guò)程中轉(zhuǎn)變成復(fù)制后復(fù)合物，就再也不能啟動(dòng)復(fù)制。

CDK（CyclinDependent),Cdc7-Dbf4激酶，蛋白激酶A，蛋白磷酸酶2A，都參與復(fù)制的起始，在不同階段起作用。（2）蛋白激酶的調(diào)控真核細(xì)胞復(fù)制起始絕對(duì)必須的蛋白激酶：94前復(fù)制起始復(fù)合物（pre-replicativecomplex，pre-RC)（在遺傳性復(fù)制起始點(diǎn)裝配）CDK起始復(fù)合物（ReplicativeComplex,RC)（在功能性復(fù)制起始點(diǎn)形成）在G1期向S期過(guò)渡期間，CDK活性很高。DNA的生物合成1課件95CDK同時(shí)又是防止在同一細(xì)胞周期中DNA復(fù)制再次發(fā)生的因素。阻止復(fù)制起始復(fù)合物的組裝。CDK對(duì)某些起始因子磷酸化。CDK同時(shí)又是防止在同一細(xì)胞周期中DNA復(fù)制再次發(fā)生的因素。96（二）復(fù)制檢查點(diǎn)機(jī)制識(shí)別DNA損傷或DNA復(fù)制阻斷，通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，阻斷細(xì)胞周期，啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制，恢復(fù)基因組的完整性，修復(fù)后再進(jìn)入細(xì)胞周期。（二）復(fù)制檢查點(diǎn)機(jī)制97在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，細(xì)胞形成一套保證細(xì)胞周期中DNA復(fù)制和染色體分配質(zhì)量的檢查機(jī)制，即細(xì)胞周期檢查點(diǎn)在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，細(xì)胞形成一套保證細(xì)胞周期中DNA復(fù)制和染色98檢查點(diǎn)：(1)G1S期檢查點(diǎn)查看DNA有無(wú)損傷DNAdamagecheckpoint

細(xì)胞周期暫時(shí)減慢或停止。查看DNA復(fù)制的進(jìn)度DNAreplicationcheckpoint

限制DNA復(fù)制速度(2)、G2M

管理染色體的正確分配Spindleassemblycheckpoint檢查點(diǎn)：(1)G1S期檢查點(diǎn)99啟動(dòng)相關(guān)基因恢復(fù)復(fù)制、啟動(dòng)DNA修復(fù)機(jī)制復(fù)制故障、DNA損傷中斷細(xì)胞周期探測(cè)器(Sensor)傳感器（Transducer）效應(yīng)器（Effector）當(dāng)細(xì)胞周期進(jìn)程出現(xiàn)異常事件,如DNA損傷或復(fù)制出錯(cuò)受阻時(shí)，這類調(diào)節(jié)機(jī)制就被激活，及時(shí)中斷細(xì)胞周期的運(yùn)行，待異常事件消失后或損傷修復(fù)后，細(xì)胞周期才恢復(fù)進(jìn)行。ATM、ATR、Rad17復(fù)合物、911復(fù)合物ATM、ATR、Rad17復(fù)合物、911復(fù)合物Cdc25A、Cdc25CP53、p21Chk1、chk2啟動(dòng)相關(guān)基因恢復(fù)復(fù)制、復(fù)制故障、中斷細(xì)胞周期探測(cè)器(Sens100監(jiān)控機(jī)制的組成：1、檢控蛋白細(xì)胞周期蛋白家族（Cyclins)細(xì)胞周期蛋白依賴蛋白激酶（CyclinDenpedentproteinKinase,CDKs)

2、DNA修復(fù)體系監(jiān)控機(jī)制的組成：1、檢控蛋白101TheG1/Scellcyclecheckpointcontrolsthepassageofeukaryoticcellsfromthefirst“gap”phase(G1)intotheDNAsynthesisphase(S).Twocellcyclekinases,CDK4/6-cyclinDandCDK2-cyclinE,andthetranscriptioncomplexthatincludesRbandE2Farepivotalincontrollingthischeckpoint.DuringG1-phase,theRb-HDACrepressorcomplexbindstotheE2F-DP1transcriptionfactors,inhibitingthedownstreamtranscription.PhosphorylationofRbbyCDK4/6andCDK2dissociatestheRb-repressorcomplex,permittingtranscriptionofS-phasegenesencodingforproteinsthatamplifytheG1-toS-phaseswitchandthatarerequiredforDNAreplication.ManydifferentstimuliexertcheckpointcontrolincludingTGFbeta,DNAdamage,contactinhibition,replicativesenescenceandgrowthfactorwithdrawal.ThefirstfouractbyinducingmembersoftheINK4orKip/Cipfamiliesofcellcyclekinaseinhibitors.TGFbetaadditionallyinhibitsthetranscriptionofCdc25A,aphosphatasethatactivatesthecellcyclekinases.GrowthfactorwithdrawalactivatesGSK-3beta,whichphosphorylatescyclinD,leadingtoitsrapidubiquitinationandproteosomaldegradation.Ubiquitination,nuclearexportanddegradationaremechanismscommonlyusedtorapidlyreducetheconcentrationofcellcyclecontrolproteins.G1/SCheckpoint312在G1期Rb.HDAC阻遏復(fù)合物與E2F.DP1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，抑制進(jìn)入S期的基因轉(zhuǎn)錄。若Rb被CDK4/6和CDK2磷酸化，Rb阻遏復(fù)合物解離，進(jìn)入S期和DNA復(fù)制所需要的基因轉(zhuǎn)錄。如果發(fā)生DNA損傷，DNA復(fù)制出現(xiàn)問(wèn)題，通過(guò)一些信號(hào)分子抑制CDK2或CDK4/6,阻礙Rb的磷酸化。延長(zhǎng)S期，DNA復(fù)制暫緩，啟動(dòng)修復(fù)機(jī)制，修復(fù)完成后，重新恢復(fù)DNA復(fù)制，進(jìn)入S期。TheG1/Scellcyclecheckpoint102

第五節(jié)逆向轉(zhuǎn)錄(ReverseTranscription)

本世紀(jì)之初發(fā)現(xiàn)腫瘤RNA病毒。64年，Temin報(bào)道了抑制DNA合成的放線菌素D能抑制雞肉瘤RNA病毒的繁殖。據(jù)此提出雞肉瘤RNA病毒的繁殖須經(jīng)過(guò)形成DNA的階段。

第五節(jié)逆向轉(zhuǎn)錄(ReverseTranscript10370年Temin和Baltimore兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒顆粒中存在著一種以RNA為模板合成DNA的酶，稱為RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶。遺傳信息從RNA流向DNA，即以RNA為模板合成DNA稱為逆向轉(zhuǎn)錄，因此催化這一反應(yīng)的酶又稱逆轉(zhuǎn)錄酶。70年Temin和Baltimore兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)，104一逆向轉(zhuǎn)錄酶

由逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中pol基因編碼。是一種多功能酶。有以RNA為模板和以DNA為模板合成DNA的DNA聚合酶活性。需要RNA或DNA做引物；有核糖核酸酶H的活性（在逆轉(zhuǎn)錄酶的C端），能從3’→5’和從5’→3’水解RNA，使RNA與DNA的雜交體分離。一逆向轉(zhuǎn)錄酶

由逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中pol基因編碼。是一105二逆向轉(zhuǎn)錄過(guò)程

二逆向轉(zhuǎn)錄過(guò)程

106DNA的生物合成1課件107DNA的生物合成1課件108DNA的生物合成1課件109

三逆向轉(zhuǎn)錄酶的生物學(xué)意義

1用于合成cDNA.建立cDNA文庫(kù)(cDNALibrary)，獲得基因或探針。

2與PCR連用RT-PCR

三逆向轉(zhuǎn)錄酶的生物學(xué)意義

110形成開(kāi)放復(fù)合物DnaAATPATP富含AT區(qū)ATP形成開(kāi)放復(fù)合物DnaAATPATP富含AT區(qū)ATP111第三章DNA的生物合成BiosynthesisofDNA(ReplicationofDNA)第三章DNA的生物合成112第一節(jié)DNA復(fù)制的一般特征一、DNA的生物學(xué)功能1、儲(chǔ)存遺傳信息

2、復(fù)制遺傳信息3、表達(dá)遺傳信息4、遺傳變異第一節(jié)DNA復(fù)制的一般特征一、DNA的生物學(xué)功能113Watson(Nature):我們假設(shè)的特異的（堿基）配對(duì)方式提示了遺傳物質(zhì)可能的復(fù)制機(jī)制：每一條鏈均可作為合成一條新鏈的模板，就使子代雙螺旋與母本完全一致。他們?cè)诹硪黄撐闹校河纱水a(chǎn)生了在當(dāng)時(shí)難于解決的解開(kāi)雙鏈結(jié)構(gòu)的困難。許多科學(xué)家難于接受Watson提出的機(jī)制。Watson(Nature):我們假設(shè)的特異的（堿基）配對(duì)114二、DNA復(fù)制方式

全保留半保留分散式DNA如何進(jìn)行復(fù)制？可能的三種方式二、DNA復(fù)制方式全保留半保留分散式DNA如何進(jìn)行復(fù)115DNA的生物合成1課件116根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第一代的DNA僅有一條帶否定了全保留復(fù)制的可能，第二代出現(xiàn)兩條帶，一條完全輕帶一條中帶否定了分散式復(fù)制的可能，證明DNA只能是半保留方式進(jìn)行復(fù)制1、DNA的半保留復(fù)制SemiconservativeReplicationDNA雙鏈解開(kāi)，以單鏈做模板，堿基互補(bǔ)原則，各自合成一條鏈。在新合成的DNA雙鏈分子中，一條是原來(lái)的老鏈，一條是新鏈。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第一代的DNA僅有一條帶否定了全保留復(fù)制的可能117DNA的生物合成1課件118如果是半保留復(fù)制，必須解決解開(kāi)雙螺旋的問(wèn)題。

250Mb的1號(hào)染色體，需要旋轉(zhuǎn)250萬(wàn)次。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶解決了解開(kāi)DNA雙螺旋的問(wèn)題如果是半保留復(fù)制，必須解決解開(kāi)雙螺旋的問(wèn)題。

250Mb的119DNA復(fù)制速率大腸桿菌完成復(fù)制需40分鐘。大腸桿菌基因組有400萬(wàn)bp，復(fù)制速率：1700bp/秒。真核生物復(fù)制速率：60bp/秒。但完成整個(gè)基因組復(fù)制所需的時(shí)間比大腸桿菌短。原因是大腸桿菌基因組僅有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)，而真核基因組有多個(gè)起始位點(diǎn)。DNA復(fù)制速率大腸桿菌完成復(fù)制需40分鐘。1202DNA復(fù)制的半不連續(xù)性復(fù)制時(shí)DNA鏈延伸可能有三種方式：123日本科學(xué)家岡崎用實(shí)驗(yàn)證明復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生100～1000bp的短片段，然后又消失沒(méi)有從3’5’延長(zhǎng)DNA鏈的聚合酶2DNA復(fù)制的半不連續(xù)性復(fù)制時(shí)DNA鏈延伸可能有三種1212DNA復(fù)制的半不連續(xù)性一條鏈連續(xù)合成，稱主導(dǎo)鏈，LeadingStrand另一條鏈分段合成，稱隨從鏈（隨后鏈）LaggingStrand。原因：DNA雙螺旋分子兩條鏈方向相反，新鏈合成的方向只能5’→3’一個(gè)方向合成。2DNA復(fù)制的半不連續(xù)性一條鏈連續(xù)合成，稱主導(dǎo)鏈，L122DNA的生物合成1課件1233DNA復(fù)制的雙向性

在兩個(gè)方向同時(shí)進(jìn)行，形成兩個(gè)復(fù)制叉ReplicationFork.3DNA復(fù)制的雙向性

在兩個(gè)方向同時(shí)進(jìn)行，形成兩個(gè)復(fù)制124復(fù)制子RepliconReplicon基因組中能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的結(jié)構(gòu)單位稱復(fù)制子,或者說(shuō)單個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)控制的DNA。復(fù)制的起始位點(diǎn)控制并起始復(fù)制的特定位點(diǎn)。終止位點(diǎn)終止復(fù)制的位點(diǎn)復(fù)制子包含起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)，從起始位點(diǎn)至終止位點(diǎn)的全部DNA。復(fù)制子RepliconReplicon基因組125DNA的生物合成1課件126DNA的生物合成1課件127第二節(jié)DNA復(fù)制的基本過(guò)程一復(fù)制的起始（一）起始部位的序列特征

復(fù)制在特定部位起始。原核生物僅有一個(gè)起始部位。真核生物有多個(gè)起始部位。第二節(jié)DNA復(fù)制的基本過(guò)程一復(fù)制的起始1281、M13噬菌體的起始部位順序特征59bp的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。1、M13噬菌體的起始部位順序特征1292、大腸桿菌的起始部位順序特征2個(gè)區(qū)域：起始蛋白識(shí)別區(qū)：4個(gè)9bp重復(fù)順序和鄰近的AT富含區(qū)3個(gè)13bp重復(fù)順序。2、大腸桿菌的起始部位順序特征2個(gè)區(qū)域：起始蛋白識(shí)別區(qū)130大腸桿菌基因組復(fù)制起始部位大腸桿菌基因組復(fù)制起始部位1313、酵母起始部位順序特征酵母3、酵母起始部位順序特征酵母1324、SV40起始部位的順序特征52115220523052401102030CACTACTTCTGGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTGCATAAATAAAAAAATTAGTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCGGCTCCGCCGGAGCCGGAGACGTATTTATTTTTTTAAT

反轉(zhuǎn)重復(fù)序列

大T抗原結(jié)合部位IIA/T富含區(qū)

圖3-7SV40復(fù)制起始部位結(jié)構(gòu)4、SV40起始部位的順序特征1335、起始部位的順序特征（高等真核生物）多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，有人發(fā)現(xiàn)任何大于15kb的DNA就能自主復(fù)制。起始不是隨機(jī)的，但未發(fā)現(xiàn)起始位點(diǎn)的特征序列。5、起始部位的順序特征（高等真核生物）多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，有人發(fā)134

（二）起始需要多種蛋白因子參與

1噬菌體（X174）

priA識(shí)別起始位點(diǎn)，ATP酶活性priB起始引發(fā)priC起始引發(fā)DnaT起始引發(fā)DnaB起始引發(fā)DnaC起始引發(fā),與DnaB一起作用DnaGRNA引物合成

（二）起始需要多種蛋白因子參與

1噬菌體1352大腸桿菌

DnaA結(jié)合于oriC區(qū)，有ATP酶活性，使AT富含區(qū)解鏈，促進(jìn)DnaB結(jié)合形成起始復(fù)合物。DnaBDNA螺旋酶，有解旋和解鏈作用。DnaC運(yùn)輸DnaB，形成起始復(fù)合物。DnaGDNA復(fù)制引發(fā)酶，合成引物。Hu促進(jìn)復(fù)制復(fù)合物的形成?；匦杆沙谡菪?，促進(jìn)單鏈DNA產(chǎn)生。單鏈結(jié)合蛋白促進(jìn)DNA解鏈，穩(wěn)定單鏈DNA。2大腸桿菌1363、真核細(xì)胞（SV40）真核細(xì)胞（SV40）的DNA復(fù)制至少需要6個(gè)蛋白因子參與。T抗原：N端為DNA結(jié)合區(qū)，識(shí)別起始位點(diǎn)，C端具有螺旋酶活性，在RFA的協(xié)助下解開(kāi)雙鏈。RFA：人單鏈結(jié)合蛋白拓補(bǔ)異構(gòu)酶I或II：解開(kāi)超螺旋。復(fù)制因子C（replicationfacterC,RFC）：形成起始復(fù)合物。DNA聚合酶α-引物酶復(fù)合物：合成引物，起始DNA合成。3、真核細(xì)胞（SV40）真核細(xì)胞（SV40）的DNA復(fù)制至少1374、真核細(xì)胞（Yeast）（1）ORC（OriginRecognitionComplex）

6個(gè)亞基組成在真核生物中相當(dāng)保守特異識(shí)別ARS（Autonomouslyreplicatingsequence）ORC1p，ORC2p，ORC4p與A元件結(jié)合，ORC5p與B元件結(jié)合結(jié)合過(guò)程需要ATP4、真核細(xì)胞（Yeast）（1）ORC（OriginR138（2）Cdc6/Cdc18（3）微染色體支持蛋白（Minichromosomemaintenanceproteins，MCMp）（4）Cdc45（2）Cdc6/Cdc18139（三）復(fù)制的起始－－引發(fā)（Priming）（三）復(fù)制的起始－－引發(fā)（Priming）140SSB的作用無(wú)SSB結(jié)合非特異引發(fā)有SSB結(jié)合特異引發(fā)1、M13噬菌體SSB的作用無(wú)SSB結(jié)合非特異引發(fā)有SSB結(jié)合特異引發(fā)1、M141

單鏈結(jié)合蛋白SSB與M13噬菌體單鏈DNA結(jié)合，在發(fā)夾結(jié)構(gòu)前6bp處，RNA聚合酶合成20~30個(gè)堿基的RNA.破壞發(fā)夾結(jié)構(gòu)；SSB結(jié)合；DNA聚合酶III在3’－OH延長(zhǎng)DNA鏈。DNA聚合酶I水解RNA，并補(bǔ)平缺口，連接酶連接。單鏈結(jié)合蛋白SSB與M13噬菌體單鏈DNA結(jié)合，在142SSB與DNA結(jié)合priA,priB,priC識(shí)別起始點(diǎn)在DnaT幫助下DnaB,DnaC復(fù)合物結(jié)合形成前引發(fā)體引發(fā)體引發(fā)體可沿著DNA鏈移動(dòng)，在合適的位點(diǎn)起始引物RNA的合成引發(fā)體的裝配只能在起始點(diǎn)，引物合成可在多處。引發(fā)體移動(dòng)的方向與DNA鏈延長(zhǎng)的方向相反。類似岡崎片段的合成2、

ФX174DNASSB與DNA結(jié)合priA,priB,priC識(shí)別起始點(diǎn)在D143復(fù)制叉前進(jìn)方向3‘ATCGGAATCGGAACCTGCGTTAAGCAAAC-5’

鏈延長(zhǎng)方向

TTCGTTTG-3’GACGCAATAGCCTTG5’TAGCCT5’3’

復(fù)制叉前進(jìn)方144

3、大腸桿菌

DnaA與起始位點(diǎn)OriC結(jié)合形成起始復(fù)合物DnaA與A-T富含區(qū)作用，解鏈，形成開(kāi)放復(fù)合物SSB與單鏈DNA結(jié)合DnaA指導(dǎo)DnaB-DnaC復(fù)合物結(jié)合到解鏈區(qū)，形成前引發(fā)復(fù)合物。DnaB引導(dǎo)DnaG引物合成酶的結(jié)合形成引發(fā)復(fù)合物，合成RNA引物Hu因子促進(jìn)引發(fā)過(guò)程3、大腸桿菌

DnaA與起始位點(diǎn)OriC結(jié)合形1454SV40T抗原識(shí)別起始點(diǎn)和解鏈RFA結(jié)合到單鏈DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶參與下形成前引發(fā)體DNApol-引物酶結(jié)合形成引發(fā)體4SV40T抗原識(shí)別起始點(diǎn)和解鏈RFA結(jié)合到單鏈DN146ORC：OriginRecognitionComplex5、真核生物復(fù)制的起始ORC：OriginRecognitionComplex147二DNA鏈的延長(zhǎng)（一）原核生物DNA鏈的延伸延伸反應(yīng)：在RNA引物的OH端由DNA聚合酶III，按堿基互補(bǔ)規(guī)則延伸。主導(dǎo)鏈的延長(zhǎng)：3’→5’方向這條鏈做模板鏈的新鏈合成可以隨著復(fù)制叉向前移動(dòng)，連續(xù)合成（5’→3’）。

二DNA鏈的延長(zhǎng)（一）原核生物DNA鏈的延伸148DNA的生物合成1課件149隨從鏈的延長(zhǎng)5’→3’方向這條鏈做模板鏈的新鏈合成則不能隨著復(fù)制叉向前移動(dòng)進(jìn)行連續(xù)合成，只能分段合成一小段，這一小段新合成的DNA鏈稱岡奇片段。每一段新合成的一小段中有RNA，由RNA酶水解，DNA聚合酶I補(bǔ)平，最后由連接酶連接。隨從鏈的延長(zhǎng)5’→3’方向這條鏈做模板鏈的新鏈合成則不能150DNA的生物合成1課件151DNA的生物合成1課件152DNA的生物合成1課件153DNA鏈延長(zhǎng)的要點(diǎn)1)DNA聚合酶不能從頭合成新鏈，只能在3’-OH羥基端延長(zhǎng)。復(fù)制起始時(shí)的3’-OH羥基端是RNA。2)按照堿基互補(bǔ)原則合成新鏈。3)兩條鏈同時(shí)復(fù)制，新鏈的延伸方向是5’→3’，一條鏈連續(xù)合成，稱主導(dǎo)鏈，另一條鏈不連續(xù)合成，稱隨從鏈（后隨鏈）。DNA鏈延長(zhǎng)的要點(diǎn)1)DNA聚合酶不能從頭合成新鏈，只1544)復(fù)制以雙向進(jìn)行，復(fù)制正在進(jìn)行的部位稱復(fù)制叉（Replicationfork）,復(fù)制叉從起始點(diǎn)沿著DNA移動(dòng)。復(fù)制能夠發(fā)生的DNA單位稱復(fù)制子（Replicon）.4)復(fù)制以雙向進(jìn)行，復(fù)制正在進(jìn)行的部位稱復(fù)制叉（Rep155DNA的生物合成1課件156（二）SV40的DNA延伸1、前導(dǎo)鏈的延伸Pol合成一段新鏈在RFC和PCNA協(xié)助下，PolPol轉(zhuǎn)換由Pol完成全部前導(dǎo)鏈的合成（二）SV40的DNA延伸1、前導(dǎo)鏈的延伸1572、后隨聯(lián)的延伸2、后隨聯(lián)的延伸158DNA的生物合成1課件159三復(fù)制的終止對(duì)于線性DNA復(fù)制例如噬菌體等比較簡(jiǎn)單，復(fù)制到分子末端終止。對(duì)于環(huán)狀的大腸桿菌DNA復(fù)制和真核生物的DNA復(fù)制就比較復(fù)雜。復(fù)制叉到達(dá)終止區(qū)，完成復(fù)制前，復(fù)制暫停。兩個(gè)子代DNA纏繞在一起，需要分開(kāi)。在大腸桿菌：有復(fù)制起始點(diǎn)，也有復(fù)制終止點(diǎn)。三復(fù)制的終止對(duì)于線性DNA復(fù)制例如噬菌體等比較簡(jiǎn)單，復(fù)160終止子（Terminator)）含22bpTus:Terminusutilizationsubstance復(fù)制叉到達(dá)終止區(qū)，完成復(fù)制前，復(fù)制暫停。兩個(gè)子代DNA纏繞在一起，需要分開(kāi)。終止子（Terminator)）含22bpTus:Term161第三節(jié)參與DNA復(fù)制的酶類參與DNA復(fù)制的酶或蛋白因子主要有以下幾種：1DNA聚合酶催化DNA的合成。2引物酶起始DNA的合成3連接酶連接崗奇片段4DNA解鏈，解旋酶5DNA結(jié)合蛋白。第三節(jié)參與DNA復(fù)制的酶類162一DNA聚合酶(Polymerase)（一）作用機(jī)制以DNA做模板，堿基互補(bǔ)配對(duì)，催化4種dNTP

之間形成磷酸二酯鍵，從而延長(zhǎng)DNA鏈。

一DNA聚合酶(Polymerase)（一）作用機(jī)制163DNA的生物合成1課件164

在模板鏈上進(jìn)行

不能從頭合成，在引物的3’OH端上延長(zhǎng)新鏈延長(zhǎng)方向?yàn)?’→3’延長(zhǎng)在模板鏈上進(jìn)行165（二）原核生物DNA聚合酶

有3種：DNA聚合酶I，II，III。多功能酶：合成DNA的活性聚合酶作用,延長(zhǎng)DNA鏈。水解DNA的活性外切核酸酶活性。切除不配對(duì)堿基，起校讀作用（二）原核生物DNA聚合酶

1661DNA聚合酶I5’-3’延長(zhǎng)DNA鏈（DNA聚合酶活性）從3’端水解水解DNA（5’→3外切酶活性）從5’端水解水解DNA（5’→3外切酶活性），只作用于雙鏈DNA。大片段（Klenow片段）：含、活性小片段：含活性1DNA聚合酶I5’-3’延長(zhǎng)167DNA聚合酶I在DNA復(fù)制中所起的作用不是主要的復(fù)制酶RNA引物的切除DNA損傷的修復(fù)：紫外線作用形成的TT二聚體的切除鏈置換：可能參與遺傳重組切口平移（nicktranslation）探針標(biāo)記DNA聚合酶I在DNA復(fù)制中所起的作用不是主要的復(fù)168切口平移(NickTranslation)切口平移(NickTranslation)1692DNA聚合酶II不是復(fù)制酶，主要在DNA修復(fù)中起作用，無(wú)5’→3外切酶活性。2DNA聚合酶II1703DNA聚合酶III催化效率高，主要復(fù)制酶。由10種亞基組成：

‘（1）核心聚合酶：：DNA聚合酶活性：3‘-5’外切酶活性，控制復(fù)制忠實(shí)性：3DNA聚合酶III催化效率高，主要復(fù)制酶。由171（2）二聚體：構(gòu)成滑動(dòng)鉗，將全酶固定在DNA模板上，提高合成速率（20/秒----750/秒。（3）復(fù)合物：2‘協(xié)助二聚體結(jié)合到DNA（2）二聚體：構(gòu)成滑動(dòng)鉗，將全酶固定在172DNA聚合酶III形成不對(duì)稱的二聚體，與DNA雙鏈結(jié)合，后隨鏈折疊1800，使后隨鏈的物理方向與主導(dǎo)鏈一致，同時(shí)催化兩條鏈的復(fù)制。DNA聚合酶III173DNA的生物合成1課件174（三）

真核生物DNA聚合酶

（三）真核生物DNA聚合酶

175DNA聚合酶的作用DNA聚合酶:多亞基、多功能酶。大亞基：DNA聚合酶活性。100nt/次小亞基：引物酶活性，合成RNA。

起始DNA的合成：合成RNA引物和在RNA3’羥基端合成一段DNA。DNA聚合酶的作用DNA聚合酶:多亞基、多功能酶。176DNA聚合酶的作用DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)多亞基組成：P125大亞基，催化亞基，含聚合酶和外切酶活性P50小亞基與PCNA結(jié)合相關(guān)P66P12DNA聚合酶的作用DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)177DNA聚合酶的功能主要DNA復(fù)制酶：DNA聚合酶活性，延伸DNA鏈。

與RFC和PCNA形成“全酶”，在RFC和PCNA等的協(xié)同下，促使DNA聚合酶的解離，DNA聚合酶接替DNA聚合酶繼續(xù)DNA鏈的合成-------DNA聚合酶向DNA聚合酶的轉(zhuǎn)換。復(fù)制校正功能：3‘-5’外切核酸酶活性DNA聚合酶的功能主要DNA復(fù)制酶：DNA聚合酶活性，延伸178在DNA修復(fù)、重組、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷檢測(cè)中也起重要作用。在DNA修復(fù)、重組、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷檢測(cè)中也起重要作179DNA聚合酶、、主要功能：DNA修復(fù)。DNA聚合酶、、主要功能：DNA修復(fù)。180二、真核生物DNA聚合酶附屬蛋白1、RFC：復(fù)制因子C(ReplicationFactorC)。多亞基復(fù)合物，DNA聚合酶的附屬蛋白，識(shí)別引物末端,參與鏈的延長(zhǎng)。類似復(fù)合物。2、PCNA：增殖細(xì)胞核抗原（ProliferatingCellNuclearAntigen)，DNA聚合酶的附屬蛋白，參與DNA的合成，類似二聚體。二、真核生物DNA聚合酶附屬蛋白1、RFC：復(fù)制因子C(Re1813、PRP1和PRP2PrimerRecognitionProtein

增加DNA聚合酶與模板－引物末端的親和力，增加DNA聚合酶的活性。3、PRP1和PRP2182三

引物酶primase

DNA聚合酶不能引發(fā)DNA新生鏈的合成，只能在已存在的DNA鏈或RNA鏈上延長(zhǎng)DNA。引物酶催化引物RNA的合成。三引物酶primase

183

四連接酶ligase

催化岡奇片段間磷酸二酯鍵的形成，二個(gè)片段必須都與完整的模板鏈結(jié)合。大腸桿菌的連接酶需NAD+，真核細(xì)胞的連接酶需要ATP?？蛇B接雙鏈DNA中的單鏈切口，RNA-DNA雜交體雙鏈單鏈切口，不能連接雙鏈RNA中的單鏈切口。

四連接酶ligase

催化岡奇片段間磷酸二184五與DNA解鏈和解旋有關(guān)的酶（一）DNA螺旋酶（Helicase）催化雙螺旋解旋和解鏈需消耗ATP五與DNA解鏈和解旋有關(guān)的酶（一）DNA螺旋酶（185（二）拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topoisomerase)促進(jìn)DNA雙鏈的解開(kāi)。需消耗ATP。（二）拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topoisomerase)186（三）復(fù)制蛋白A（ReplicationProteinA，RPA）

也稱DNA單鏈結(jié)合蛋白（SingleStrandBindingprotein，SSB）主要功能：與單鏈親和力大，穩(wěn)定單鏈結(jié)構(gòu)，保護(hù)單鏈免受核酸酶水解和阻止雙鏈形成，有利復(fù)制進(jìn)行。在復(fù)制起始階段,在細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)信號(hào)作用下,起始復(fù)合物被激活,解螺旋酶解開(kāi)DNA雙鏈,RPA特異地結(jié)合到暴露的DNA單鏈上促進(jìn)DNApolα/引發(fā)酶復(fù)合物合成第一個(gè)RNA引物和DNA短鏈;在延長(zhǎng)階段,RPA解開(kāi)雙鏈維持DNA模板處于單鏈狀態(tài),并保護(hù)單鏈的完整性,使DNA連續(xù)復(fù)制。（三）復(fù)制蛋白A（ReplicationProte187DNA的生物合成1課件188DNA復(fù)制的忠實(shí)性

保證復(fù)制忠實(shí)性的因素：1堿基之間的氫鍵配對(duì)作用10-4~10-52DNA聚合酶選擇正確堿基的作用3DNA聚合酶的校正作用和3’→5’外切酶活性。延長(zhǎng)之前先校正，切除3’-末端錯(cuò)配的堿基。PolyIII和Poly.

DNA復(fù)制的忠實(shí)性保證復(fù)制忠實(shí)性的因素：189DNA的生物合成1課件1904、錯(cuò)配修復(fù)(mismatchrepair)半甲基化DNA。新合成鏈未甲基化。箭頭所指處為錯(cuò)配堿基起始位點(diǎn)外切酶切除錯(cuò)配堿基DNA聚合酶III等修復(fù)甲基化酶甲基化人類細(xì)胞中存在類似的錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制4、錯(cuò)配修復(fù)(mismatchrepair)半甲基化DNA191

第四節(jié)DNA復(fù)制的調(diào)控DNA復(fù)制是細(xì)胞增殖的一個(gè)關(guān)鍵事件，因此，DNA復(fù)制與細(xì)胞分裂是互相協(xié)調(diào)、互相調(diào)控的。無(wú)論原核還市真核細(xì)胞中DNA復(fù)制都只發(fā)生在細(xì)胞周期中特定時(shí)期，在一個(gè)細(xì)胞周期中，DNA必須也只能復(fù)制一次。第四節(jié)DNA復(fù)制的調(diào)控DNA復(fù)制是細(xì)胞192一大腸桿菌復(fù)制的調(diào)節(jié)1，起始體（orisome，起始復(fù)合物，蛋白質(zhì)-oriC復(fù)合物）的裝配

參與形成orisome的組分：DnaA,Hu,IHF，F(xiàn)is，Dpi，IciA，Cnu，Hha，Rob，SeqA，ArcA相互作用：Fis,IHF調(diào)節(jié)

DnaA-ATP與oriC

的結(jié)合，HU調(diào)節(jié)DnaA,IHF結(jié)合到oriC,并增強(qiáng)DnaA解鏈能力。一大腸桿菌復(fù)制的調(diào)節(jié)1，起始體（orisome，起1932，防止復(fù)制再次起始(1)DnaA活性的抑制

DnaA-ADPDnaA-ATP無(wú)活性RIDA有活性2，防止復(fù)制再次起始194oriC(2)降低游離形式的DnaA水平DnaA結(jié)合位點(diǎn)datA區(qū)在復(fù)制后極短時(shí)間內(nèi)降低DnaA水平可以結(jié)合300分子的DnaAoriC(2)降低游離形式的DnaA水平DnaA結(jié)合195隔離oriC

oriCGATCCTAG甲基化未甲基化摸板鏈新合成鏈SeqA特異識(shí)別,并結(jié)合于半甲基化oriC的GATC序列,使oriC被隔離,防止復(fù)制再次發(fā)生oriCGATCCTAG甲基化未甲基化摸板鏈新合成鏈Seq196二真核生物復(fù)制起始調(diào)空1、DNA復(fù)制起始的調(diào)控2、細(xì)胞周期監(jiān)控點(diǎn)機(jī)制二真核生物復(fù)制起始調(diào)空1、DNA復(fù)制起始的調(diào)控197(一)、DNA復(fù)制起始的調(diào)節(jié)1、復(fù)制起始點(diǎn)的選擇復(fù)制起始點(diǎn)數(shù)量的調(diào)控真核細(xì)胞有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，起用多少起始點(diǎn)決定于S期的長(zhǎng)短。S期短，起始點(diǎn)多。S期長(zhǎng)，起始點(diǎn)少。遺傳性起始點(diǎn)：DNA上的起始元件功能性起始點(diǎn)：實(shí)際起始點(diǎn)遺傳性起始點(diǎn)多于功能性起始點(diǎn)(一)、DNA復(fù)制起始的調(diào)節(jié)1、復(fù)制起始點(diǎn)的選擇198酵母細(xì)胞3號(hào)染色體上有14個(gè)遺傳性復(fù)制起始點(diǎn)，只有6個(gè)功能性復(fù)制起始點(diǎn)。將Ura3基因處的強(qiáng)復(fù)制起始點(diǎn)突變后，在其附近的弱復(fù)制起始點(diǎn)就成為強(qiáng)復(fù)制起始點(diǎn)。酵母細(xì)胞3號(hào)染色體上有14個(gè)遺傳性復(fù)制起始點(diǎn)，只有6個(gè)功能性199高等真核生物細(xì)胞至今未發(fā)現(xiàn)遺傳性復(fù)制起始點(diǎn)的序列特征，但確實(shí)存在功能性的復(fù)制起始點(diǎn)。CHO細(xì)胞核蟾蜍卵細(xì)胞抽提物損壞CHO細(xì)胞核或