《時空組學樣本制備操作規(guī)范》

Q/LB.□XXXXX-XXXX目次TOC\o"1-1"\h\t"標準文件_一級條標題,2,標準文件_附錄一級條標題,2,"前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術語和定義 14縮略語 25樣本要求 25.1樣本前處理 25.2樣本處理 25.3切片 35.4儲存 36組織樣本石蠟包埋 36.1樣本前處理 36.2石蠟包埋 46.3切片 46.4儲存 4附錄A（資料性）植物和動物組織樣本的處理方法 5A.1植物組織樣本的處理方法 5A.2動物組織樣本的處理方法 5附錄B（資料性）動物和植物組織切片厚度 7B.1動物和植物組織切片厚度 7附錄C（資料性）FAA固定液和蔗糖-PBS溶液（3%）配制方法 8C.1FAA固定液 8C.2蔗糖-PBS溶液（3%） 8參考文獻 9前言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由深圳市生命科技產學研資聯(lián)盟提出并歸口。本文件起草單位：本文件主要起草人：本文件為首次發(fā)布。時空組學樣本制備操作規(guī)范范圍本標準提供了時空組學冷凍組織樣本和石蠟組織樣本的制備建議。本標準適用于開展時空組學研究的相關機構。規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T37864-2019/ISO20387:2018生物樣本庫質量和能力通用要求術語和定義GB/T37864-2019/ISO20387:2018界定的以及下列術語和定義適用于本文件。

時空組學stereo-seq是指主要研究細胞在組織樣品中的相對位置關系，用于揭示細胞空間分布關系對疾病、器官發(fā)育等生物學進程的影響。

組織樣本tissuesample以研究為目的，從生物體中切取的組織。

石蠟包埋paraffinembedding將組織樣本置于石蠟中，產生堅硬的周圍基質，以便切割出薄層顯微切片的過程。

OCT包埋optimalcuttingtemperaturecompoundembedding是指利用一種聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物包埋劑將需要包埋的組織包裹起來以提供性能支撐或化學保護的過程。

處理processing在生命周期的所有階段對生物樣本和相關數據執(zhí)行的全部活動。[來源：GB/T37864-2019/ISO20387:2018,3.36]

儲存storage將生物樣本保持在特定條件下以備將來使用。[來源：GB/T37864-2019/ISO20387:2018,3.47]切片slice指用特制刀具將生物體的組織切成適用于時空組學實驗的薄片。透明clearing是指利用透明劑的性質將脫水劑從組織中置換出來，使石蠟能夠順利進入材料中的過程。浸蠟waxing指組織透明后，在熔化的石蠟內浸漬的過程。縮略語下列縮略語適用于本文件。OCT：OCT包埋（Optimalcuttingtemperaturecompound）FAA：酒精醋酸福爾馬林混合固定液（Formalin-aceticacid-alcohol）組織樣本冷凍包埋ACSF：人工腦脊液（Artificialcerebrospinalfluid）PBS：磷酸緩沖鹽溶液（Phosphatebufferedsaline）樣本要求樣本應為新鮮組織或速凍組織塊。樣本前處理對于不同的組織，宜采用不同方式獲取組織樣本。在樣本處理過程中不應有組織的擠壓和形變，應根據預期要求選擇對組織樣本進行固定或不固定直接包埋處理。固定組織樣本處理植物組織樣本固定處理參考附錄A.1.1。動物組織樣本固定處理參考附錄A.2.1。樣本直接包埋前處理植物組織樣本直接包埋前處理參考附錄A.1.2。動物組織樣本直接包埋前處理參考附錄A.2.2。樣本運輸如需運輸樣本，應采取干燥運輸方式。如實驗室條件允許，建議在新鮮樣本離體30分鐘內進行速凍、直接包埋或固定處理，最大程度上避免組織內部RNA降解。干燥運輸方式是指將新鮮組織放置在干燥無菌容器內，置于干冰上保持低溫運輸。經過固定處理后的組織應保存在固定液中常溫運輸。樣本處理樣本包埋前組織表面不應有液體殘留。直接冷凍包埋直接冷凍包埋應采用液氮異戊烷包埋或干冰包埋。液氮異戊烷包埋液氮異戊烷包埋宜采用如下步驟：操作人員提前準備好不同尺寸的不銹鋼燒杯，其中大燒杯加入1/3液氮，小燒杯加入1/3的異戊烷。將盛有異戊烷的小燒杯放入盛有液氮的大燒杯中，應孵育至少10分鐘；提前在包埋盒底部加入一層厚度約3mm的OCT，液氮冷凍至OCT泛白。應盡量保持OCT表面平整；預先確定組織包埋的方向，將組織放入包埋盒中預鋪的OCT上，調整方向后加入預冷的OCT完全覆蓋組織，在此過程中應避免產生氣泡；用鑷子夾起包埋盒放入用液氮預冷過的異戊烷中，等待OCT完全變硬；組織包埋完成后，在包埋盒的四面標記組織方向和預切片方向；需將OCT包埋的組織塊放入-80℃的密封容器中長期保存，或即刻進行冷凍切片和切片放置。干冰包埋干冰包埋宜采用如下步驟：操作人員提前將包埋盒放置于干冰中進行預冷，并提前將OCT放置干冰上預冷10分鐘；提前在包埋盒底部加入一層厚度約3mm的OCT，應盡量保持OCT表面平整；待包埋劑冰凍至不透明狀后，按照預定的方向將組織放置在OCT上，并鋪上OCT，多次操作直至組織完全覆蓋；組織包埋完成后，在包埋盒的四面標記組織方向和預切片方向；需將OCT包埋的組織塊放入-80℃的密封容器中長期保存，或即刻進行冷凍切片和切片放置。切片OCT試劑填充樣品盤后，將OCT包埋的組織塊置于樣品盤上，應切面朝外放置在冷凍切片機上。切片前，應將OCT包埋的組織塊放入冷凍切片機的腔體中溫度平衡30分鐘以上。組織塊過冷會導致切片破裂，組織塊過熱會導致切片壓縮或皺縮。冷凍切片機腔體和凍頭的溫度應參考切片機說明書設定至符合預期要求，載玻片宜冷卻至少30分鐘至低溫。應使用冷凍切片機去除多余的OCT，持續(xù)切片至組織清晰可見。切片時宜將較大的組織樣本分割為較小的樣本以覆蓋捕獲區(qū)域。建議對冷凍組織切片進行質檢，以確定組織中RNA的完整性。組織切片厚度見附錄B。獲得所需的組織切片后，宜使用低溫恒溫刷小心將組織切片展平。將預先進行溫度平衡的載玻片捕獲區(qū)域刀口貼到組織切片上，用手指貼放在載玻片的背面使整個組織貼片完全貼附在載玻片上。切片和組織切片放置過程中需全程在冷凍切片機內進行。儲存應使用已在4℃溫度下提前預冷的OCT覆蓋剩余OCT冷凍組織塊的暴露組織面，使其凍結并放入密封盒，保存在-80℃的冰箱中。組織樣本石蠟包埋樣本前處理樣本固定進行石蠟包埋的組織在取材后應迅速置于FAA固定液中進行固定，F(xiàn)AA固定液配制方法見附錄C.1。脫水脫水程序宜采用逐級脫水，從較低濃度酒精，逐漸替換到高濃度酒精緩慢進行，避免組織出現(xiàn)變硬、變脆或發(fā)生收縮的現(xiàn)象。等級脫水為50%濃度酒精→70%濃度酒精→80%濃度酒精→95%濃度酒精→無水酒精（兩次），每級停留時間視組織的大小和類型做適當調整。透明透明程序宜采用逐級的方式進行，減少材料收縮。逐級透明為2/3純酒精+1/3二甲苯→1/2純酒精+1/2二甲苯→1/3純酒精+2/3二甲苯→二甲苯（兩次）。透明時間視組織的大小和類型做適當調整。如樣本材料放入二甲苯中有白色渾濁現(xiàn)象發(fā)生時，需把樣本材料退回至純酒精中再次進行脫水。浸蠟在樣本材料最后一次進行二甲苯透明后即可浸蠟，浸蠟宜從低溫到高溫、從低熔點到高熔點逐級進行。整個浸蠟過程應在水浴或融蠟恒溫箱中進行，避免使用明火加熱石蠟。浸蠟逐級過程為石蠟（軟蠟：熔點45℃～50℃）→石蠟（硬蠟：熔點56℃～58℃）→石蠟（硬蠟：熔點56℃～58℃），直至石蠟飽和為止。石蠟包埋石蠟包埋宜采用如下步驟：操作人員將融化的石蠟（硬蠟）倒入包埋模具中；將浸蠟后的組織塊按切面或指定面朝下，用加熱后的鑷子輕輕夾取埋入含有熔蠟的包埋模具中；將組織塊平整的置放于包埋模具的底面中央，應避免氣泡的產生；當蠟塊冷至蠟面出現(xiàn)一層透明蠟模時，浸入冷水中迅速使其冷卻；從包埋模具中取出包埋蠟塊，應將樣品編號封于蠟塊上，以免樣品混淆。用刀片修正成為規(guī)則的正方形或長方形，并可粗視到材料切面。切片切片機的使用應參照廠商提供的使用方法，組織切片厚度見附錄B。切片機刀口運行方向應與材料切面平行，根據樣本類型和預期要求調整所需切片厚度，并進行切片。切片應完整、均勻、無刀痕顫痕、無褶皺開裂和缺損，建議進行鏡檢。選取合適的石蠟切片放入37℃～50℃的溫水中使其展開后附于載玻片上。附著的過程應避免切片與載玻片之間產生氣泡。應將載玻片斜置，使多余的水分流出并進行烘烤。載玻片一端宜貼上樣本條形碼標簽，并進行HE染色并封片。儲存石蠟組織塊在每次切片后應及時將切面用蠟封蓋，避免組織與空氣直接接觸。宜采用蠟封固切片和-20℃低溫保存組織切片來避免抗原損失，或石蠟組織塊4℃低溫保存，在需要時切片使用。

（資料性）

植物和動物組織樣本的處理方法植物組織樣本的處理方法植物組織樣本固定處理植物組織樣本固定處理步驟如下：操作人員提前準備好大小合適的容器，配制2次使用量的卡諾氏固定液（乙醇：冰醋酸=3:1），置于冰上或在-20℃的溫度下預冷；固定液體積不應超過容器容積的四分之三。配制2次使用量的蔗糖-PBS緩沖液（3%），配制方法見附錄C.2；使用酒精對工具進行消毒并擦干，剪取植物材料，迅速放入預冷的卡諾氏固定液中，置于冰上或-20℃溫度下固定1小時；去凈固定液，加入新鮮的預冷過的卡諾氏固定液中，置于冰上或-20℃溫度下固定1小時；濾去固定液，加入預冷的蔗糖-PBS溶液（3%），冰上放置1小時；濾去溶液后，重新加入新的預冷蔗糖-PBS溶液（3%），在4℃的溫度下放置過夜；準備包埋盒并進行信息標記，加入OCT后置于冰上預冷；濾去液體后，同鑷子輕夾出樣本，吸干表面液體后將樣本剪切成合適包埋的尺寸，放入包埋盒中；固定后的植物樣本非常綿軟，在夾出及修剪尺寸時要注意力度。調整樣本方向，將樣本橫切面垂直于包埋盒一側的側壁，使橫切面貼在側壁上方便后續(xù)切片；將裝有樣本的包埋盒水平放置于小冰盒中，并將其水平放置于真空抽濾的干燥器，真空抽濾5分鐘（-0.1Mpa）；將包埋盒水平放置于有蓋容器中，蓋上蓋子于4℃的溫度下放置過夜后即可進行包埋，包埋操作程序見5.2。植物組織樣本直接包埋前處理植物組織樣本包埋前處理步驟如下：使用酒精對工具進行消毒并擦干；取植物樣本，用剪刀剪下測試部位，并將樣本剪切至便于包埋的尺寸；以葉片為例，可將一片葉子沿垂直于主葉脈方向剪成寬度約0.5cm的小條，盡量控制葉片寬度短于包埋盒長度，若葉片過大可按需要修剪。用鑷子夾起剪切好的植物樣本，快速放入在冰上預冷的OCT包埋盒中，并調整樣本方向；以葉片為例，將葉片條豎起，橫切面正對包埋盒的底面，將葉片條沿著包埋盒的一遍豎直排列在OCT中，用鑷子將葉片條輕輕往下壓，使葉片橫切面盡量貼到包埋盒底部，盡量保持葉片條垂直于包埋盒底部，不傾斜；以花序為例，用鑷子將花序輕輕下壓，使花序以側面方向貼到包埋盒底面，并用鑷子輕壓每朵消化，使其盡量貼到包埋盒底面。將裝有植物樣本的包埋盒水平放置到冰盒中，再將冰盒水平放置于真空抽濾的干燥器中真空抽濾5分鐘（-0.1Mpa）；抽濾后，材料位置會發(fā)生一定變化，再次用鑷子輕壓樣本，使樣本貼在包埋盒底面上，以方便后續(xù)切片；參照5.2進行包埋處理。動物組織樣本的處理方法動物組織樣本處理（灌流取樣法）動物組織樣本處理步驟如下：根據動物類型選擇合適的麻醉劑，對實驗動物進行深度麻醉，應確保對實驗動物的四肢或肌肉進行動作時，無任何疼痛或應激反應；將動物頭部固定在立體定位儀上，沿胸骨柄剪開胸腔，剪開心包膜，暴露心臟。與心尖成30°～45°夾角剪開左心室，隨即剪開右心耳，將灌注針頭從左心室插入主動脈，固定針頭；灌注常溫通氧的人工腦脊液（ACSF，0.6L/kg），并記錄開始灌注時間；常溫ACSF灌注結束后，開始灌注提前預冷通氧的ACSF，記錄開始灌注時間；預冷ACSF灌注10分鐘后，觀察灌注效果，準備取樣本組織；樣本組織獲取后需立即進行包埋，處理過程應盡快完成，確保組織的新鮮度。以腦組織為例，在記錄灌注時間時，同時剪去動物頭部皮膚準備開顱。ACSF灌注10分鐘后，揭開硬腦膜觀察灌注效果，準備取腦組織。取腦組織時，借助立體定位儀和顯微操作器將腦組織沿正中矢狀面分為左右半腦。先取下右半腦進行矢狀面包埋。隨后，在左半腦AP方向中點的位置，沿冠狀面將左半腦一分為二，并立即進行左半腦的冠狀面包埋。動物組織樣本直接包埋前處理動物組織樣本包埋前處理步驟如下：針對不同組織可采用不同方式獲取新鮮組織樣本；將新鮮組織放入清洗液中清洗2～3次，去除表面雜質。清洗后需用無菌無紡布/無菌無塵紙擦干表面液體（如需要）；新鮮組織離體后需使用無菌無紡布/無菌無塵紙將組織表面的血跡或黏液等液體擦拭干凈；如浸泡或清洗組織，需吸干組織表面液體，避免在組織表面形成冰塊影響后續(xù)包埋切片。使用酒精對工具進行消毒并擦干；根據組織大小提前準備好合適的包埋盒，將樣本剪切至便于包埋的尺寸；參照5.2進行包埋。

（資料性）

動物和植物組織切片厚度動物和植物組織切片厚度動物和植物組織切片厚度見表B.1。表B.1動物和植物組織樣本切片厚度樣本類型組織切片厚度動物腦10μm心臟10μm腎臟10μm肺10μm胃10μm大腸10μm小腸10μm脾臟10μm卵巢10μm睪丸10μm眼睛10μm甲狀腺10μm股四頭肌10μm乳房10μm～20μm植物葉芽10μm葉、根、莖10μm～20μm種子20μm

（資料性）

FAA固定液和蔗糖-PBS溶液（3%）配制方法FAA固定液福爾馬林（38%甲醛） 5mL冰醋酸 5mL70%酒精 90mL甘油（丙三醇） 5mL稱取上述試劑，進行混合搖勻。蔗糖-PBS溶液（3%）首先配制0.5?PBS緩沖液，不同體積的緩沖液配制見表C.1。表C.10.5?PBS緩沖液配制表組分名稱緩沖液體積所對應的組分取樣量5mL10mL100mL10?PBS緩沖液250μL500μL5mL無核酸酶水補充至5mL補充至10mL補充至100mL根據不同體積稱取相對應的蔗糖重量，加入新的容器中，蔗糖重量稱取見表C.2。表C.2蔗糖稱取表組分名稱緩沖液體積所對應的組分取樣量5mL10mL100mL蔗糖0.15g0.3g3g稱取蔗糖后，加入配制好的0.5?PBS緩沖液定容至對應體積，置于冰上預冷。0.5?PBS緩沖液加入蔗糖后體積會發(fā)生輕微變化，建議最后以定容體積為準。

參考文獻[1]潘建洪.冷凍切片法改良及Sox2在雞腦、肺和睪丸中的組織細胞定位與時空表達[D].廣西大學,2020.DOI:10.27034/ki.ggxiu.2020.000315.[2]潘建洪,陳秋玉,邢青波,李恭賀,吳文德,劉靈康,鄭喜邦.動物組織冷凍