結(jié)核分枝桿菌和耐藥基因的特征

..系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)課程論文題目：結(jié)核分枝桿菌及其耐藥基因的特征專業(yè)：生物工程姓名：魏文憑學(xué)號(hào)：中國(guó)·XX二0一六年十二月結(jié)核分枝桿菌及其耐藥基因的特征摘要：分枝桿菌屬主要包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群〔包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌。造成人畜共患病的結(jié)核分枝桿菌和引起麻風(fēng)病的麻風(fēng)分枝桿菌是威脅人類健康的兩類病原菌,而非結(jié)核分枝桿菌病疫情也逐年增加。因此關(guān)注分枝桿菌具有重要的科學(xué)意義及應(yīng)用價(jià)值,對(duì)農(nóng)業(yè)、衛(wèi)生和環(huán)境都用深遠(yuǎn)影響。本文主要介紹分枝桿菌的特征和一些耐藥基因的研究。關(guān)鍵詞：耐藥機(jī)制結(jié)核病生物學(xué)特征結(jié)核病的認(rèn)識(shí)及治療發(fā)展結(jié)核分枝桿菌〔Mycobacteriumtuberculosis,M.tuberculosis是全球第二大致死性傳染病—結(jié)核病的病原體。結(jié)核分枝桿菌最大的特點(diǎn)就是持留性〔persistence[1],有時(shí)感染可達(dá)幾十年,因此全球約有三分之一的人口感染結(jié)核分枝桿菌,其中每年死于結(jié)核病的人數(shù)高達(dá)180萬(wàn)〔WorldHealthOrganization.2016。中國(guó)是結(jié)核病高發(fā)的國(guó)家,已被世界衛(wèi)生組織列為全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)和特別警示的高耐藥國(guó)家之一。結(jié)核病很早就存在,在考古學(xué)界,從新石器時(shí)代人遺骨中發(fā)現(xiàn)有骨結(jié)核,古埃及木乃伊中也發(fā)現(xiàn)有結(jié)核病,說(shuō)明結(jié)核病的歷史可追溯到公元前2400-3400年。在中國(guó)歷史上,結(jié)核病也是廣泛流行的,當(dāng)時(shí)稱為癆病,是一種慢性呼吸道疾病,在認(rèn)識(shí)到它的致病菌之前,人們沒(méi)有治療的手段,只能通過(guò)環(huán)境的影響,在空氣清新、氣候濕潤(rùn)的地域抑制結(jié)核病的發(fā)作。在1882年,德國(guó)微生物學(xué)家羅伯特·科赫〔RobertKoch通過(guò)特殊的染色技術(shù),發(fā)現(xiàn)了細(xì)棒狀的結(jié)核桿菌,又通過(guò)血清培養(yǎng)基獲得了結(jié)核桿菌,證實(shí)了結(jié)核桿菌是結(jié)核病的病原菌。自此對(duì)結(jié)核病有了清晰的認(rèn)識(shí),對(duì)于結(jié)核病的檢測(cè)技術(shù)也不斷發(fā)展。法國(guó)科學(xué)家卡爾梅特〔Calmette和格林〔Guerin在1908年和1919年間,經(jīng)過(guò)230次的傳代,獲得了一株牛分枝桿菌減毒株,卡介苗[2]。自1921年首次使用以來(lái),成為有效治療兒童結(jié)核病的疫苗,但對(duì)于成人型結(jié)核病的的治療很有限。到了上世紀(jì)中期以來(lái),臨床上又應(yīng)用了一些抗結(jié)核的藥物,如異煙肼〔INH、利福平〔RIF、鏈霉素〔SM、吡嗪酰胺〔PZA等,使得結(jié)核病的防治得到了有效控制。但到了90年代,耐多藥菌和廣泛耐藥菌的發(fā)現(xiàn),以及世人對(duì)結(jié)核病防治的放松導(dǎo)致該病大有席卷重來(lái)之勢(shì)。因此對(duì)結(jié)核分枝桿菌療效確切、治療周期短、安全性高的疫苗的研發(fā)迫在眉睫。2、結(jié)核分枝桿菌的特點(diǎn)2.1細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌是一種胞內(nèi)菌,屬于放線菌,傳統(tǒng)革蘭氏染色效果不明顯,因?yàn)槠浼?xì)胞壁含有分枝菌酸,抗酸性染色為陽(yáng)性。分枝桿菌為細(xì)長(zhǎng)略帶彎曲的桿菌,大小為1-4×0.4μm,無(wú)鞭毛,無(wú)芽孢,不能產(chǎn)生內(nèi)外毒素,需要特殊的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),生長(zhǎng)極度緩慢,菌體成分為糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等。科學(xué)工作者研究一般選擇恥垢分枝桿菌,它是分枝桿菌的模式生物,具有快速生長(zhǎng)無(wú)致病性的優(yōu)點(diǎn)[3]。分枝桿菌具有大量的脂質(zhì),占菌體重量的20%—40%,胞壁中含量最多。幾乎沒(méi)有其他生物能像結(jié)核桿菌這樣產(chǎn)生如此多的脂溶性分子,多項(xiàng)研究表明細(xì)菌的毒力與其所含的脂質(zhì)分子有關(guān),尤其是糖類[3]。脂質(zhì)可防止菌體水分丟失,因此結(jié)核桿菌對(duì)干燥的抵抗力特別強(qiáng)。對(duì)酸〔3%HCl或6%H2SO4或堿〔4%NaOH有抵抗力,15min內(nèi)不受影響。對(duì)多種抗生素敏感,但長(zhǎng)期使用易引起耐藥性,而且耐藥基因能夠遺傳。結(jié)核分枝桿菌能侵染機(jī)體的任何組織、器官,其生長(zhǎng)極度好氧,肺部感染是最主要的致病方式,目前研究發(fā)現(xiàn)其毒力因子很多,包括索狀因子、脂阿拉伯甘露聚糖、分泌蛋白、代謝相關(guān)因子、轉(zhuǎn)錄因子、雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)、分泌系統(tǒng)和應(yīng)激蛋白等[4]。從分子生物學(xué)角度來(lái)看,對(duì)毒力基因的了解知之甚少。研究較多的是：編碼毒素-抗毒素系統(tǒng)的基因,控制細(xì)胞的程序性死亡以應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力[5]。編碼sigma因子的基因,通過(guò)與whiB3相互作用而活化相關(guān)基因的表達(dá)[6]。編碼過(guò)氧化氫酶的基因應(yīng)對(duì)低氧脅迫及對(duì)抗宿主巨噬細(xì)胞的活性氧[7]。Lam,KatG對(duì)細(xì)菌在巨噬細(xì)胞中的生存起作用[8]。2.2基因組和比較基因組特點(diǎn)M.tuberculosisH37Rv全基因序列圖于1998年由英國(guó)和法國(guó)科學(xué)家聯(lián)合完成,20XX臨床分離株CDC1551的全基因組測(cè)序完成,標(biāo)志著分枝桿菌的研究進(jìn)入到后基因組時(shí)代。對(duì)基因組的注釋及分析成為當(dāng)務(wù)之急,近些年來(lái),全球組學(xué)的研究取得了巨大進(jìn)展,為分枝桿菌的診斷、進(jìn)化、靶標(biāo)提供了良好的基礎(chǔ)。H37Rv全基因組由4411529bp組成,包括4000多個(gè)基因,已發(fā)現(xiàn)4005個(gè)ORFs[9]。其基因組有幾個(gè)重要的特征,G+C含量相對(duì)穩(wěn)定,高達(dá)65.6%；起始密碼子中有35%是GTG,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于枯草桿菌的9%和大腸桿菌的14%,這造成結(jié)核菌高G+C偏向；有明確功能的基因大概有2441個(gè),不含插入序列的假基因有6個(gè),仍有600多個(gè)基因不知其功能[10]。值得注意的是其有相當(dāng)多的基因編碼參與到脂肪代謝的酶類中,有10%的基因編碼PE和PPE蛋白家族,這是分枝桿菌特有的重復(fù)序列基因,而其功能仍未知,不過(guò)根據(jù)已有的研究表明,它們?cè)诿庖邔W(xué)方面有重要作用[9]。近年來(lái),有人通過(guò)芯片技術(shù)來(lái)比較不同分枝桿菌菌株的基因組差異。在無(wú)毒性的恥垢分枝桿菌中,mutY和mutM在維持恥垢非致病性起作用,另外恥垢通過(guò)半胱氨酸天冬酰胺酶依賴途徑來(lái)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡,相比結(jié)核桿菌,非致病菌能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的天然免疫應(yīng)答[11]。在結(jié)核分枝桿菌特有的129個(gè)開(kāi)放閱讀框中〔ORF,指出有39個(gè)ORF在卡介苗BCG中缺失〔主要存在3個(gè)RD區(qū)域,29個(gè)在部分BCG菌株中缺失[3]。這些H37Rv特有的ORF在無(wú)毒株中缺失,表明這些基因可能是代表了毒性因子編碼基因,也可能是結(jié)核分枝桿菌保護(hù)性抗原編碼基因[12]。3、結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)理結(jié)核分枝桿菌在長(zhǎng)期的宿主-細(xì)菌相互作用過(guò)程中,形成了自身獨(dú)特的生活習(xí)性,使其能夠適應(yīng)宿主的免疫系統(tǒng)[13]。在感染宿主后機(jī)體會(huì)調(diào)動(dòng)自身免疫防御系統(tǒng)來(lái)抵御外來(lái)入侵者,巨噬細(xì)胞在其中起重要作用。巨噬細(xì)胞是人體抵御外界壓力的第一道天然免疫屏障,在巨噬細(xì)胞感染后會(huì)利用吞噬溶酶體來(lái)降解細(xì)菌,并和樹(shù)突狀細(xì)胞一起引起宿主的一系列信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致感染的細(xì)胞死亡[14]。結(jié)核分枝桿菌通過(guò)調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)使其能夠在宿主中存活幾十年,和宿主達(dá)到一種平衡[15]。在成熟的吞噬溶酶體內(nèi),會(huì)由細(xì)胞氧化酶和誘導(dǎo)性氮氧化物合酶生成大量的活性氧,從而殺死病原菌。而分枝桿菌則通過(guò)分泌GroEL2蛋白與巨噬細(xì)胞發(fā)生相互作用,影響巨噬細(xì)胞的識(shí)別與吸附[16]。通過(guò)也會(huì)阻止吞噬溶酶體的形成和酸化,抑制自噬的形成,從而維持分枝桿菌的蛋白活性[17]。分枝桿菌在低氧的環(huán)境中會(huì)進(jìn)行休眠,并合成大量的交叉連結(jié)肽聚糖維持自身的生存,PhoP等雙組份調(diào)控系統(tǒng)對(duì)于應(yīng)對(duì)低氧脅迫有重要作用[18]。DosR蛋白與分枝桿菌的潛伏感染息息相關(guān),DosR能調(diào)控約50個(gè)快速響應(yīng)的基因,起到應(yīng)對(duì)低氧環(huán)境緊急措施的目的；在低氧處理一段時(shí)間后,受到調(diào)節(jié)的基因達(dá)到幾百個(gè)。顯然這些持久性低氧脅迫基因與結(jié)核分枝桿菌的潛伏持留感染有關(guān)[19]。4、結(jié)核分枝桿菌中的耐藥基因結(jié)核分枝桿菌在抗結(jié)核藥物研發(fā)出來(lái)時(shí),有很好的治療效果,但由于結(jié)核桿菌耐藥機(jī)制的形成,造成藥物的長(zhǎng)期使用療效急速下降。而目前結(jié)核桿菌的耐藥機(jī)制仍未完全了解清楚。近幾十年的研究表明藥物作用的靶標(biāo)的改變是大部分結(jié)核桿菌產(chǎn)生耐藥的主要原因,但也包括細(xì)菌的藥物外排泵機(jī)制、細(xì)胞膜通透性的改變等[20,21]。結(jié)核桿菌耐INH的原因很多,涉及到katG、NADH脫氫酶基因ndh、烯?；d體蛋白還原酶基因ihhA、酮?；；D(zhuǎn)移蛋白酶基因kasA以及烷基過(guò)氧化氫酶基因ahpC等。其中主要的是katG的突變,katG編碼過(guò)氧化氫-過(guò)氧化物酶,該酶能將INH氧化成異煙酸,成為煙酸的類似物,從而抑制細(xì)胞壁枝菌酸的合成[22,23]。利福平的作用是通過(guò)與結(jié)核桿菌RNA聚合酶的β亞單位結(jié)合,干擾轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始和RNA的延伸。若β亞單位突變,則阻止利福平的結(jié)合,造成耐藥；而細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的改變則會(huì)導(dǎo)致藥物的攝入減少,這種情況在鳥(niǎo)分枝桿菌復(fù)合群中有發(fā)現(xiàn)；因此兩種可能都不能排除[24]。鏈霉素是第一種有效的抗結(jié)合藥物,目前在沒(méi)有新藥出現(xiàn)的情況下仍是結(jié)核病治療的一線藥物。它是一種氨基環(huán)醇糖苷類抗生素,通過(guò)干擾蛋白質(zhì)的合成而發(fā)揮作用。編碼核糖體蛋白S12基因和16SrRNA基因的突變是目前認(rèn)為耐SM的的原因,但具體機(jī)制不完全清楚[21]。吡嗪酰胺是一種煙酰胺類似物,PZA滲透入吞噬細(xì)胞后并進(jìn)入結(jié)核桿菌菌體內(nèi),菌體內(nèi)的酰胺酶使其脫去酰胺基,轉(zhuǎn)化為吡嗪酸而發(fā)揮抗菌作用。pncA基因突變導(dǎo)致吡嗪酰胺酶活性下降或喪失,嚴(yán)重影響酶的功能。在耐PZA的一部分分離株中,發(fā)現(xiàn)pncA基因并未突變,說(shuō)明還有其他的耐藥機(jī)制[25]。5、小結(jié)耐多藥菌和廣泛耐藥菌的出現(xiàn)以及未有新的抗結(jié)核藥上市的情況下,人類正面臨著結(jié)核分枝桿菌的嚴(yán)重威脅,對(duì)抗結(jié)核藥物的新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)、全新抗結(jié)核藥物機(jī)制的篩選,以及結(jié)核治療靶向給藥系統(tǒng)等的研究將為人類有效控制結(jié)核病奠定了基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)1.趙宇中,謝建平.全球分枝桿菌組學(xué)研究十年縱覽:以結(jié)核分枝桿菌為例[J].微生物學(xué)通報(bào),2013,40<10>:1929-1948.2.李洱花,梁張,寶福凱,柳愛(ài)華.結(jié)核新疫苗研究進(jìn)展[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2015,10<1>:69-74.3.李興芳.結(jié)核分枝桿菌的生物學(xué)特性與致病機(jī)制研究[J].XX醫(yī)藥,2010,29<5>:496-499.4.董海燕,張建中,萬(wàn)康林.結(jié)核分枝桿菌毒力相關(guān)因子研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2011,40<6>:157-160.5.M.Yang,C.Gao,Y.Wang,H.ZhangandZ.G.He,Characterizationoftheinteractionandcross-regulationofthreemycobacteriumtuberculosisrelbemodules,PloSone5<2010>,no.5,e10672.6.R.Manganelli,R.Provvedi,S.Rodrigue,J.Beaucher,L.GaudreauandI.Smith,Sigmafactorsandglobalgeneregulationinmycobacteriumtuberculosis,JournalofBacteriology186<2004>,no.4,895-902.7.Y.LiandZ.G.He,Themycobacteriallysr-typeregulatoroxysrespondstooxidativestressandnegativelyregulatesexpressionofthecatalase-peroxidasegene,PloSone7<2012>,no.1,e30186.8.S.T.Tseng,C.H.Tai,C.R.Li,C.F.LinandZ.Y.Shi,Themutationsofkatgandinhagenesofisoniazid-resistantmycobacteriumtuberculosisisolatesintaiwan,JournalofMicrobiologyImmunology&Infection48<2015>,no.3,249-255.9.宛寶山,張秋芬,周愛(ài)萍,等.結(jié)核分枝桿菌基因組學(xué)與基因組進(jìn)化[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2012,39<7>:7-16.10.ZhangJ,ZhangY,JiC,etal.AsurveyofMycobacteriumomicsstudiesoveradecade:M.tuberculosisasacasestudy[J].MicrobiologyChina,2013,40<10>:1929-1948.11.侯曉青,劉丹,王易.恥垢分枝桿菌在感染與免疫研究中的應(yīng)用[J].微生物與感染,2014<4>:238-244.12.S.T.Cole,Learningfromthegenomesequenceofmycobacteriumtuberculosish37rv,FEBSLetters452<1999>,no.1-2,7-10.13.A.D.TischlerandJ.D.Mckinney,Contrastingpersistencestrategiesinsalmonellaandmycobacterium,CurrentOpinioninMicrobiology13<2010>,no.1,93-99.14.S.Buroni,M.R.Pasca,R.S.Flannagan,S.Bazzini,A.Milano,I.Bertani,V.Venturi,M.A.ValvanoandG.Riccardi,Assessmentofthreeresistance-nodulation-celldivisiondrugeffluxtransportersofburkholderiacenocepaciainintrinsicantibioticresistance,BMCMicrobiology9<2009>,no.1,1-11.15.李瑞芳,管志玉,付玉榮,等.結(jié)核分枝桿菌與宿主作用相關(guān)蛋白研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2014,30<3>:306-309.16.C.H.Gao,M.YangandZ.G.He,Characterizationofanovelarsr-likeregulatorencodedbyrv2034inmycobacteriumtuberculosis,PloSone7<2012>,no.4,e36255.17.苗青,申阿東.結(jié)核分枝桿菌與宿主巨噬細(xì)胞相互作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].XX醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,41<10>:920-924.18.鄔博,雷英