蛋白質(zhì)的性質(zhì)實驗一-蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)

1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)實驗（一） 蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)一、實驗?zāi)康牧私獾鞍踪|(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位及主要連接方式了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)原理學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法二、實驗原理雙縮脲反應(yīng)兩分子尿素加熱到180左右時，生成雙縮脲并放出一分子氮，雙縮脲在堿性環(huán)境中能與Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應(yīng)，因此該反應(yīng)可用于蛋白質(zhì)的定性或定量測定茚三酮反應(yīng)所有的-氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)，除了脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)該反應(yīng)十分靈敏，是一種常用的氨基酸定量測定方法該反應(yīng)分為兩步：第一步是氨

2、基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮結(jié)合另一分子水合茚三酮和氨縮合生成有色物質(zhì)水合茚三酮藍(lán)紫色黃色反應(yīng)（Pauly反應(yīng)）含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進(jìn)一步形成深橙色的硝醌酸鈉多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以有黃色反應(yīng)，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)硝基酚(黃色) 鄰硝醌酸鈉(橙黃色)考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)考馬斯亮藍(lán)G-250具有紅色和藍(lán)色兩種色調(diào)，在酸性溶液中其以游離態(tài)存在，呈棕紅色；當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色考馬斯亮藍(lán)G-250染色靈敏度比氨基黑高

3、3倍，反應(yīng)速度快，約在2min左右時間內(nèi)達(dá)到平衡，室溫1h內(nèi)保持穩(wěn)定在0.011.0mg蛋白質(zhì)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與A505nm值成正比，所以常用來測定蛋白質(zhì)的含量三、實驗器材試管及試管架試管夾酒精燈滴管電爐濾紙四、實驗材料與試劑尿素10NaOH溶液1CuSO4溶液2卵清蛋白溶液0.5甘氨酸溶液0.1茚三酮水溶液0.1茚三酮乙醇溶液雞蛋清溶液頭發(fā)指甲0.5苯酚溶液濃硝酸0.3色氨酸溶液0.3酪氨酸溶液考馬斯亮藍(lán)G-250溶液五、實驗操作雙縮脲反應(yīng)取少量尿素結(jié)晶，放入干燥的試管，微火加熱使尿素熔化，熔化的尿素開始硬化時停止加熱，尿素放出氮，形成雙縮脲冷卻后，加入1mL 10NaOH溶液，振蕩混勻，

4、再加入1滴 1CuSO4溶液，振蕩，觀察實驗現(xiàn)象向另一支試管中加入約1mL 2卵清蛋白溶液和約2mL 10NaOH溶液，搖勻，再加入2滴1CuSO4溶液，隨加隨搖，觀察實驗現(xiàn)象茚三酮反應(yīng)取2支試管，分別加入2卵清蛋白溶液和0.5甘氨酸溶液各1mL，再各加0.5mL 0.1茚三酮水溶液，混勻，在沸水浴中加熱12min，觀察實驗現(xiàn)象在一塊小濾紙上滴一滴0.5甘氨酸溶液，風(fēng)干后，在原處滴一滴0.1茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，觀察實驗現(xiàn)象黃色反應(yīng)（Pauly反應(yīng)）取6支試管，按下表加入各試劑：觀察各管的現(xiàn)象，若反應(yīng)較慢，可略微放置或用微火加熱待各管出現(xiàn)黃色后，于室溫下逐滴加入10NaOH溶液至堿性，觀察顏色變化考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)取