基因工程制藥 (6)講稿

1、關(guān)于基因工程制藥 (6)第一張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月用途：主要用于癌癥、人類(lèi)免疫缺陷病毒性疾病、心血管疾病、糖尿病、貧血和許多遺傳疾病的治療。獲取方式：生化提取 基因工程表達(dá) 成本高產(chǎn)量低質(zhì)量難以保證成本低產(chǎn)量高活性強(qiáng)性質(zhì)優(yōu)實(shí)例：人生長(zhǎng)激素（侏儒癥）50 具新鮮尸體腦下垂體中提取采用基因工程從 12 升細(xì)菌培養(yǎng)液中提取獲得=第二張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1982 年世界上第一個(gè)基因工程藥物 重組人胰島素獲準(zhǔn)生產(chǎn)銷(xiāo)售，至今已有 100 多個(gè)生物技術(shù)藥物上市;促紅細(xì)胞生成素（EPO）以全球銷(xiāo)售額 38 億美元的業(yè)績(jī)，居全球最暢銷(xiāo) 10 種藥物的第6名；1989 年

2、我國(guó)第一個(gè)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因工程藥物 - 重組人干擾素（IFN1b）上市以來(lái)，目前，世界上銷(xiāo)售額排前 10 位的生物技術(shù)藥物我國(guó)已能生產(chǎn) 8 種。國(guó)際生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展動(dòng)態(tài)第三張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 概 述生物技術(shù)的核心就是基因工程，20世紀(jì)70年代基因工程誕生,最先應(yīng)用在醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域。傳統(tǒng)生物藥物由于來(lái)源及制備上的困難、價(jià)格等因素的影響，此外在制備過(guò)程可能受到的病毒、衣原體、支原體等的感染等問(wèn)題（如：生長(zhǎng)激素抑制素 1 mg 傳統(tǒng)法：10萬(wàn)只羊的下丘腦，現(xiàn)：10 L大腸桿菌培養(yǎng)液，0.3美元/mg；尿激酶從男性尿中提取；胎盤(pán)丙種球蛋白從胎盤(pán)中提取。第四張，PPT共

3、五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月應(yīng)用基因工程技術(shù)可十分方便且有效地解決傳統(tǒng)生物制藥所遇到的問(wèn)題如今，癌癥、病毒性疾病、心血管疾病以及內(nèi)分泌等方面的預(yù)防、治療和診斷藥物已可通過(guò)基因工程技術(shù)獲得。第五張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)：（1）可以大量生產(chǎn)過(guò)去難以獲得的生理活性蛋白和多肽；（2）可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)；（3）利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；第六張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（4）基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造和去除內(nèi)源性生理活性物質(zhì)的不足之處。（5）利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來(lái)源。第七張

4、，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 基因工程藥物生產(chǎn)的過(guò)程 基因工程技術(shù)是將所要重組對(duì)象的目的基因插入載體、拼接，轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌(或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌(或細(xì)胞）內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。第八張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月基因工程藥物生產(chǎn)的上游和下游上游階段：目的基因分離、工程菌（或細(xì)胞）構(gòu)建。上游階段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成；下游階段：主要指的是從工程菌（或細(xì)胞）的大規(guī)模培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化、質(zhì)量控制第九張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月獲得目的基因組建重組質(zhì)粒培養(yǎng)工程菌構(gòu)建基因工程菌或細(xì)胞產(chǎn)物分離純化除菌過(guò)濾

5、半成品檢定包裝成品檢定基因工程藥物制備的一般過(guò)程第十張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月基因工程基本過(guò)程切接轉(zhuǎn)增檢第十一張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月工程菌（或細(xì)胞）構(gòu)建中重要的工具工具：酶限制性?xún)?nèi)切酶連接酶逆轉(zhuǎn)錄酶Klenow 酶大片段（DNA聚合酶 I）核酸酶S1第十二張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 目的基因的獲得 克隆真核基因常用方法：逆轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法。（不能直接分離？） 一、逆轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，然后進(jìn)行 cDNA 的克隆表達(dá)。cDNA與模板mRNA序列嚴(yán)格互補(bǔ)，而不含內(nèi)含子。第十三張，PPT共五

6、十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月逆轉(zhuǎn)錄法的步驟 1、mRNA的純化 2、cDNA第一鏈的合成 3、cDNA第二鏈的合成 4、cDNA克隆 5、將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞 6、cDNA文庫(kù)的鑒定 7、目的cDNA克隆的分離和鑒定第十四張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月cDNA克隆示意圖mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶ss-DNADNA聚合酶IKlenow片段ds-cDNAds-cDNA核酸酶S1第十五張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月不需合成第二鏈mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶ss-DNAPCR特異引物目的cDNA鏈1985，PCR發(fā)明以后，RT-PCR得到了廣泛的應(yīng)用。二、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）第十六張

7、，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 三、化學(xué)合成法較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以用化學(xué)合成法合成。必須知道目的基因的核苷酸順序或目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序。人工化學(xué)合成的限制：一不能合成太長(zhǎng)的基因，5060bp；二是人工合成時(shí)，遺傳密碼的簡(jiǎn)并性可導(dǎo)致中性突變；三是費(fèi)用較高。第十七張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、篩選基因的新方法五、對(duì)已發(fā)現(xiàn)基因進(jìn)行改造第十八張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第四節(jié) 基因表達(dá) 基因表達(dá)：是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過(guò)程。 基因高效表達(dá)：將外源基因片段拼接到另一個(gè)基因表達(dá)體系中，使既獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物。 最佳

8、的基因表達(dá)體系：生物活性高、表達(dá)產(chǎn)量高、表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定、表達(dá)產(chǎn)物容易分離純化。第十九張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、宿主細(xì)胞的選擇好培養(yǎng)，快速長(zhǎng)，少危害，易重組，高量率，簡(jiǎn)提純。第二十張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 宿主細(xì)胞常用兩大類(lèi)： 原核細(xì)胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等； 真核細(xì)胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。第二十一張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月原核細(xì)胞 大腸桿菌：基因工程研究中采用最多的原核表達(dá)體系。 優(yōu)點(diǎn)：生長(zhǎng)快速、代謝簡(jiǎn)單、遺傳體系清楚、容易操作、細(xì)胞破碎容易。 缺點(diǎn)： 不存在導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)序列，分泌能力不足，產(chǎn)品多為胞內(nèi)

9、產(chǎn)物，提取困難； 蛋白表達(dá)后不能修飾加工（糖基化等）； 產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個(gè)蛋氨酸殘基，能引起免疫反應(yīng)； 內(nèi)毒素存留。 第二十二張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 枯草芽胞桿菌： 分泌能力強(qiáng)，蛋白質(zhì)不形成包含體。產(chǎn)物蛋白質(zhì)不能糖基化。有很強(qiáng)的胞外蛋白酶對(duì)產(chǎn)物降解。 鏈霉菌： 作為外源性基因表達(dá)受到重視。不致病、使用安全、分泌能力強(qiáng)、表達(dá)產(chǎn)物可糖基化。第二十三張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月真核細(xì)胞 酵母 是研究基因表達(dá)最有效的單細(xì)胞真核微生物。其基因組小，世代時(shí)間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無(wú)毒性。能外分泌，產(chǎn)物可糖基化。已有不少真核基因成功表達(dá)。第二十四張，PP

10、T共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 絲狀真菌 優(yōu)點(diǎn)：分泌能力強(qiáng)，能正確進(jìn)行翻譯后加工（肽剪切、糖基化）有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，純化容易。產(chǎn)物是糖基化的接近天然物。 缺點(diǎn)：生長(zhǎng)慢，生產(chǎn)率低，培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高，培養(yǎng)液濃度稀。第二十五張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、大腸桿菌體系中的基因表達(dá)（一）表達(dá)載體表達(dá)載體必須具備的條件（1）載體能獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制 (復(fù)制起點(diǎn)，ori)（2）應(yīng)具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記（3）應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能為大腸桿菌的RNA聚合酶所識(shí)別。第二十六張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6

11、月（4）應(yīng)具有阻遏子，使啟動(dòng)子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。（5）應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因.（6）所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號(hào)，即起始密碼AUG和SD序列,以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。第二十七張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常用表達(dá)載體 pBV220系統(tǒng)啟動(dòng)子多克隆位點(diǎn)終止子阻遏子P23復(fù)制起始位點(diǎn) 它已成功地表達(dá)了人白細(xì)胞介素2，干擾素和腫瘤壞死因子等外源基因。 氨芐青霉素抗性基因 限制性?xún)?nèi)切酶 SD序列第二十八張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 pBG-2是由pBV220系統(tǒng)衍生的便于產(chǎn)物純化的融合表達(dá)載體。 該質(zhì)粒在PRP

12、L啟動(dòng)子下游插入G蛋白中與IgG Fc段結(jié)合的結(jié)構(gòu)域基因片段180個(gè)核苷酸，下游是多克隆位點(diǎn)，引入了剪切融合蛋白的切點(diǎn)，具有與IgG結(jié)合的活性，可用親和層析。簡(jiǎn)化下游工藝。pBG-2第二十九張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素外源基因的劑量 外源基因拷貝到高拷貝數(shù)的表達(dá)質(zhì)粒上，總體表達(dá)水平提高 外源基因的表達(dá)效率 與啟動(dòng)子強(qiáng)弱，核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性，SD序列與起始密碼的間距，密碼子的組成等都影響其表達(dá)效率第三十張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性細(xì)胞代謝負(fù)荷宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開(kāi)細(xì)胞的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)分成兩

13、個(gè)階段工程菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化工程菌培養(yǎng)條件，提高基因表達(dá)水平第三十一張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（三）真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式 以融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因 以原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起稱(chēng)融合蛋白。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，表達(dá)蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)； 缺點(diǎn)：只能作抗原用。第三十二張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 以非融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因 非融合蛋白指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。 優(yōu)點(diǎn)：保持原有蛋白活性； 缺點(diǎn)：易被蛋白酶破壞。第三十三張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 分泌型表達(dá)蛋白藥物

14、基因 優(yōu)點(diǎn)：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不含 蛋氨酸殘基； 缺點(diǎn)：產(chǎn)量不高， 信號(hào)肽不被切割。第三十四張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、酵母中的基因表達(dá)（一）表達(dá)載體 酵母載體是可以攜帶外源基因在酵母細(xì)胞內(nèi)保存和復(fù)制，并隨酵母分裂傳遞到子代細(xì)胞的DNA或RNA單位。1.載體的復(fù)制序列 酵母附加體質(zhì)粒（yeast episomal plasmid， Yep類(lèi)） 酵母復(fù)制型質(zhì)粒（yeast replication plasmid， Ypp類(lèi)）酵母著絲粒質(zhì)粒（yeast centromeric plasmid， YCp類(lèi)）酵母整合型質(zhì)粒（yeast inteegrative plasmid，

15、YIp類(lèi)） 第三十五張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 2. 克隆載體 酵母質(zhì)粒的加工和制備大部分是通過(guò)大腸桿菌進(jìn)行的，只有在最后階段才轉(zhuǎn)入酵母中，這就要求酵母載體也同時(shí)具有在大腸桿菌中復(fù)制和增殖的能力。 3. 表達(dá)載體 將酵母菌的啟動(dòng)子和終止子等有關(guān)控制序列引入上述載體的適當(dāng)位點(diǎn)后，就構(gòu)成了酵母菌的表達(dá)載體。又分為普通表達(dá)載體和精確表達(dá)載體 第三十六張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 普通表達(dá)載體，只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的組成，特別是對(duì)其N(xiāo)末端氨基酸是否增減并無(wú)嚴(yán)格要求。 精確表達(dá)載體，要求在啟動(dòng)子或信號(hào)肽編碼序列的適當(dāng)部位有內(nèi)切酶點(diǎn)，以利于接入外源基因

16、，并使他在表達(dá)加工后N末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同，既無(wú)多余的氨基酸，也無(wú)缺失的氨基酸。第三十七張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素 外源基因的劑量 外源基因的表達(dá)效率 第三十八張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月外源蛋白的糖基化宿主菌株的影響(5)培養(yǎng)條件第三十九張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)物類(lèi)似于天然產(chǎn)物，容易分離純化缺點(diǎn)：動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)慢，培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高培養(yǎng)液濃度較小。第四十張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月主要基因工程表達(dá)體系比較表達(dá)體系 產(chǎn) 物 產(chǎn)生部位 培養(yǎng)方式 提 純 產(chǎn)物

17、活性 潛在危性大腸桿菌 多肽蛋白質(zhì) 菌體內(nèi) 容易 一般 對(duì)原核好 不大 融合蛋白質(zhì) 部分高產(chǎn) 對(duì)真核差 酵 母 多肽蛋白質(zhì) 菌體內(nèi) 容易 菌體內(nèi) 真核的接近 不大 糖基化蛋白 外分泌 可高產(chǎn) 稍復(fù)雜 天然產(chǎn)物 哺乳動(dòng)物 完 整 外分泌 較難成本高 簡(jiǎn)單 可達(dá)天然 需注意 糖基化蛋白 可高產(chǎn) 產(chǎn)物 致癌第四十一張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1、mRNA的純化真核細(xì)胞 mRNA 3-polyA （20250)采用Oligo dT-纖維素，以親和層析法將mRNA從細(xì)胞總RNA中分離出來(lái)。2、cDNA第一鏈的合成 可用寡聚dT作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，開(kāi)始cDNA鏈的合成。第四十二張，

18、PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、cDNA第二鏈的合成除去cDNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈(堿解或RNaseH酶解)然后以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈。由于第一鏈cDNA鏈3-末端往往形成一個(gè)發(fā)夾形結(jié)構(gòu)，所以，可以從這一點(diǎn)開(kāi)始合成cDNA第二鏈(常用Klenow酶或DNA聚合酶I)切除發(fā)夾結(jié)構(gòu)（核酸酶S1，專(zhuān)一性切除單鏈DNA）第四十三張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4、cDNA克隆用于cDNA克隆的載體有三類(lèi)： 細(xì)菌質(zhì)粒（如pBR322、 pUC等）插入片段10kb 動(dòng)植物病毒 根據(jù)重組后插入的cDNA能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì) 非表達(dá)型載體（pBR322及gt10

19、 ） 表達(dá)型載體（pUC及gt11 ）有利于目的基因的篩選 第四十四張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5、將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞1、轉(zhuǎn)化：指質(zhì)粒DNA 或以它為載體構(gòu)建的重組DNA 導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。 2、轉(zhuǎn)染：指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程。 脂質(zhì)體介導(dǎo)： 原生質(zhì)體融合： 電穿孔： 顯微注射： 基因槍?zhuān)?病毒介導(dǎo)： 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染：第四十五張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月6、cDNA文庫(kù)的鑒定1、表型改變： 抗生素抗性（抗性基因失活和菌落或噬菌斑顏色改變） a互補(bǔ)： 報(bào)告基因： 缺陷恢復(fù)：2、結(jié)構(gòu)特征： DNA大?。?酶切圖譜： 雜交（核酸、蛋白）： PCR檢測(cè)： DNA序列分析3、免疫化學(xué)檢測(cè)：表達(dá)產(chǎn)物分析第四十六張，PPT共五十二頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月7、目的cDNA克隆的分離和鑒定從cDNA文庫(kù)中分離特異的cDNA克隆，主要采用：（1）核酸探針雜交法。 根據(jù)目的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，人工合成相應(yīng)的單鏈寡核苷酸作為探針，從cDNA文庫(kù)中分離特異cDNA克隆。（2）免疫反應(yīng)鑒定法。 用表達(dá)型載體構(gòu)建的cDNA文庫(kù)，可用免疫學(xué)方法分組逐一鑒定各cDNA的表達(dá)產(chǎn)物，即以某種蛋白質(zhì)的抗體尋找相應(yīng)的特異cDNA克隆。第四十七張，PPT共