如何用糞菌移植治療腸道急性移植物抗宿主病

1、如何用糞菌移植治療腸道急性移植物抗宿主病異基因造血干細(xì)胞移植（allo-HSCT）是多種血液系統(tǒng)疾病無可取代的治療手段。移植物抗宿主?。℅VHD）是其常見的并發(fā)癥，也是制約患者生存的重要原因。國內(nèi)資料顯示，中度和重度急性GVHD（aGVHD）的發(fā)生率為13%47%，僅有25%30%的級和1%2%的級aGVHD患者獲得長期存活（2年）。aGVHD主要累及皮膚（81%）、胃腸道（54%）和肝臟（50%）三個(gè)器官，其中胃腸道aGVHD（GI-aGVHD）是allo-HSCT后非復(fù)發(fā)死亡的主要原因。近年，利用糞菌移植（fecal microbiota transplantation, FMT）治療aG

2、VHD已成為研究熱點(diǎn)。一、典型病例患者，男，35歲，診斷為骨髓增生異常綜合征伴多系血細(xì)胞發(fā)育異常（MDS-MLD），IPSS-R中危，長期輸血依賴。患者及家屬有強(qiáng)烈移植意愿，但患者無HLA相合同胞和無關(guān)供者，綜合考慮后選擇行表兄供表弟（旁系）單倍型造血干細(xì)胞移植?；颊咴煅亟樌D(zhuǎn)入移植后病房繼續(xù)治療。移植后28 d（+28 d）出現(xiàn)皮膚aGVHD，+33 d發(fā)生腸道aGVHD，起初患者表現(xiàn)為黃色稀水便，每日總量570 ml，每日腹瀉次數(shù)7次，根據(jù)MAGIC分級標(biāo)準(zhǔn)評估患者為級腸道aGVHD，后患者糞便性狀轉(zhuǎn)為墨綠色水樣便，每日總量1 070 ml，腹瀉次數(shù)10次，并伴隨出現(xiàn)腹痛、血便（進(jìn)展

3、為級腸道aGVHD）。在整個(gè)治療期間，患者先后應(yīng)用甲潑尼龍（2 mgkg-1d-1）、他克莫司、巴利昔單抗、重組人型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白、布地奈德等，均治療無效。與患者溝通后，予放置胃空腸管行FMT，首次FMT后第2天，患者腹痛、腹瀉癥狀沒有任何改善，腹瀉量反而增加（最多達(dá)到1 255 ml），但在FMT后第3天，患者腹痛程度減輕，腹瀉量明顯減少，最少時(shí)24 h腹瀉量僅225 ml，血便漸止，1周后行第二次FMT，患者的腸道aGVHD逐步控制好轉(zhuǎn)，直至完全緩解，最終患者在糖皮質(zhì)激素等藥物減量后病情無反復(fù)，順利出院。二、GI-aGVHD的發(fā)生、發(fā)展及其與腸道菌群失調(diào)的相關(guān)性GI-aGV

4、HD主要是由于胃腸道免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)機(jī)制紊亂和供者細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞過度反應(yīng)所致。預(yù)處理及感染造成上皮細(xì)胞損傷和炎癥環(huán)境，患者抗原呈遞細(xì)胞（APC）黏附分子、共刺激分子和抗原表達(dá)增加，呈遞抗原導(dǎo)致供者T細(xì)胞激活、增殖、產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和先天性免疫細(xì)胞，作用于胃腸道，其腸上皮干細(xì)胞、Paneth細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、黏液層是GI-aGVHD的攻擊靶點(diǎn)，導(dǎo)致腸道通透性增加、腸道緊密連接破壞、黏液層和抗菌物質(zhì)減少，隨后激活免疫反應(yīng)受體和細(xì)胞因子風(fēng)暴。健康人群中腸道菌群以擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門為主，占90%以上。腸道菌群失調(diào)已被證實(shí)是GI-aGVHD的影響因素。allo-HSCT后，患者

5、共生菌群向腸球菌相對轉(zhuǎn)移，這種轉(zhuǎn)變在隨后發(fā)展為GVHD的患者中尤為明顯，發(fā)生GVHD的患者的腸球菌比例由21%增加到46%，在GVHD活躍期可高達(dá)74%。研究表明，aGVHD患者較非GVHD患者厚壁菌門（毛螺菌科和瘤胃球菌科）和腸球菌屬占比更高，其中腸道aGVHD患者糞便中擬桿菌門占比更低。對55例allo-HSCT患者的隨機(jī)對照研究中（23例接受自體FMT治療，18例對照組），腸道微生物群組成變化的分析表明，治療組患者重建了重要的共生群（毛螺菌科、瘤胃球菌科和擬桿菌）。在嚴(yán)重GI-aGVHD患者中，腸道短鏈脂肪酸（SFCA）水平顯著下降（醋酸鹽75.8%，丙酸鹽95.8%，丁酸鹽94.6%）

6、，SCFA變化與對應(yīng)的產(chǎn)丁酸鹽菌種的增減一致。布勞特氏菌（Blautia）是占優(yōu)勢的人類結(jié)腸毛螺菌科，具有產(chǎn)生丁酸鹽的能力，allo-HSCT后12 d布勞特氏菌的存在與較低的復(fù)發(fā)率、GVHD死亡率和更好的總生存率有關(guān)。在小鼠GI-aGVHD模型中，給予丁酸鹽或產(chǎn)生丁酸鹽的細(xì)菌（如梭狀芽孢桿菌）可減輕GI-aGVHD。此外，移植后粒細(xì)胞缺乏合并發(fā)熱時(shí)使用具有抗厭氧共生菌活性的廣譜抗生素（如亞胺培南/西司他丁、哌拉西林他唑巴坦）與GVHD相關(guān)死亡率增加有關(guān)。最佳劑量他克莫司可誘導(dǎo)大鼠肝移植后產(chǎn)生適宜的免疫抑制，使移植物功能正常、腸道菌群穩(wěn)定，致使包括普拉梭菌和雙歧桿菌的益生菌增加，擬桿菌、腸桿菌

7、等有害菌減少。因此，特定的微生物群和代謝改變與GI-aGVHD的發(fā)生及嚴(yán)重程度相關(guān)?？傊?，造血干細(xì)胞移植后，抗生素和免疫抑制劑的使用都會影響患者腸屏障和腸道菌群的多樣性和構(gòu)成變化，這些變化貫穿GI-aGVHD發(fā)生發(fā)展的全過程，同時(shí)腸道菌群失調(diào)進(jìn)一步導(dǎo)致患者繼發(fā)性炎癥損害。雖然難以明確腸道菌群與GI-aGVHD的因果關(guān)系，但是可以肯定GI-aGVHD合并嚴(yán)重腸道菌群失調(diào)這一客觀存在，提示重建腸道菌群對治療GI-aGVHD的重要性。同時(shí)，由于GI-aGVHD以典型廣泛腸黏膜屏障損害為特征表現(xiàn)，也提示重建腸道菌群過程中需要重視其安全性。三、FMT用于GI-aGVHD的治療FMT是將健康人糞便的功能菌

8、群移植到患者腸道內(nèi)。FMT至少可追溯到公元4世紀(jì)的中國東晉時(shí)期，葛洪所著肘后備急方記載治療食物中毒和嚴(yán)重腹瀉的方法：飲糞汁一升，即活。2013年，F(xiàn)MT被納入美國醫(yī)學(xué)指南，推薦用于復(fù)發(fā)性/難治性難辨梭狀芽孢桿菌感染。然而，將大量微生物群系輸入免疫抑制狀態(tài)且合并腸黏膜屏障損壞患者的腸道內(nèi)能否導(dǎo)致繼發(fā)性微生物感染，一直是醫(yī)學(xué)界擔(dān)心的問題。2014年，Kelly等對99例接受FMT治療的低免疫狀態(tài)（HIV感染、器官移植、腸道腫瘤、炎癥性腸病使用免疫抑制劑等疾?。┖喜㈦y辨梭狀芽胞桿菌感染病例進(jìn)行了回顧性分析，結(jié)果顯示FMT的安全性可以接受。2015年，Cui等研究顯示，以FMT為基礎(chǔ)升階梯治療方案（單

9、次FMT為階段1，多次FMT為階段2，治療無效時(shí)FMT聯(lián)合糖皮質(zhì)激素為階段3）能使57.3%的糖皮質(zhì)激素依賴性潰瘍性結(jié)腸炎脫離糖皮質(zhì)激素依賴。2016年日本Fujioka等首次應(yīng)用FMT及其聯(lián)合用藥治療4例糖皮質(zhì)激素耐藥/依賴的腸道aGVHD。此后，F(xiàn)MT用于allo-HSCT后糖皮質(zhì)激素耐藥/依賴GI-aGVHD（SR-GI-aGVHD）的治療備受關(guān)注。目前aGVHD的一線治療藥物為糖皮質(zhì)激素，GI-aGVHD的有效率為50%，其中SR-GI-aGVHD患者生存率僅為5%30%。在一項(xiàng)納入721例allo-HSCT患者的單中心回顧性研究中，度SR-aGVHD占35.7%，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這部分

10、患者胃腸道或肝臟受累風(fēng)險(xiǎn)增加5倍，這可能導(dǎo)致患者allo-HSCT后早期死亡。目前FMT主要用于度SR-GI-aGVHD，部分臨床數(shù)據(jù)也證明了其療效。2016年日本Fujioka等報(bào)告：4例SR-GI-aGVHD行12次FMT后1周內(nèi)胃腸道癥狀得到改善，與FMT前相比，糖皮質(zhì)激素劑量平均減少69%。2017年奧地利格拉茨醫(yī)科大學(xué)對于3例嚴(yán)重難治性腸道aGVHD（級）行多次FMT，均獲得部分緩解（PR），其中1例患者每日腹瀉量高達(dá)6 000 ml，F(xiàn)MT后1周內(nèi)顯著減少為1 000 ml。2020年美國的阿姆斯特丹癌癥中心的前瞻性研究：15例SR-GI-aGVHD患者接受FMT治療，10例獲得完

11、全緩解（CR），5例為緩解（4例死亡）。本中心開展了一項(xiàng)非隨機(jī)對照的/期臨床研究，共納入41例度糖皮質(zhì)激素耐藥的腸道aGVHD患者（其中23例接受FMT治療），治療后21 d，F(xiàn)MT組CR率達(dá)56.5%（13/23），明顯高于對照組的16%（3/18），隨訪結(jié)束時(shí)，F(xiàn)MT組患者的中位生存時(shí)間明顯優(yōu)于對照組（539 d對107 d，P=0.021）。以上的臨床應(yīng)用均采用的是鼻十二指腸方式行單次或多次FMT，且FMT過程出現(xiàn)的胃腸道反應(yīng)均為一過性，在糞菌來源嚴(yán)格質(zhì)控的情況下，此類患者中未見FMT相關(guān)的感染及死亡情況發(fā)生。然而，一項(xiàng)分析全球2000至2020年間129項(xiàng)研究所含的FMT相關(guān)不良事件（

12、AE）顯示，所有FMT相關(guān)嚴(yán)重不良事件（SAE）發(fā)生率為1.4%，均發(fā)生于腸黏膜屏障受損患者。這提示需要重視FMT用于GI-aGVHD的潛在風(fēng)險(xiǎn)。四、如何用FMT治療腸道aGVHD（一）FMT前準(zhǔn)備1FMT來源和制備：目前用于FMT的菌種主要來源于糞菌庫。2015年南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院牽頭成立我國最大糞菌庫中華糞菌庫，作為公共庫提供異基因來源FMT。其供者來源于624歲健康人群，通過完成初篩到實(shí)驗(yàn)室篩查和監(jiān)查篩查等環(huán)節(jié)，對傳染病、免疫性疾病以及遺傳風(fēng)險(xiǎn)等風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行排除后保留的人群為合格供者。2014年，隨著世界上第一套智能糞菌分離系統(tǒng)GenFMTer進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，F(xiàn)MT的發(fā)展進(jìn)入了新階

13、段，基于智能化糞菌分離系統(tǒng)及嚴(yán)格質(zhì)控相關(guān)漂洗過程的FMT被定義為洗滌菌群移植（WMT）。WMT的主要價(jià)值在于能夠使傳統(tǒng)FMT技術(shù)的不良事件發(fā)生率下降，如治療潰瘍性結(jié)腸炎后出現(xiàn)的發(fā)熱發(fā)生率。洗滌的過程在提高FMT安全性的同時(shí)并未降低其療效。獲取用于疾病治療的WMT為低溫凍存狀態(tài)。WMT依舊屬于FMT范疇。2患者前期腸道準(zhǔn)備：受者腸道準(zhǔn)備通常指的是術(shù)前腸道清潔和使用抗生素，對于GI-aGVHD并非必需。對于必須要使用抗生素治療合并疾?。ㄈ绶尾扛腥荆┑幕颊?，F(xiàn)MT治療中也可以繼續(xù)使用抗生素。不過，對于同時(shí)使用抗生素的患者，建議考慮增加FMT次數(shù)。對于合并難辨梭狀芽胞桿菌感染的患者，要盡量停用可能導(dǎo)致

14、難辨梭狀芽胞桿菌感染的抗生素，建議盡早考慮FMT。抑制胃酸分泌藥物的使用需要結(jié)合給入途徑?jīng)Q策，若經(jīng)過鼻空腸管途徑移植，不需要額外使用質(zhì)子泵抑制劑；若輸注的菌液需經(jīng)過胃，推薦移植前使用質(zhì)子泵抑制劑，以降低胃酸對菌群的影響。胃腸動力藥物的使用需要結(jié)合胃腸動力狀態(tài)決策，若腹瀉明顯，可在菌液輸注前給予止瀉劑，如洛哌胺（通常為24 mg）可用于減緩腸道蠕動，增加菌群在腸道的定植時(shí)間；若腸蠕動緩慢（如腸麻痹），可考慮在輸入菌液日前肌肉注射新斯的明，減少菌群在小腸內(nèi)過度生長的風(fēng)險(xiǎn)。（二）FMT治療aGVHD的流程1FMT的途徑選擇：上消化道途徑包括口服糞菌膠囊、胃鏡、鼻胃鏡、鼻十二指腸/空腸置管、經(jīng)皮內(nèi)鏡胃

15、/腸造瘺空腸置管；下消化道途徑包括結(jié)腸鏡、結(jié)腸置管、乙狀結(jié)腸/直腸鏡和經(jīng)肛門保留灌腸。具體FMT途徑的選擇需根據(jù)綜合評估結(jié)果決定，GI-aGVHD患者推薦通過膠囊、胃管或鼻空腸管等上消化道途徑。尚無FMT途徑對GI-aGVHD療效影響的直接證據(jù)。2FMT劑量及頻次：管道法：在近端空腸或十二指腸放置鼻十二指腸/空腸管或胃管輸注菌液。WMT實(shí)現(xiàn)菌群富集和定量，依據(jù)洗滌菌群移植共識，我們采用WMT治療GI-aGVHD使用劑量為15 U/次（1 U含1.01013個(gè)細(xì)菌），每日1次，間隔時(shí)間可超過1日，患者治療多數(shù)為12次。依據(jù)年齡、體重決定治療劑量，如果低體重和低齡，所用劑量最少可為1 U。國外報(bào)道

16、的基于實(shí)驗(yàn)室手工制備的方法與本中心不同，以糞便重量或糞水體積為計(jì)量單位，比如，日本采用中位糞量為126（34307）g，與生理鹽水混合成糞懸液180230 ml，通過鼻十二指腸管48 min內(nèi)注入。其他中心采用收集新鮮供體糞便（50 g），用無菌生理鹽水稀釋，獲得300500 ml的糞便懸液，并于6 h內(nèi)通過鼻十二指腸管緩慢注入（10 cm3/min）。膠囊法：在病情允許的情況下，F(xiàn)MT移植前48 h停用廣譜抗生素。治療前4 h和治療后1 h禁食，囑患者勿壓碎、咀嚼或溶解膠囊。成人移植糞便量需30 g，30粒膠囊中位糞便微生物含量為38.6（24.056.7）g，如果患者可耐受的吞服劑量為80

17、%或更高，則認(rèn)為FMT是可行的。每天口服至少15粒凍干粉膠囊，糞菌膠囊的服用缺乏指南或參考標(biāo)準(zhǔn)，暫不作為急重癥GI-aGVHD首選FMT方案。移植次數(shù)和周期尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，通常參考FMT升階治療策略（step-up FMT strategy）：階段1（單次FMT）；若1周左右患者癥狀未改善或持續(xù)加重，則采取階段2（2次FMT），評估時(shí)間仍為1周左右；階段3：在階段1或階段2無效時(shí)，在FMT基礎(chǔ)上聯(lián)合常規(guī)藥物治療（如糖皮質(zhì)激素、環(huán)孢素A、抗TNF-抗體、全腸內(nèi)營養(yǎng)等），從而發(fā)揮比單獨(dú)使用FMT或傳統(tǒng)藥物都更優(yōu)的療效。對于allo-HSCT后的大部分SR-GI-aGVHD患者，臨床研究中使用單次FM

18、T居多，1周后評估療效，對于療效不佳的患者考慮可更換新的供體菌重再行FMT治療，如仍然無效，則應(yīng)重新鑒別腹瀉原因或停用FMT。該治療策略也適用于GI-aGVHD合并難治性難辨梭狀芽胞桿菌感染或者多藥耐藥患者，在重復(fù)FMT治療基礎(chǔ)上聯(lián)合抗生素治療。（三）FMT后的監(jiān)測1胃腸道aGVHD的病理改變及分級標(biāo)準(zhǔn)：GI-aGVHD的患者內(nèi)鏡下可見胃腸道黏膜紅斑水腫、出血、潰瘍。顯微鏡下可見隱窩細(xì)胞凋亡、消失，黏膜正常結(jié)構(gòu)改變。目前GI-aGVHD內(nèi)鏡分級標(biāo)準(zhǔn)采用Freiburg Criteria：1級：無明確標(biāo)準(zhǔn)；2級：斑點(diǎn)紅斑；3級：透明病變；4級：融合性缺損、潰瘍、黏膜脫落。再進(jìn)一步對GI-aGVH

19、D的組織行顯微鏡下觀察分級：1級：隱窩細(xì)胞凋亡；2級：單個(gè)隱窩丟失或伴膿腫；3級：連續(xù)的隱窩壞死；4級：黏膜區(qū)域全剝除。而臨床上最常采用的是改良Glucksberg標(biāo)準(zhǔn)（級）：級：每日腹瀉量500 ml；級：每日腹瀉量1 000 ml；級：每日腹瀉量1 500 ml；級：大量腹瀉伴血便或腹痛，腸梗阻。近年來更多中心采用MAGIC分級標(biāo)準(zhǔn)，其中成人標(biāo)準(zhǔn)為：0級：每日腹瀉500 ml或1 500 ml或7次；4級：嚴(yán)重腹痛伴或不伴腸梗阻或便血（無論排便量如何）。當(dāng)然實(shí)際aGVHD的嚴(yán)重程度分度標(biāo)準(zhǔn)采用皮膚、胃腸道和肝臟aGVHD綜合評估，才能更好地指導(dǎo)臨床治療。2療效評估：FMT治療aGVHD療效判定尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。目前部分中心對aGVHD的完全緩解定義為供體FMT后28 d內(nèi)aGVHD癥狀的完全消