微生物檢驗(yàn) 第三篇 病毒課件

1、臨床病毒學(xué)檢驗(yàn)第一節(jié) 病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)體積微小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，非細(xì)胞型微生物只含一種核酸在活細(xì)胞內(nèi)寄生以復(fù)制方式進(jìn)行增殖對(duì)抗生素不敏感，干擾素可抑制其增殖；葡萄球菌(1000nm） 牛痘病毒300250nmABCDEFG立克次體450nm衣原體390nmA、大腸桿菌噬菌體 ( 65 95nm )B、腺病毒 (70nm )D、乙腦病毒 ( 40nm )E、蛋白分子 (10nm )F、流感病毒 ( 100nm )G、煙草花葉病毒C、脊髓灰質(zhì)炎病毒 (30nm )病毒體結(jié)構(gòu)模式圖殼粒衣殼核心（核樣物）核衣殼包膜包膜病毒包膜子粒吸附穿入脫殼生物合成釋放組裝成熟 病毒沒(méi)有正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，缺乏一些與代謝有關(guān)的酶

2、，單獨(dú)不能復(fù)制，必須在活細(xì)胞內(nèi)增殖 第二節(jié) 病毒的增殖裸露病毒：胞飲作用不同病毒，穿入方式不同包膜病毒：包膜與細(xì)胞膜融合噬菌體：注入式病毒的配體位點(diǎn)與細(xì)胞表面的特異受體結(jié)合三、脫殼不同病毒脫殼方式不同多數(shù)病毒在宿主細(xì)胞溶酶體酶作用下脫殼六、釋放出芽釋放溶細(xì)胞釋放組裝：DNA病毒：一般在核內(nèi)組裝RNA病毒：多數(shù)在胞漿內(nèi)組裝病毒感染的類(lèi)型（一）隱性感染（inapparent or subclinical infection） 非顯性感染、亞臨床感染 病毒侵入機(jī)體內(nèi)，不引起臨床癥狀的感染 形成原因：病毒毒力弱、機(jī)體防御較強(qiáng)，病毒不能大量增殖，未造成細(xì)胞、組織嚴(yán)重?fù)p傷；或最終不能侵入靶細(xì)胞。 意義：獲

3、得免疫力；病毒能持續(xù)存在于體內(nèi)的原因 病毒Ag弱，不足以引起機(jī)體免疫反應(yīng)； 病毒Ag變異，機(jī)體免疫系統(tǒng)不能有效識(shí)別； 病毒基因整合在宿主細(xì)胞染色體上，病毒與細(xì)胞共存； 病毒直接侵犯免疫細(xì)胞，造成免疫功能下降; 1、慢性感染（chronic infection） 顯性、隱性感染后，病毒未完全清除，持續(xù)存在血液或組織中，處于持續(xù)增殖狀態(tài)，并不斷排出體外。臨床癥狀可有、可無(wú)。病程長(zhǎng)（數(shù)月、數(shù)年、數(shù)十年），病毒慢性進(jìn)行性損傷機(jī)體，并能檢出病毒的存在。2、潛伏感染（latent infection） 顯、隱性感染后，病毒存在于一定組織或細(xì)胞內(nèi)，不產(chǎn)生感染性病毒體。在某些條件下，病毒基因被激活而急性發(fā)作，

4、增殖出病毒顆粒，出現(xiàn)顯性感染。3、慢發(fā)病毒感染（slow virus infection） 又稱(chēng)遲發(fā)病毒感染（delay infection）; 病毒感染后，在機(jī)體內(nèi)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期潛伏(數(shù)月、數(shù)年、數(shù)十年)后，出現(xiàn)慢性進(jìn)行性疾病，最終導(dǎo)致死亡; 常見(jiàn)病毒引起： HIV AIDS; 麻疹病毒亞急性硬化性全腦炎（SSPE） 非常見(jiàn)病毒/待定致病因子引起： 朊粒羊癢疫(scrapie)，庫(kù)魯病( Kulu )等 病毒的致病機(jī)制（一）病毒對(duì)宿主細(xì)胞的直接作用1、殺細(xì)胞性感染 多見(jiàn)于裸露病毒 機(jī)制：- 阻斷細(xì)胞大分子合成； - 破壞細(xì)胞溶酶體； - 病毒毒性蛋白的作用；2、細(xì)胞膜的改變 細(xì)胞融合形成多核巨細(xì)胞

5、，細(xì)胞功能受損。細(xì)胞膜表面出現(xiàn)新抗原病毒增殖，將自身蛋白表達(dá)在宿主細(xì)胞膜上，改變宿主細(xì)胞膜成分C表面的V-Ag細(xì)胞暴露的自身抗原 CELL體液免疫細(xì)胞免疫 損傷宿主C 腎毛細(xì)血管基底膜蛋白尿,血尿V-Ag+Ab 關(guān)節(jié)滑膜關(guān)節(jié)炎 肺部支氣管炎、肺炎 A.B.IC（二） 病毒感染的免疫病理?yè)p傷1、體液免疫損傷（II,III型超敏反應(yīng)） 受染細(xì)胞表面有V-Ag、IC沉積 自身免疫2、細(xì)胞免疫損傷（IV型超敏反應(yīng)）3、直接損傷淋巴細(xì)胞或淋巴器官 如：HIV直接損傷CD4+T細(xì)胞（三）病毒的免疫逃逸 通過(guò)編碼特異性抑制蛋白或形成合胞體是病毒在細(xì)胞間傳播。IFN 細(xì)胞基因 抗病毒蛋白 自身和鄰近細(xì)胞 降解

6、病毒mRNA 抑制病毒蛋白合成 抑制病毒組裝、釋放 抑制病毒復(fù)制 中斷病毒感染；限制病毒擴(kuò)散 3、作用機(jī)理 不是直接殺滅病毒 4、生物學(xué)活性:（1）、 廣譜的抗病毒作用；抑制病毒感染、阻止病毒在體內(nèi)擴(kuò)散、促進(jìn)痊愈;（2）、調(diào)節(jié)免疫功能；（3）、 抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)； 第三十三章 病毒學(xué)檢驗(yàn)基本技術(shù)一、標(biāo)本采集與送檢：原則：盡早采取 、部位適宜、冷藏速送：冰塊或干冰、 50%的甘油緩沖鹽水 、抗生素雙份血清標(biāo)本：急性期、恢復(fù)期雙份血清二、快速檢查方法光鏡-包涵體電鏡免疫熒光ELISA分子生物學(xué)技術(shù)雜交Southern blotPCRNorthern blot三、病毒的分離培養(yǎng)檢驗(yàn)標(biāo)本殺滅雜菌(青鏈

7、霉素)接種病毒分離的一般程序：動(dòng)物接種出現(xiàn)病狀雞胚接種病變或死亡細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞病變 鑒定病毒種型1. 掌握呼吸道病毒的種類(lèi)和致病特點(diǎn)；流行性感冒病毒、SARS冠狀病毒、禽流感病毒、副黏病毒科病毒的生物特性和微生物檢驗(yàn)。2. 熟悉流行性感冒病毒、SARS冠狀病毒、禽流感病毒、副粘病毒科病毒的臨床意義。3. 了解其他呼吸道病毒的生物特性、臨床意義和微生物檢驗(yàn)。教學(xué)目的與要求 呼吸道病毒是指一大類(lèi)能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病變或僅以呼吸道為入侵門(mén)戶(hù)，主要引起呼吸道外組織器官病變的病毒。據(jù)統(tǒng)計(jì)，90%以上的急性呼吸道感染由該類(lèi)病毒引起。呼吸道病毒引起的主要疾病呼吸道病毒流行性感冒病毒禽流感病毒副粘病毒科

8、其它呼吸道病毒第一節(jié)正粘病毒科 一、流行性感冒病毒（influenza virus）（一）分類(lèi)據(jù)RNP和M蛋白抗原性分：甲、乙、丙三型甲型根據(jù)HA和NA抗原性不同，又分若干亞型 （H1H16、N1N9）乙型、丙型至今未發(fā)現(xiàn)亞型（二）臨床意義 “流行性感冒”（ Influenza ）是英國(guó)人John huzxam在1743年創(chuàng)造的字，他依據(jù)意大利語(yǔ)中用來(lái)描述這個(gè)疾病起源的片語(yǔ)“un infuenza di freddo”，即“寒冷的影響 ”。它主要發(fā)生在深秋、冬天和早春季節(jié)。每年都有數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的人群受到感染。50年代以來(lái)共三次1957年，H2N2，貴州1968年，H3N2，香港1977年，H1N

9、1，遼寧先集體，后散居先城市，后農(nóng)村傳染源：顯、隱性患者、感染的動(dòng)物傳播途徑：呼吸道飛沫傳播 V呼吸道粘膜柱狀上皮C病變壞死粘膜充血、水腫炎癥 鼻塞、咽喉腫痛、咳嗽、卡他等癥狀 毒性代謝產(chǎn)物 （局部癥狀） 入血 發(fā)熱、頭痛、肌肉酸痛、乏力等（全身癥狀）V不入血，只在呼吸道上皮局部增殖（三）生物學(xué)特性1、形態(tài)結(jié)構(gòu)： 流感病毒呈球形或絲狀，球形直徑80-120nm，新分離株絲狀多于球形,有包膜，單鏈分片段的RNA病毒。 流感病毒結(jié)構(gòu)表面：血凝素(HA)柱狀，為三聚體，基本上以相同的間距覆蓋了病毒的全部表面HA1（吸附）HA2（核衣殼釋放）血凝抑制抗體(保護(hù)性抗體) 神經(jīng)氨酸酶（NA）四個(gè)亞單位組成

10、的四聚體，并不平均分布在病毒表面，而是聚合成群。與病毒釋放有關(guān)。內(nèi)部：1、核衣殼病毒分片段的RNA，結(jié)合有核蛋白（NP）以及與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有關(guān)的三種依賴(lài)RNA的RNA多聚酶蛋白。呈螺旋對(duì)稱(chēng)。2、基質(zhì)蛋白（M蛋白）覆蓋在核衣殼外面，M蛋白抗原性穩(wěn)定，也具有型特異性。M1(增加包膜厚度)M2(輔助HA2釋放核衣殼)3、包膜來(lái)自宿主細(xì)胞的脂質(zhì)雙層膜。 流感病毒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)1、核衣殼病毒分片段的RNA，結(jié)合有核蛋白（NP）以及與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有關(guān)的三種依賴(lài)RNA的RNA多聚酶蛋白。呈螺旋對(duì)稱(chēng)。2、基質(zhì)蛋白（M蛋白）覆蓋在核衣殼外面，M蛋白抗原性穩(wěn)定，也具有型特異性。M1(增加包膜厚度)M2(輔助HA2釋放核衣

11、殼)3、包膜來(lái)自宿主細(xì)胞的脂質(zhì)雙層膜。NAHA包膜M2M1基質(zhì)蛋白41235678核衣殼RNA核蛋白 RNA聚合酶2、變異 抗原漂移（antigenic drift） 因HA或NA的點(diǎn)突變?cè)斐桑儺惙刃?，屬量變，引起局部中、小型流行?抗原轉(zhuǎn)換（antigenic shift） 因HA或NA的大幅度變異造成，屬質(zhì)變，導(dǎo)致新亞型的出現(xiàn)，引起世界性的暴發(fā)流行。 3、培養(yǎng)特性 雞胚培養(yǎng)：不引起雞胚出現(xiàn)病變，取羊水或尿囊液做血凝試驗(yàn) 細(xì)胞培養(yǎng)：紅細(xì)胞吸附試驗(yàn) 4、抵抗力 較弱，不耐熱，對(duì)干燥、乙醚、甲醛和乳酸等敏感。微生物檢驗(yàn)病毒分離培養(yǎng)(金標(biāo)準(zhǔn)) 取患者咽漱液或鼻咽拭，接種雞胚或培養(yǎng)細(xì)胞抗原檢測(cè)

12、直接從病人呼吸道分泌物、脫落細(xì)胞中檢測(cè)抗原分型鑒定 核酸雜交、PCR、序列分析血清學(xué)診斷 血凝抑制試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫測(cè)定二、 禽流感病毒（一）臨床意義截止2013年5月11日，全國(guó)內(nèi)地共報(bào)告人感染H7N9禽流感確診病例130例，其中死亡人數(shù)33人，康復(fù)人數(shù)45人。病例分布于北京（1例）、上海（33例，死亡14例）、江蘇（27例，死亡8例）、浙江（46例，死亡7例）、安徽（4例，死亡2例）、福建（5例）、江西（5例，死亡1例）、山東（2例）、河南（4例，死亡1例）、湖南（2例）10省市的39個(gè)地市。另有臺(tái)灣1例。尚未發(fā)現(xiàn)人傳人的證據(jù)。H7N9（二）生物學(xué)特性類(lèi)似流行性感冒病毒

13、（三）微生物檢驗(yàn) 標(biāo)本采集與處理：常規(guī)采集全血、死亡動(dòng)物腸內(nèi)容物、肛門(mén)拭子、氣管、肺、腸、脾、腎、腦、肝和心臟標(biāo)本。分離培養(yǎng)：雞胚培養(yǎng)法病毒抗原及抗體檢測(cè)：熒光免疫技術(shù)和酶免疫技術(shù)核酸檢測(cè)：PCR和RT-PCR 第二節(jié) 副黏病毒科 特點(diǎn)： 病毒體較大; 具另一種刺突(F蛋白); 單鏈RNA,不分節(jié)段。 種類(lèi)： 麻疹病毒 腮腺炎病毒 副流感病毒 呼吸道合胞病毒 間質(zhì)性肺炎病毒一、麻疹病毒 入侵（CD46為病毒受體）呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)增殖入血（第一次病毒血癥）侵入淋巴組織和單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)增殖后再次入血（第二次病毒血癥）多種組織、器官受累，表現(xiàn)為細(xì)胞融合成多核巨細(xì)胞，核內(nèi)形成嗜酸性包涵體等（一）臨床

14、意義麻疹的臨床表現(xiàn)潛伏期約1012天體溫略高、咳嗽、流涕、好打噴嚏及淚眼，癥狀持續(xù)35天體溫突然升高（達(dá)到4040.5C），口頰粘膜出現(xiàn)柯氏斑，隨后出現(xiàn)紅色班丘疹，從耳部開(kāi)始，23天后遍及全身4天后消退，脫屑M 蛋白螺旋狀核衣殼 （RNA和N蛋白）)HN/H/G 糖蛋白突起多聚酶 脂質(zhì)雙層包膜 F糖蛋白突起（二）生物學(xué)特性（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)血象：白細(xì)胞總數(shù)減低，淋巴細(xì)胞相對(duì)增加早期診斷：分泌物沉渣檢多核巨細(xì)胞和病毒抗原血清學(xué)檢查：特異性抗體病毒分離二、腮腺炎病毒（一）臨床意義腮腺炎病毒是流行性腮腺炎的 病原體，只有一個(gè)血清型，人是其唯一宿主病毒通過(guò)飛沫或直接接觸傳播咳嗽、噴嚏甚至說(shuō)話(huà)都可傳播病

15、毒學(xué)齡兒童為易感人群出現(xiàn)癥狀前23天及癥狀消失后9天仍有傳染性（一）臨床意義潛伏期23周在上皮細(xì)胞和局部淋巴結(jié)內(nèi)增殖入血，病毒隨血侵入腮腺及其它器官主要癥狀為腮腺腫大、睪丸炎、卵巢炎及病毒性腦炎可獲牢固的免疫力（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)分離培養(yǎng)： 標(biāo)本：患者唾液、尿液或腦脊液 方法：雞胚羊膜腔、雞胚細(xì)胞培養(yǎng)血清學(xué)診斷：病毒IgM或4倍上升的IgG 方法：血凝抑制試驗(yàn)、ELISA和免疫熒 光技術(shù)三、副流感病毒（一）臨床意義 病毒通過(guò)人與人直接接觸或飛沫傳播，進(jìn)入人體于呼吸道上皮細(xì)胞中增殖，病毒血癥罕見(jiàn)。可引起嬰幼兒及兒童嚴(yán)重呼吸道疾病。 （二）生物學(xué)性狀病毒呈球形，較大，直徑為125-250nm。刺突：

16、HN蛋白：具有HA和NA作用F蛋白：具有使細(xì)胞融合及溶解紅細(xì)胞的作用根據(jù)抗原構(gòu)造不同，副流感病毒分為5型。（三）微生物學(xué)檢驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)室診斷可用細(xì)胞培養(yǎng)分離鑒定病毒，或用免疫熒光檢查鼻咽脫落細(xì)胞中的病毒抗原。 四、呼吸道合胞病毒 引起嬰幼兒下呼吸道感染的最常見(jiàn)病毒 侵入呼吸道后在上皮細(xì)胞內(nèi)增殖，病毒不入血 病理免疫造成細(xì)胞損傷 支氣管壞死物與粘液、纖維蛋白粘連在一起，易導(dǎo)致氣道阻塞，可并發(fā)嚴(yán)重的細(xì)支氣管炎和肺炎包膜刺突G與受體結(jié)合、吸附F強(qiáng)烈細(xì)胞融合作用（故名），形成合胞體及胞漿嗜堿性包涵體SARS冠狀病毒第三節(jié) 冠狀病毒科（一）臨床意義2002年11月16日中國(guó)廣東佛山發(fā)現(xiàn)第一起后來(lái)稱(chēng)為SARS

17、的病例2003年2月18日中國(guó)疾病預(yù)防控制中心宣布，廣東嚴(yán)重呼吸道綜合征的病原基本可以確定為衣原體3月15日世界衛(wèi)生組織將此疾改稱(chēng)嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）4月16日世界衛(wèi)生組織在日內(nèi)瓦宣布，病毒已經(jīng)找到，正式命名為SARS病毒。我國(guó)內(nèi)地24個(gè)省區(qū)市先后發(fā)生非典型肺炎疫情，共波及266個(gè)縣和市(區(qū))。截止8月16日10時(shí)，我國(guó)內(nèi)地累計(jì)報(bào)告非典型肺炎臨床診斷病例5327例，治愈出院4959例，死亡349例2004年3月發(fā)生的SARS疫情中，北京和安徽兩地共出現(xiàn)9例SARS確診病例，在短短的幾天內(nèi)有862人被醫(yī)學(xué)隔離。 非典型肺炎癥狀及體征 1.癥狀與體征 發(fā)熱（38）和咳嗽、呼吸加速，氣促，

18、或呼吸窘迫 綜合征，肺部羅音或有肺實(shí)變體征之一以上。 2.實(shí)驗(yàn)室檢查早期血WBC計(jì)數(shù)不升高，或降低。 3.肺部影像學(xué)檢查肺部不同程度的片狀、斑片狀浸潤(rùn)性陰影或呈網(wǎng)狀樣改變 4.抗菌藥物治療無(wú)明顯效果。（二）生物學(xué)特性 大小約80-160nm，RNA，包膜上有間隙較寬的突起，使整個(gè)病毒外形呈日冕狀。S蛋白（spike protein）受體結(jié)合位點(diǎn)、溶細(xì)胞作用和主要抗原位點(diǎn) E蛋白（small membrane protein）與包膜結(jié)合的蛋白 M蛋白 (Membrane protein)負(fù)責(zé)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸、新生病毒出芽釋放與病毒外包膜的形成 標(biāo)本采集與處理 （三）微生物學(xué)檢驗(yàn) 分離培養(yǎng)： Vero或Vero-E6細(xì)胞系分離培養(yǎng)與鑒定檢測(cè)病毒核酸：PCR檢 測(cè) 抗 體：ELISA,間接免疫熒光法IFA,中和試驗(yàn)(NT)第四節(jié) 其他呼吸道病毒一、腺病毒生物學(xué)特性線型雙鏈DNA，不分節(jié)段病毒無(wú)包膜，二十面立體對(duì)稱(chēng)，直徑約7090nm具12個(gè)頂角和纖維刺突致病性咽炎急性呼吸系統(tǒng)疾病濾泡性結(jié)膜炎，流行性角膜結(jié)膜炎咽結(jié)膜熱尿路感染（子宮頸炎