淺談離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)

1、淺談離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)程香孫霞劉英光【摘要】2021年，中國心血管病死亡率居首位，高于腫瘤及其他疾病。腦血管病、冠心病、外周動(dòng)脈疾病等血管性疾病在心血管病中占據(jù)著重要地位。離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)是研究血管舒縮功能的一種實(shí)驗(yàn)方法。通過對血管舒縮功能研究，探討血管疾病的本質(zhì)，從而為心血管疾病的防治提供科學(xué)依據(jù)。本文從離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)簡介、實(shí)驗(yàn)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)步驟及實(shí)驗(yàn)中的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)等方面進(jìn)行闡述，希望對即將開展該實(shí)驗(yàn)的研究人員提供一些幫助?！娟P(guān)鍵詞】離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn);血管功能;收縮;舒張中圖分類號：TH776.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：2095-2457202123-0220-002DOI：10.19694/j ki.i

2、ssn2095-2457.2021.23.104【Abstract】InChina，CardiovascularDiseaseCVDwastheleadingcauseofdeathin2021，morethantumorsoranyotherdiseases.Cerebrovasculardisease，coronaryheartdisease，andperipheralarterialdiseaseoccupyanimportantpositionincardiovasculardisease.Thevascularringexperimentinvitroisanexperimental

3、methodforthestudyofvasomotorcontractionandrelaxation.Throughthestudyofvasomotorfunction，thenatureofvasculardiseasesisexploredtoprovideascientificbasisforthepreventionandtreatmentofcardiovasculardiseases.Thisarticledescribestheintroduction，devices，proceduresandexperienceofthevascularringexperimentinv

4、itro，hopingtoprovidesomehelpsforresearcherstoconducttheexperiment.【Keywords】Thevascularringexperimentinvitro;Vascularfunction;Contraction;Relaxation心血管系統(tǒng)疾病是世界范圍內(nèi)死亡的主要原因，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚【1】。調(diào)查顯示，2021年，中國心血管病死亡率居首位，高于腫瘤及其他疾病，占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上。腦血管病、冠心病、肺血管病及外周動(dòng)脈疾病等血管性疾病在心血管病占據(jù)著重要地位【2】。離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)是研究血管舒縮功能的一種實(shí)驗(yàn)方法，是

5、研究血管生理學(xué)、病理生理學(xué)和藥理學(xué)的重要手段【3】。通過對血管舒縮功能研究，探討血管疾病的本質(zhì)，從而為心血管疾病的防治提供科學(xué)依據(jù)。本文第一作者有幸作為“2021年中西部高等學(xué)校青年骨干教師國內(nèi)訪問學(xué)者，于2021年9月到西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)與病理生理學(xué)系進(jìn)行為期10個(gè)月的訪問學(xué)習(xí)，期間跟隨心血管病理生理學(xué)研究團(tuán)隊(duì)，參與了大鼠、小鼠離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)就該實(shí)驗(yàn)根本內(nèi)容、實(shí)驗(yàn)設(shè)備與器材、實(shí)驗(yàn)步驟及本卷須知和在該實(shí)驗(yàn)中的經(jīng)驗(yàn)等闡述如下。1離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)簡介離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)是研究血管舒縮功能的一種實(shí)驗(yàn)方法。實(shí)驗(yàn)裝置不斷推陳出新，目前使用較廣泛的是DMT620多通道離體微血管張力測定系統(tǒng)丹麥圖1。首先

6、別離血管，去除周圍結(jié)締組織和脂肪組織，切成2-3mm長的血管環(huán)，再用金屬絲或鎢絲穿過血管環(huán)并懸掛于張力浴槽內(nèi)，連接張力換能器和計(jì)算機(jī)，測定并記錄離體血管的舒縮活動(dòng)，常用于研究大鼠腸系膜動(dòng)脈【4】、大鼠腦基底動(dòng)脈【5】、小鼠腸系膜動(dòng)脈【6】、小鼠主動(dòng)脈、髂動(dòng)脈、頸動(dòng)脈、腎動(dòng)脈【7】等微小血管的功能。2離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)設(shè)備、器材離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備、器材包括：1動(dòng)物解剖臺;2手術(shù)解剖顯微鏡;3DMT620多通道離體微血管張力測定系統(tǒng);4氧氣瓶;5微型真空泵;6培養(yǎng)皿;7水浴鍋;8常用動(dòng)物手術(shù)器械;9移液器等。3離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)步驟及操作本卷須知1翻開儀器設(shè)備，檢查儀器狀態(tài)。2在DMT620多通道離體

7、微血管張力測定系統(tǒng)張力浴槽內(nèi)填充5ml預(yù)冷的4Krebs-Henseleit溶液KHS，KHS成分濃度/mM：NaCl115，NaHCO325，KCl4.6，NaH2PO4.2H2O1.2，MgCl2.6H2O1.2，CaCl22.5，Glucose.H2O10，充95%O2+5%CO2后用NaOH調(diào)至pH7.48。注意此時(shí)不可加熱。3處死動(dòng)物，解剖并別離組織，輕輕取出擬研究的血管組織，放置于含預(yù)冷的4KHS的容器中，稍微沖洗血管外表及管腔內(nèi)局部血液。4將血管組織轉(zhuǎn)移至含預(yù)冷的4KHS的專用培養(yǎng)皿中，輕輕撐開血管并別離血管外表的脂肪及結(jié)締組織等，盡量別離干凈。5剪切一段長約2mm的血管環(huán)，建議

8、取中間段的或分支，兩端的不要。6將一根血管環(huán)轉(zhuǎn)移至一個(gè)張力浴槽中。用金屬絲40m或鎢絲25m穿過血管環(huán)固定于張力浴槽內(nèi)。7血管環(huán)固定好后檢查兩根絲的位置，調(diào)至平行狀態(tài)，血管環(huán)處于松弛狀態(tài)，不受力。8將固定有血管環(huán)的張力浴槽放置于主控制器面板上，插上傳感器連接線。9翻開通氣，使氣泡一個(gè)接一個(gè)冒出，翻開加熱，升溫至37。10待溫度上升至37后，拉至初始預(yù)張力。小鼠胸主動(dòng)脈約5mN，大鼠腸系膜動(dòng)脈約3mN。在此根底上，可根據(jù)血管粗細(xì)適當(dāng)調(diào)整。11更換5mL37預(yù)熱通氣的KHS，開始平衡，平衡過程中每隔20min換一次張力浴槽內(nèi)的溶液。平衡總計(jì)60min。在平衡過程中，每隔5min左右旋轉(zhuǎn)螺旋尺調(diào)節(jié)初

9、始值，使張力始終維持在最正確初始值附近即可。12翻開電腦軟件，開始記錄。13調(diào)零Zero。排空浴槽中的KHS。排空后，立即參加5ml60mM的高鉀Krebs-Henseleit溶液刺激血管并添加注釋，刺激到上升至平臺期。60mM的高鉀KHS成分濃度/mM：NaCl63.7，NaHCO315，KCl60，NaH2PO4.2H2O1.2，MgCl2.6H2O1.2，CaCl21.5，Glucose.H2O5.5，充95%O2+5%CO2后用NaOH調(diào)至pH7.4。14使用37預(yù)熱充氣的KHS洗脫至基線。等待10min后再進(jìn)行刺激。15排空浴槽中的KHS。立即參加5ml60mM的高鉀KHS第二次刺激

10、并添加注釋，刺激到上升至平臺期。按上一步驟的方法洗脫血管至基線。16等待15min，添加1M5L1×10-3M至5mLKHS收縮劑去甲腎上腺素或苯腎上腺素，刺激至平臺期，并維持在平臺。17添加乙酰膽堿10M5L1×10-2M至5mLKHS。舒張2min。觀察血管舒張程度，血管能夠舒張至85%以上，說明血管內(nèi)皮功能完好。18如果需要做量效曲線，可以直接加收縮藥，逐漸增加乙酰膽堿或其他舒張藥的濃度，觀察舒張曲線。19用37預(yù)熱充氣的KHS洗脫血管3次，每次15min。20根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，用藥物孵育血管15min或不孵育，添加收縮劑，待收縮至平臺期，濃度累積地參加不同的舒張藥，觀察

11、舒張曲線。每組藥物之間均按上一步驟的方法洗脫血管。21結(jié)束實(shí)驗(yàn)，保存文件。22清洗儀器。4離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)的體會離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)比較耗時(shí)，從別離血管到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，少那么4-5h，多可達(dá)10h以上，非?？简?yàn)實(shí)驗(yàn)人員的耐心。通過幾個(gè)月的實(shí)驗(yàn)操作，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)過程中的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)如下，希望對今后開展此實(shí)驗(yàn)的研究人員提供一些幫助。1在別離血管時(shí)，一定要有耐心，切勿過度牽拉血管，否那么易使血管失去活性。別離血管是一項(xiàng)技術(shù)活，要想得到活性好的血管，一定要多練，可以先別離直徑較粗的胸主動(dòng)脈，再過渡到腸系膜2級或3級血管。血管離體后，不能枯燥，必須放置于盛有KHS的容器內(nèi)。2血管別離后，將血管固定于張力浴槽時(shí)，注意勿損傷血

12、管內(nèi)皮，我們的經(jīng)驗(yàn)是先穿過一根絲，固定到張力浴槽上，再穿第二根絲并固定。在穿第二根絲時(shí)，務(wù)必與第一根絲平行，不能有交叉。固定好后，要使血管處于松弛狀態(tài)，不受力。3血管固定好后，調(diào)至初始預(yù)張力后平衡血管也是非常重要的過程，此過程使血管逐步適應(yīng)離體環(huán)境，為后續(xù)血管功能測定奠定根底，假設(shè)血管未平衡好，在加藥時(shí)，血管會對藥物的反應(yīng)性差，影響實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。因此，在調(diào)初始張力時(shí)，為了使血管逐漸適應(yīng)，我們常常逐步升高張力，如初始張力為3mN，先調(diào)至0.5mN，穩(wěn)定數(shù)分鐘，再增加至1mN，穩(wěn)定數(shù)分鐘，直至到3mN。4加藥時(shí)，合理掌握加藥時(shí)間是極為重要的。1在參加收縮劑后，一定要到達(dá)收縮平臺期后才能加舒張藥，否

13、那么可能出現(xiàn)參加舒張藥后，張力還繼續(xù)升高的情況，無法分析到底是收縮劑還是舒張藥的作用。2不同的血管，加藥時(shí)間、間隔不能一概而論，實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，參加相同濃度的苯腎上腺素，小鼠腸系膜動(dòng)脈到達(dá)收縮平臺期時(shí)間明顯短于小鼠胸主動(dòng)脈，故加藥時(shí)間應(yīng)相應(yīng)縮短。3即使是相同類型的血管，由于不同浴槽內(nèi)血管的反應(yīng)性不同，也應(yīng)認(rèn)真觀察，合理掌握加藥時(shí)間，同為小鼠胸主動(dòng)脈，同時(shí)參加相同濃度的苯腎上腺素后，如第一個(gè)浴槽內(nèi)血管最先到達(dá)收縮平臺期，那么應(yīng)先加舒張藥至此浴槽，以此類推。5有時(shí)，血管張力曲線不穩(wěn)定，要注意分析原因。如第一次加收縮藥時(shí)，血管收縮不理想，可能血管未平衡好，還未較好地適應(yīng)離體環(huán)境，可用37預(yù)熱充氣的K

14、HS洗脫血管后，再平衡一段時(shí)間?？傊鲭x體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)是一個(gè)非常艱辛的過程，不僅要敢吃苦，還要善于開動(dòng)腦筋，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，合理優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)過程中要耐得住性子，合理掌握加藥時(shí)間，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更能客觀反映血管本身的狀態(tài)及功能?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】【1】ZhangL，WangY，LiYetal，HydrogenSulfideH2S-ReleasingCompounds：TherapeuticPotentialinCardiovascularDiseasesJ.Front.Pharmacol.9：1066.doi：10.3389/fphar.2021.01066.【2】胡盛壽，高潤霖，劉力生，等.?中國心血管

15、病報(bào)告2021?概要R，中國循環(huán)雜志2004年3月第34卷第3期總第249期.【3】介紹一種離體血管環(huán)的實(shí)驗(yàn)裝置和方法J.劉沙、蕭明第、薛松、盧成寶，?醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)?，2004年6月，第15卷第3期，199-203.【4】WangXF，CheangWS，YangHXetal，Nuciferinerelaxesratmesentericarteriesthroughendothelium-dependentand-independentmechanismsM，BritishJournalofPharmacology，20211725609-5618.【5】YuWei，WangYan，SongZ

16、heng，ZhaoLi-Mei，LiGui-Rong，DengXiu-Ling.Equolincreasescerebralbloodflowinratsviaactivationoflarge-conductanceCa2+-activatedK+channelsinvascularsmoothmusclecellsM，PharmacologicalResearch， ：//10.1016/j.phrs.2021.03.015.【6】YangGD，WuLY，JiangBetal，H2SasaPhysiologicVasorelaxant：HypertensioninMicewithDeletionofCystathionine-LyaseM.Science.2004October24;3225901：587590.doi：10.1126/science.1162667.【7】OliverBARETELLA，SookjaKCHUNG，AiminXUetal，Endothelialoverexpressionofendothelin-1modulatesaortic，carotid，iliacandrenalart