生化實驗報告模版

1、生物化學(xué)實驗報告姓 名： 郭玥 學(xué) 號： 3120100021 專業(yè)年級： 2012級護理本科 組 別： 第8實驗室生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗教學(xué)中心實驗名稱(Title of Experimetn)血清清蛋白、-球蛋白的分離、提純與鑒定實驗日期(Date of Experiment)2013-12-11實驗地點(Lab No.)第8實驗室合作者(Partner)黎真秀 郭項萍 德吉指導(dǎo)老師(Instructor)宋千成總分(Total Score)96教師簽名(Signature)宋千成批改日期(Date)【實驗報告第一部分（預(yù)習(xí)報告內(nèi)容）：實驗原理、實驗材料（包括實驗樣品、主要試劑、主要儀器

2、與器材）、實驗步驟（包括實驗流程、操作步驟和注意事項）；評分（滿分30分）：XX】實驗?zāi)康模?、掌握鹽析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法2、掌握凝膠層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法3、掌握離子交換層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法4、掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法5、了解柱層析技術(shù)實驗原理：1、蛋白質(zhì)的分離和純化是研究蛋白質(zhì)化學(xué)及其生物學(xué)功能的重要手段。2、 不同蛋白質(zhì)的分子量、溶解度及等電點等都有所不同。利用這些性質(zhì)的差別，可分離純化各種蛋白質(zhì)。3、 鹽析法：鹽析法是在蛋白質(zhì)溶液中，加入無機鹽至一定濃度或達(dá)飽和狀態(tài)，可使蛋白質(zhì)在水中溶解度降低，從而分離出來。蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽后，由于

3、中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，致使蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜減弱乃至消失。中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后由于離子強度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。4、 離子交換層析:離子交換層析是指流動相中的離子和固定相上的離子進(jìn)行可逆的交換，利用化合物的電荷性質(zhì)及電荷量不同進(jìn)行分離。5、 醋酸纖維素薄膜電泳原理：血清中各種蛋白質(zhì)的等電點不同，一般都低于pH7.4。它們在pH8.6的緩沖液中均解離帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。由于血清中各種蛋白質(zhì)分子大小、形狀及所帶的電荷量不同，因而在醋酸纖維素薄膜上電泳的速度也不同。因此可以將它們分離為清蛋白（Albumi

4、n)、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白5條區(qū)帶。實驗材料：人混合血清 葡聚糖凝膠（G-25)層析柱DEAE纖維離子交換層析柱 飽和硫酸銨溶液醋酸銨緩沖溶液 20%磺基水楊酸1%BaCl2溶液 氨基黑染色液漂洗液 pH8.6巴比妥緩沖溶液電泳儀、電泳槽實驗流程：鹽析（粗分離）葡聚糖凝膠層析（脫鹽）DEAE纖維素離子交換層析（純化）醋酸纖維素薄膜電泳（純度鑒定）實驗步驟：（一） 鹽析+凝膠柱層析除鹽：取血清0.8ml，邊搖邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液0.8ml，混勻室溫放置10min，4000r/min離心10min上清液（含清蛋白、少量球蛋白和球蛋白)沉淀（含球蛋白）加水 0.6ml溶解過

5、葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.0×7cm）過葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.0×7cm）用1ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/L pH6.5 NH4AC緩沖液洗脫，流出液量約1ml時開始檢測蛋白質(zhì)用1ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/L pH6.5 NH4AC緩沖液(2ml)洗脫，流出液量約1ml時開始檢測蛋白質(zhì) 磺基水楊酸檢測蛋白質(zhì) 磺基水楊酸檢測蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的峰液12滴收集含有蛋白質(zhì)的峰液12滴繼續(xù)用 2ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液洗滌繼續(xù)用2ml 0.02m

6、ol/L NH4AC緩沖液洗滌BaCl2檢測SO42-陰性 BaCl2檢測SO42-陰性用2-3ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液再生平衡用2-3ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液再生平衡（二） 離子交換層析（純化）：除鹽后收集的球蛋白過DEAE-纖維素層析柱（1.0×6cm）用1ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/L pH6.5 NH4AC緩沖液(3ml)洗脫，流出液量約1ml開始檢測蛋白質(zhì)取濃度最高的1管作純度鑒定（醋酸纖維素薄膜電泳法）磺基水楊酸檢測蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的洗脫液每管10滴，連續(xù)收集3管除鹽后收集的清蛋白

7、過DEAE-纖維素層析柱（1.0×6cm）DEAE-纖維素柱不用再生，可直接用于純化清蛋白用1ml 0.0mol/L NH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,用約mL 0.06mol/L NH4AC緩沖液流洗，除去球蛋白和球蛋白 磺基水楊酸檢測蛋白質(zhì)收集含有清蛋白的洗脫液每管10滴，連續(xù)收集2管DEAE-纖維素柱先用6ml l.5mol/L NaCl - 0.3mol/L NH4AC溶液流洗，再用10ml 0.02mol/L NH4AC緩沖液流洗再生平衡2管均作純度鑒定(醋酸纖維素薄膜電泳法)（三）醋酸纖維素薄膜電泳：1、點樣（如下圖）： - 點樣線 +2cm 點樣區(qū) （粗面）1.5cm 點

8、樣線盡量點得細(xì)窄而均勻,寧少勿多2、電泳：薄膜粗面向下點樣端置陰極端兩端緊貼在濾紙鹽橋上，膜應(yīng)輕輕拉平電壓：110V時間：50min 3、染色和漂洗：電泳完畢后，關(guān)閉電源，將膜取出，直接浸于染色液中5min。 取出膜，盡量瀝凈染色液，移入漂洗液中浸洗脫色（一般更換2次），至背景顏色脫凈為止。 取出膜，用濾紙吸干即可。注意事項：1、所用血清應(yīng)新鮮，無沉淀物及細(xì)菌滋生。2、使用時勿將各時段所應(yīng)用的溶液濃度弄錯。3、上樣時，滴管應(yīng)沿柱上端內(nèi)壁加入樣品，動作應(yīng)輕、慢，勿將柱床沖起。流洗平衡時亦應(yīng)如此。4、洗脫時應(yīng)注意及時收集樣品，切勿使蛋白質(zhì)峰溶液流失，并注意層析柱不要流干，進(jìn)入空氣。5、切勿將檢測蛋

9、白質(zhì)的磺基水楊酸與檢查SO42-的BaCl2混淆，因二者與相應(yīng)物質(zhì)生成的沉淀均為白色。6、葡聚糖凝膠價錢昂貴，要回收再生,避免損耗，嚴(yán)禁倒掉!【實驗報告第二部分（實驗記錄）：主要實驗條件（如材料的來源、質(zhì)量；試劑的規(guī)格、用量、濃度；實驗時間、操作要點中的技巧、失誤等，以便總結(jié)實驗時進(jìn)行核對和作為查找成敗原因的參考依據(jù)）；實驗中觀察到的現(xiàn)象（如加入試劑后溶液顏色的變化）；原始實驗數(shù)據(jù)。評分（滿分20分）：XX】主要實驗條件：1、0.3mol/LpH6.5醋酸銨（NH4AC）緩沖液：稱取NH4AC 23.12g，加蒸餾水800ml溶解，滴入稀氨水或稀醋酸液（注意混合均勻），調(diào)節(jié)pH至6.5后，補加

10、蒸餾水至1000ml。2、0.06mol/LpH6.5 NH4AC緩沖液：取上液用蒸餾水做5倍稀釋。3、0.02mol/LpH6.5 NH4AC緩沖液：取上液用蒸餾水做3倍稀釋。4、1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH4AC溶液：稱取NaCl87.7g溶于0.3mol/LpH6.5 NH4AC溶液中至1000ml。5、飽和硫酸銨溶液：稱取固體(NH4)2SO4850g加入1000ml蒸餾水中，在70-80下攪拌促溶，室溫中放置過夜，瓶底析出白色結(jié)晶，上清液即為飽和硫酸溶液。實驗現(xiàn)象：飽和硫酸銨加入到血清后有沉淀生成，沉淀呈米黃色，上清液呈淡黃色。原始實驗數(shù)據(jù)：將3條經(jīng)染色的醋酸纖

11、維素薄膜并列，使點樣線位于同一水平，以正常血清蛋白圖譜為對照，觀察提純的物質(zhì)屬哪種蛋白。所得的照片如下圖： 血清清蛋白、-球蛋白純度鑒定的電泳圖譜【實驗報告第三部分（結(jié)果與討論）：結(jié)果（定量實驗包括計算）：應(yīng)把所得的實驗結(jié)果（如觀察現(xiàn)象）和數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、歸納、分析、對比，盡量用圖表的形式概括實驗的結(jié)果；討論：不應(yīng)是實驗結(jié)果的重述，而是以結(jié)果為基礎(chǔ)的邏輯推論。結(jié)論：簡單扼要，說明本次實驗所獲得的結(jié)果。（包括思考題）。評分（滿分45分）：XX】結(jié)果：從電泳圖譜中可以看出，清蛋白第一管和清蛋白第二管的蛋白質(zhì)與血清的清蛋白電泳圖譜幾乎一致，可以確定管內(nèi)的蛋白質(zhì)為清蛋白，同理球蛋白管內(nèi)的蛋白質(zhì)為-球蛋白。討論：清蛋白第1、2管均含有少量雜質(zhì)，-球蛋白管中的-球蛋白純度較低，導(dǎo)致最終的電泳圖譜與血清的電泳圖譜有略微偏差。結(jié)論：本次試驗所獲得的結(jié)果基本與預(yù)期試驗結(jié)果相一致。思考題：1.硫酸銨鹽析一步,為什么是0.8ml血清加0.8ml飽和硫酸銨?答：因為清蛋白和球蛋白的鹽析濃度不一樣，使用半飽和硫酸銨溶液可以使球蛋白沉淀而清蛋白不沉淀，0.8ml血清和0.8ml飽和硫酸銨混合可以形成半飽和硫酸銨溶液從而達(dá)到分離的目的。2.為什么實驗中DEAE纖維素柱分離-球蛋白后不用再生,可直接用于純化清蛋白?答：