熒光成像動態(tài)監(jiān)測

1、熒光成像動態(tài)監(jiān)測熒光成像動態(tài)監(jiān)測v 20世紀顯微光學及熒光標記技術(shù)迅速發(fā)展，熒光顯微鏡已泛用于活細胞成像，研究活細胞中動力學過程，包括細胞內(nèi)化學分子鑒定、定量及動態(tài)監(jiān)測。現(xiàn)在單細胞圖像分析已成為化學和生物學科之間新的交叉學科領。熒光的種類 自發(fā)熒光（不加染色）自發(fā)熒光（不加染色）v 有些物質(zhì)不加染色，也能發(fā)出熒光（自發(fā)熒光或原發(fā)熒光）有些物質(zhì)不加染色，也能發(fā)出熒光（自發(fā)熒光或原發(fā)熒光）但在醫(yī)學和生物學領域中，只有很少物質(zhì)具有自發(fā)熒光。但在醫(yī)學和生物學領域中，只有很少物質(zhì)具有自發(fā)熒光。 二次熒光（用化學染色）二次熒光（用化學染色）v 非熒光性的物質(zhì)（蛋白質(zhì)、炭水化合物）用熒光色素染色，非熒光性的

2、物質(zhì)（蛋白質(zhì)、炭水化合物）用熒光色素染色，由熒光色素產(chǎn)生熒光（二次熒光），以便進行觀察。對特由熒光色素產(chǎn)生熒光（二次熒光），以便進行觀察。對特定物體選擇合適的熒光色素，該物體就能和周圍的組織或定物體選擇合適的熒光色素，該物體就能和周圍的組織或細胞區(qū)別出來而可以觀察到。細胞區(qū)別出來而可以觀察到。 活細胞熒光成像的注意事項動態(tài)檢測的靈敏度、速度及細胞的存活力使用不同波長光觀察的細胞圖像以及增強信號強度等細胞的厚薄觀察過程的快慢1.共聚焦熒光顯微鏡成像檢測 激光掃描共聚焦熒光顯微鏡(laser scanning confocal microscopy,LSCM)是一種利用計算機、激光和圖像處理技術(shù)獲

3、得生物樣品三維數(shù)據(jù)、目前最先進的分子細胞生物學的分析儀器。主要用于觀察活細胞結(jié)構(gòu)及特定分子、離子的生物學變化，定量分析，以及實時定量測定等原理 傳統(tǒng)的光學顯微鏡使用的是場光源，標本上每一點的圖像都會受到鄰近點的衍射或散射光的干擾；激光掃描共聚焦顯微鏡采用點光源照射樣本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡搜集，并沿原照射光路回送到由雙色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。焦平面上的點同時聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點被擋在探測針孔之外不能成像，這樣得到的共聚焦圖像是標本的光學切面，避免了

4、非焦平面上雜散光線的干擾，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點，因此能得到整個焦平面上清晰的共聚焦圖像。共聚焦激光顯微鏡分析細胞凋亡過程 近年來,光學顯微鏡技術(shù)中的一個最引人注目的成就是雙光子激發(fā)現(xiàn)象(two2photon excitation ,簡稱TPE) 在共焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scan2ning microscopy ,簡稱CLSM) 中的廣泛應用。 目前,雙光子共焦激光掃描顯微鏡已成為半導體制造和檢測、生物學、醫(yī)學研究和三維高密度存儲及其微細加工的重要工具,為開拓新學科和促進科學研究領域向更高層次發(fā)展起到了非常重要的作用. 利用雙光子共焦激光掃描顯微鏡的特點揭示

5、了許多新現(xiàn)象和新規(guī)律.2.多光子熒光顯微鏡成像監(jiān)測雙光子熒光顯微鏡 由于單光子激發(fā)的線性過程,在整個激發(fā)光路里的樣品都由于激發(fā)而發(fā)出熒光,而對于雙光子激發(fā)而言,只有在焦點處的微小區(qū)域內(nèi)樣品才能吸收足夠的雙光子而發(fā)出熒光. 多光子熒光顯微鏡優(yōu)點與局限 局限v 只能對熒光成像；v 由于紅外和近紅外光源的使用，樣品可能受到熱損傷；v 分辨率略有降低；v 受昂貴的超快激光器限制，目前多光子掃描顯微鏡的成本較高。3、全內(nèi)反射熒光顯微鏡成像監(jiān)測 全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRFM)也稱消逝場熒光顯微鏡(evanescent field fluorescence microscope),提供了一種非常接近表面的

6、成像方法 全內(nèi)反射熒光顯微鏡 是全內(nèi)反射熒光法的直接應用，其具有兩種類型，棱鏡型和物鏡型。棱鏡型成像系統(tǒng)的隱失場是通過入射光經(jīng)棱鏡發(fā)生全反射產(chǎn)生的，而物鏡型的是通過入射光經(jīng)物鏡本身全反射產(chǎn)生。隱失波激發(fā)生物樣品的熒光分子，熒光分子所發(fā)射的熒光經(jīng)過物鏡成像到照相機或CCD上實現(xiàn)對生物樣品的記錄。兩種類型的全內(nèi)反射熒光顯微鏡成像系統(tǒng)，1）為棱鏡型，2）為物鏡型。 優(yōu)勢u獨特的全內(nèi)反射熒光功能u動態(tài)掃描儀可精確定位激光束，并決定消散視野的準確穿透深度。u使用一些特殊的熒光軟件如徠卡 AF7000 熒光軟件可全面控制全內(nèi)反射熒光系統(tǒng)，包括校準與所有顯微鏡功能，確保減少培訓的時間以盡快投入到科學研究中。

7、u完全集成的全內(nèi)反射熒光系統(tǒng)可與徠卡顯微系統(tǒng)有限公司的高級熒光工作站結(jié)合使用，以在有多位用戶的實驗室中，滿足各種成像需要。u高質(zhì)量圖像 全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的消逝波激發(fā)樣全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的消逝波激發(fā)樣品，由于消逝波強度成指數(shù)衰減，使激發(fā)區(qū)域限定在樣品品，由于消逝波強度成指數(shù)衰減，使激發(fā)區(qū)域限定在樣品表面的一薄層范圍內(nèi)，因此具有其它光學成像技術(shù)無法比表面的一薄層范圍內(nèi)，因此具有其它光學成像技術(shù)無法比擬的高信噪比。擬的高信噪比。 當今世界上研究單分子科學最具前途的新型生物光學顯微當今世界上研究單分子科學最具前途的新型生物光學顯微技術(shù)之一技術(shù)之一 可用來實現(xiàn)對單個

8、熒光分子的直接探測?？捎脕韺崿F(xiàn)對單個熒光分子的直接探測。4、熒光成像及電化學聯(lián)合監(jiān)測 在實時動態(tài)監(jiān)測單細胞中，熒光成像及微電極化學監(jiān)測法各有特長，但也各有不足之處。若將兩種方法聯(lián)合監(jiān)測，取長補短，必將取得更深層次的結(jié)果。 倒置熒光顯微鏡是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡，就其光路來分有兩種：一是透射式熒光顯微鏡，激發(fā)光源是通過聚光鏡穿過標本材料來激發(fā)熒光的。二是落射式熒光顯微鏡，這是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡，特點是激發(fā)光從物鏡向下落射到標本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。 微流控芯片 又稱微全分析系統(tǒng)(micro total analytical system, TAS)原型

9、是20世紀90年代初開展的芯片毛細管電泳，是21世紀最為重要的前沿技術(shù)之一 采用微電子工業(yè)和半導體制造業(yè)中的一些精細加工工藝，在硅片、玻片和塑料等表面經(jīng)過必要的化學處理后，加工出微細（微米尺寸）結(jié)構(gòu)，制作成一塊幾平方厘米的芯片，化學或者生物化學的實驗過程可微縮到該芯片上進行，用于生物樣品分離、反應、分析，是一種新型的生物芯片。微流控分析芯片實驗室的結(jié)構(gòu)特點 芯片實驗室由進樣系統(tǒng)、樣品過濾和抽提機械、流體系統(tǒng)、閥系統(tǒng)、電泳等分離系統(tǒng)以及檢測系統(tǒng)等部分組成，大體可分為三個部分：不同功能的微流控芯片、芯片微流體運行控制裝置及信號采集的控制與檢測裝置。細胞細胞培養(yǎng)培養(yǎng)運輸運輸清洗清洗破碎破碎樣品樣品純化純化電泳電泳分離分離突出特色p將細胞的操縱、傳輸、進樣、定位溶胞反應、分離及檢測等均集成在微流控芯片上完成, 采用微泵及微閥控制可實現(xiàn)自動化。p電泳分離時間大大減少典型的毛細管電泳分析單細胞效率為8-10 細胞d/微流控芯片高通量單細胞分析已達到7-12 細胞/min較