雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗沙鼠腎細胞

1、雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗（沙鼠腎細胞）Shuangjia Shenzonghezheng Chuxuere Miehuoyimiao （Shashushen Xibao）Haemorrhagic Fever with Renal Syndrome BivalentVaccine（Gerbil Kidney Cell ）, Inactivated本品系用型和型腎綜合征出血熱（簡稱出血熱）病毒分別接種原代沙鼠腎細胞，經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液，病毒滅活、純化，加入氫氧化鋁佐劑后制成，用于預(yù)防型和型腎綜合征出血熱。1 基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原材料及輔料、水、器具、動物等應(yīng)符合 “凡例”的有關(guān)要求。2

2、制造2.1 生產(chǎn)用細胞生產(chǎn)用細胞為原代沙鼠腎細胞。 細胞管理及檢定應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)和檢定用動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”規(guī)定。.1細胞制備選用1020日齡的清潔級沙鼠， 無菌取腎， 剪碎，經(jīng)胰蛋白酶消化分散細胞，加入適宜的培養(yǎng)液，接種培養(yǎng)瓶， 置37培養(yǎng)，形成均勻單層細胞。來源于同一批沙鼠、于同一容器內(nèi)消化制備的沙鼠腎細胞為一個細胞消化批，源自同一批沙鼠、于同一天制備的多個細胞消化批為一個細胞批。22 毒種 名稱及來源生產(chǎn)用毒株為型出血熱毒株Z10株和型出血熱毒株Z37株， 或經(jīng)批準的其他適應(yīng)沙鼠腎細胞的I型和II型出血熱毒株。 種子批的建立應(yīng)符合 “生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”規(guī)定。

3、型和II型出血熱病毒分別接種乳鼠腦制備原始種子批和主種子批， 主種子批毒種接種原代沙鼠腎細胞制備工作種子批。型出血熱毒種Z10株原始種子批應(yīng)不超過第12代； 主種子批應(yīng)不超過第13代； 工作種子批應(yīng)不超過第14代；II型出血熱毒種Z37株原始種子批應(yīng)不超過第10代， 主種子批應(yīng)不超過第11代；工作種子批應(yīng)不超過第12代 。 種子批毒種的檢定主種子批應(yīng)進行如下全面檢定，工作種子批應(yīng)至少進行.1項檢定。.1鑒別試驗各將各型毒種10倍系列稀釋，每個稀釋度分別與已知的相應(yīng)型別的出血熱病毒血清參考品等量混合，同時以正常兔血清做空白對照， 置37水浴中和90分鐘，接種于單層Vero-E6細胞， 于34.5

4、±1培養(yǎng)， 觀察10-14天。以免疫熒光法測定， 中和指數(shù)應(yīng)大于1000。 同時設(shè)病毒陽性對照、細胞陰性對照。.2病毒滴定將各型毒種10倍系列稀釋，取適宜稀釋度接種Vero-E6細胞，于34.5±1培養(yǎng)10-12天，以免疫熒光法測定，病毒滴度應(yīng)不低于6.0LgCCID50/ml。.3無菌檢查依法檢查（附錄XII A）, 應(yīng)符合規(guī)定。.4支原體檢查依法檢查（附錄XII B）, 應(yīng)符合規(guī)定。.5病毒外源因子檢查依法檢查（附錄XII C）, 應(yīng)符合規(guī)定。.6免疫原性檢查取主種子批毒種制備雙價原疫苗，接種體重為2kg左右的白色家兔4只（家兔血清出血熱病毒抗體檢測應(yīng)為陰性），每只后腿

5、肌內(nèi)注射1.0ml，14天后以同法再注射1.0ml。第1次免疫后4周采血分離血清，用蝕斑減少中和試驗測中和抗體，中和用病毒為出血熱病毒76-118株和UR株；同時用參考血清作對照（應(yīng)符合參考血清效價的標示值），每只家兔的I型和II型出血熱病毒中和抗體滴度均應(yīng)不低于1：10。 毒種保存凍干毒種保存于-20以下，液體種子批毒種應(yīng)于-60以下保存。23 單價原液細胞制備同.1 項。培養(yǎng)液培養(yǎng)液為加入適量滅能新生牛血清和MEM液或其他適宜培養(yǎng)液。新生牛血清的質(zhì)量應(yīng)符合要求（附錄XIII D）。對照細胞外源因子檢查依法檢查（附錄 XII C）,應(yīng)符合規(guī)定。病毒接種和培養(yǎng)當(dāng)細胞培養(yǎng)成致密單層后， 按0.2

6、MOI分別接種出血熱病毒I型和II型毒種(每個型別的同一工作種子批毒種應(yīng)按同一MOI接種)，置適宜的溫度下培養(yǎng)一定時間后， 棄去培養(yǎng)液， 用PBS沖洗去除牛血清， 加入適量的維持液， 置33-35繼續(xù)培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r間。病毒收獲培養(yǎng)適宜天數(shù)，收獲病毒液。根據(jù)細胞生長情況，可換以維持液進行多次病毒收獲。同一細胞批的同一次病毒收獲液經(jīng)檢定合格后可合并為單次病毒收獲液。2.3.6 單次病毒收獲液檢定按3.1項進行。2.3.7 單次病毒收獲液保存于28保存不超過30天。2.3.8病毒滅活單次病毒收獲液中按1：4000的比例加入-丙內(nèi)酯（應(yīng)在規(guī)定的蛋白質(zhì)含量范圍內(nèi)進行病毒滅活），置28滅活適宜的時間后， 于

7、適宜的溫度放置適宜的時間，以確保-丙內(nèi)酯完全水解。病毒滅活到期后， 每個病毒滅活容器應(yīng)立即取樣， 分別進行病毒滅活驗證試驗。2.3.9合并、離心、超濾濃縮同一細胞批的多次單次病毒收獲液經(jīng)檢定合格后可合并為單價病毒收獲同一細胞批的多次單次病毒收獲液經(jīng)檢定合格后可合并為單價病毒收獲液， 經(jīng)離心去除細胞碎片后，再進行適當(dāng)倍數(shù)的超濾濃縮至規(guī)定的蛋白質(zhì)含量范圍。0純化采用柱色譜法或其他適宜的方法將濃縮后的單價病毒收獲液進行純化。1 除菌過濾純化后的單價病毒收獲液經(jīng)除菌過濾后，即為單價病毒原液。2 單價原液檢定按3.2項進行。3 單價原液保存于28保存不超過30天。2.4 半成品制備配制將型和型出血熱病毒

8、原液分別按抗原量為1：128稀釋后等量混合，加入適宜穩(wěn)定劑以及適量的硫柳汞作為防腐劑， 并加入終濃度為0.5mg/ml氫氧化鋁佐劑，即為半成品。 半成品檢定按3.3項進行。2.5 成品分批應(yīng)符合 “生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。 分裝應(yīng)符合 “生物制品分裝和凍干規(guī)程”規(guī)定。 規(guī)格每瓶為1.0ml。每1次人用劑量為1.0ml。 包裝應(yīng)符合 “生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。3 檢定3.1 單次病毒收獲液檢定 無菌檢查依法檢查（附錄XII A）,應(yīng)符合規(guī)定。支原體檢查依法檢查（附錄XII B）,應(yīng)符合規(guī)定。 病毒滴定按.2方法進行病毒滴定。各型單次病毒收獲液的病毒滴度應(yīng)不低于6.5 Lg CCID50 /ml。

9、病毒滅活驗證試驗按滅活后的單次病毒收獲液總量的0.1%抽取供試品，透析后接種Vero-E6細胞， 連續(xù)盲傳3代，每10-14天為1代，每代以免疫熒光法檢查病毒抗原，結(jié)果均應(yīng)為陰性?？乖坎捎妹嘎?lián)免疫法，抗原量應(yīng)不低于1：64。32 單價病毒原液檢定 無菌檢查依法檢查（附錄XII A）,應(yīng)符合規(guī)定?？乖坎捎妹嘎?lián)免疫法，抗原量應(yīng)不低于1：512。 蛋白質(zhì)含量應(yīng)不高于80g/ml， （附錄VI B第二法）。 牛血清白蛋白殘留量應(yīng)不高于50ng/ml（附錄VIII F）。33 半成品檢定無菌檢查依法檢查（附錄XII A）,應(yīng)符合規(guī)定。3.4 成品檢定 鑒別試驗按.6項進行，應(yīng)符合規(guī)定。效價測定不合

10、格時，鑒別試驗不成立。 外觀應(yīng)為微乳白色混懸液體，久置形成可搖散的沉淀，無異物。 裝量按附錄I A裝量項進行， 應(yīng)不低于標示量。 化學(xué)檢定.1 pH值應(yīng)為7.28.0（附錄V A）。.2 硫柳汞含量應(yīng)不高于70g/ml（附錄VII B ） 。.3 氫氧化鋁含量應(yīng)不高于0.70mg/ml（附錄VII F） 。效價測定按.6項進行。免疫4只家兔， 每只家兔對I型和II型出血熱病毒的中和抗體滴度均應(yīng)不低于1：10。 熱穩(wěn)定性試驗疫苗出廠前應(yīng)進行熱穩(wěn)定性試驗。于37放置7天，按.6項進行效價測定，如合格，視為效價測定合格。 無菌檢查依法檢查（附錄XII A）,應(yīng)符合規(guī)定。 異常毒性檢查依法檢查（附錄XII F）,應(yīng)符合規(guī)定。細菌內(nèi)毒素檢查應(yīng)小