細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)備和操作技術(shù)

1、會(huì)計(jì)學(xué)1細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)備和操作技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)備和操作技術(shù)第一部分實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì) 作用 植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)所需器具的洗滌、干燥和保存；培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌；化學(xué)試劑的配制；重蒸餾水的生產(chǎn)等。 設(shè)計(jì)要求 面積20m2左右。通風(fēng)透光，地面防滑，墻面防潮。準(zhǔn)備室 實(shí)驗(yàn)臺(tái)架 大、小水槽 烘箱 冰箱 天平系列 pH計(jì) 高壓消毒鍋 各種玻璃器皿 藥品柜 （磁力）攪拌器 電爐 蒸餾水器 設(shè)設(shè) 備備萬分之一萬分之一百分之一百分之一微微量量移移液液器器蒸蒸餾餾水水器器接種室接種室 也叫無菌操作室無菌操作室無菌操作室并非無菌，但應(yīng)該保持清潔無菌操作室并非無菌，但應(yīng)該保持清潔 作用作用 供外植體的接種，

2、培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移和原生外植體的接種，培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移和原生質(zhì)體的游離培養(yǎng)操作之用。質(zhì)體的游離培養(yǎng)操作之用。 設(shè)計(jì)要求 墻壁光滑平整，地面平坦無縫，除出入口和通氣口外，應(yīng)當(dāng)密閉，空氣不能對(duì)流，或者空氣經(jīng)凈化后進(jìn)入室內(nèi)。 無菌室旁邊應(yīng)設(shè)有緩沖間，緩沖間內(nèi)應(yīng)有紫外燈，隨時(shí)可進(jìn)行滅菌。l無菌室內(nèi)的日常滅菌：無菌室內(nèi)的日常滅菌：定期用甲醛和高錳定期用甲醛和高錳酸鉀混合后熏蒸，產(chǎn)生大量蒸汽，殺滅微酸鉀混合后熏蒸，產(chǎn)生大量蒸汽，殺滅微生物。生物。l使用前處理：使用前處理：用新潔爾滅用新潔爾滅（1 1：5050）擦凈，擦凈，然后用然后用紫外燈紫外燈照射滅菌至少照射滅菌至少2020分鐘，操作分鐘，操作前用前用70%70

3、%酒精噴霧。酒精噴霧。思考：紫外燈如何殺菌？操作中要注意什么？ 設(shè)設(shè) 備備 紫外光燈紫外光燈 空調(diào)空調(diào) 放物架（或醫(yī)用小平車：推送、放置培放物架（或醫(yī)用小平車：推送、放置培養(yǎng)基用；）養(yǎng)基用；）無菌操作用的器具：酒精燈、無菌操作用的器具：酒精燈、70%酒精消酒精消毒棉、解剖刀、弓背鑷子、解剖針、剪刀毒棉、解剖刀、弓背鑷子、解剖針、剪刀等。等。 離體組織和試管苗生長發(fā)育的場(chǎng)所，應(yīng)為培養(yǎng)物創(chuàng)造適宜的溫、光、氣等條件。 設(shè)計(jì)要求 培養(yǎng)室內(nèi)要求內(nèi)壁保溫、光滑、室頂高2.6m左右，易于控制溫、濕度，窗上要求裝雙層密封玻璃窗，室內(nèi)有足夠電源。 作用作用 設(shè) 備 空調(diào)機(jī)：冷暖型空調(diào)機(jī)：冷暖型 加熱器加熱器 定

4、時(shí)裝置：控制光照時(shí)間定時(shí)裝置：控制光照時(shí)間 培養(yǎng)架：放置培養(yǎng)瓶培養(yǎng)架：放置培養(yǎng)瓶 搖床和轉(zhuǎn)床：懸浮培養(yǎng)搖床和轉(zhuǎn)床：懸浮培養(yǎng) 各種光質(zhì)燈管：光照培養(yǎng)各種光質(zhì)燈管：光照培養(yǎng) 溫度計(jì)：控制溫度溫度計(jì)：控制溫度 遮光簾：供暗培養(yǎng)之用遮光簾：供暗培養(yǎng)之用細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室 主要設(shè)備主要設(shè)備 各種顯微鏡，顯微照相設(shè)備，切片、制片儀各種顯微鏡，顯微照相設(shè)備，切片、制片儀器設(shè)備，染色用具，暗房設(shè)備等器設(shè)備，染色用具，暗房設(shè)備等。 作作 用用 植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)過程中，需隨時(shí)觀察記錄植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)過程中，需隨時(shí)觀察記錄其細(xì)胞學(xué)和形態(tài)解剖學(xué)的變化，故要設(shè)置細(xì)胞顯微其細(xì)胞學(xué)和形態(tài)解剖學(xué)的變化，故要設(shè)置細(xì)胞顯微觀察室。

5、觀察室。器皿洗滌器皿洗滌（包括玻璃、塑料、搪瓷、（包括玻璃、塑料、搪瓷、 不銹鋼器皿）不銹鋼器皿）培養(yǎng)材料洗滌培養(yǎng)材料洗滌（一）（一）器皿器皿洗滌洗滌根據(jù)洗滌對(duì)象的具體情況可分為以下三根據(jù)洗滌對(duì)象的具體情況可分為以下三種：種：特殊洗滌特殊洗滌微生物大量污染的洗滌微生物大量污染的洗滌常規(guī)洗滌常規(guī)洗滌 常規(guī)洗滌常規(guī)洗滌 自來水洗去油漬、霉菌等臟物；自來水洗去油漬、霉菌等臟物； 溫肥皂水中浸泡一定時(shí)間后用刷子刷凈；溫肥皂水中浸泡一定時(shí)間后用刷子刷凈；自來水沖洗干凈，至瓶壁不掛水珠為止；自來水沖洗干凈，至瓶壁不掛水珠為止； 蒸餾水淋洗內(nèi)外壁蒸餾水淋洗內(nèi)外壁 將玻璃器皿倒置：晾干或烘干（將玻璃器皿倒置：

6、晾干或烘干（5075） 放入除塵柜中備用放入除塵柜中備用 微生物大量污染的洗滌 微生物污染器皿加壓滅菌后再洗滌特殊洗滌特殊洗滌（如（如沾有蛋白質(zhì)類物質(zhì)或其它有機(jī)物時(shí)) 經(jīng)過常規(guī)洗滌未過蒸餾水的器具，浸泡入洗液（鉻酸洗滌液是用重鉻酸鉀(K2Cr2O7)與硫酸(H2SO4)配制而成）中數(shù)分至數(shù)小時(shí)； 回收洗液，器具先用自來水洗凈，蒸餾水淋洗，烘干（75）（二）、試驗(yàn)材料的清洗 清洗目的：來自自然界的試驗(yàn)材料，包括來自土壤中的幼莖、磷莖，滋生著各種微生物，尤其是細(xì)菌的芽孢和真菌的孢子，一旦與培養(yǎng)基接觸，就會(huì)很快的繁殖起來，造成培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料的污染。 清洗方法：先用自來水沖洗5分鐘，然后用中性洗滌劑

7、清洗，注意勿損傷試驗(yàn)材料。再用自來水流水沖洗半小時(shí)，用于下一步的藥劑滅菌。（一）關(guān)于有菌和無菌的概念 有菌的范疇：凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的，如植物的表面、超凈工作臺(tái)的臺(tái)面，未處理的工具和手等。 高壓高溫處理（工具、器皿、培養(yǎng)基等） 物理或化學(xué)處理； 火烤后的物體； 健康的動(dòng)植物不與內(nèi)外部表面接觸的組織 內(nèi)部可能是無菌的（有時(shí)也有內(nèi)生菌，但 不會(huì)影響培養(yǎng)，也不會(huì)污染）無菌的范疇：（二）滅菌、消毒技術(shù)作用和意義 植物組培中，凡用于培養(yǎng)和無菌操作的房間、器具、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基，培養(yǎng)材料和操作者的衣物和手都應(yīng)隨時(shí)進(jìn)行滅菌，以確保不受雜菌污染，否則，由于雜菌的生長繁殖速度一般都比培養(yǎng)的

8、組織快得多，最終將把組織全部殺死，這些污染微生物還可能排泄對(duì)植物組織有毒的代謝廢物，因此在培養(yǎng)容器內(nèi)部保持一個(gè)完全無菌的環(huán)境是絕對(duì)必須的。 消毒、消毒、滅菌的對(duì)象：滅菌的對(duì)象： 接種室 材料（外植體）： 完全殺死材料表面的微生物過程： 洗潔精酒精氯化汞等 器皿用具消毒（滅菌） 培養(yǎng)基培養(yǎng)基（四）、過濾除菌 培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如高溫分解（如某些激素某些激素GA3、玉米素等）、玉米素等），就需要過濾滅菌或者兩者結(jié)合。另外酶等也需要過濾滅菌； 滅菌方法：將激素或酶配成一定濃度，用注射器過慮，0.20.25微米。配制培養(yǎng)基時(shí)，先將培養(yǎng)基高壓滅菌，待溫度

9、降至50左右時(shí)，加入適量的已過慮除菌的激素等，然后分裝。1、外植體的選擇 l選擇優(yōu)良的基因型：蔬菜等作物、花卉等觀賞植 物等的脫毒快繁選優(yōu)良種。 l取材：從生長旺盛、健壯、無病蟲害的植株上取 材。母株代謝旺盛期取的外植體再生能力強(qiáng)， 試驗(yàn)容易成功。 l外植體大小選擇：如利用莖尖培養(yǎng)，脫毒快繁， 莖尖大小對(duì)脫毒效果非常明顯。再如幼胚培養(yǎng)， 胚齡也非常重要。 l選擇外植體的時(shí)期2、外植體的消毒： 取材 將老的組織去掉 自來水沖洗 洗衣粉水洗（簡(jiǎn)單殺菌） 自來水沖洗 70酒精處理 消毒劑處理 滅菌蒸餾水沖洗35遍。 消毒時(shí)間，因材料老嫩程度不同有所不同。一般，較老的材料相對(duì)殺菌時(shí)間較長，反之，較短。

10、一般殺菌，酒精10秒，升汞512分鐘。外植體除菌注意事項(xiàng)：消毒劑 使用濃度() 消毒時(shí)間(分) 效果 殘液去除難易次氯酸鈣 10 530 好 易次氯酸鈉 25 530 好 易新潔爾滅 1020 530 好 易氯化汞 0.11 210 最好 最難過氧化氫 1012 515 較好 最易抗菌素 450mg/L 3060 較好 較難幾種常用消毒劑的效果比較升汞為劇毒藥品，一則使用時(shí)注意別濺到皮膚上；二則使用后要進(jìn)行處理，不能直接倒入下水道。升汞處理方法升汞處理方法：升汞升汞Na2S絮狀沉淀（至絮狀沉淀不再產(chǎn)生為止）FeSO4（中和過（中和過多的多的Na2S ）1所有的消毒、接種等無菌操作技術(shù)均需在無菌

11、室的超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。 1、超凈工作臺(tái)： 內(nèi)設(shè)紫外燈、吹風(fēng)裝置、過濾裝置等，每次實(shí)驗(yàn)前要用紫外燈滅菌20分鐘以上，然后噴酒精滅菌，工作過程中注意一直開著吹風(fēng)機(jī)，并且一定要關(guān)掉紫外燈，過濾網(wǎng)應(yīng)經(jīng)常清洗。 2、無菌操作用的器具：刀、鑷子、剪刀、酒精燈等事先已滅菌，使用中避免交叉污染；3、操作人員在操作之前洗手、換工作服、雙手消毒再操作。三、 培養(yǎng)基及其配制培養(yǎng)基的基本成分培養(yǎng)基的基本成分Fe、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、B1 1 無機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)無機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)、大量元素：大量元素：C C、H H、O ON N、P P、K K、CaCa、MgMg、S S、(Na)(Na)、微量元素：微量元素：濃度：濃度

12、：2%-3%2%-3%2 2 有機(jī)物質(zhì)有機(jī)物質(zhì)糖：糖：作用：作用：維持培養(yǎng)基合適的維持培養(yǎng)基合適的滲透壓滲透壓為細(xì)胞提供合成新物質(zhì)的為細(xì)胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架碳骨架為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物和能量為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物和能量種類：蔗糖、葡萄糖種類：蔗糖、葡萄糖 麥芽糖、果糖等麥芽糖、果糖等 多糖：可溶性淀粉多糖：可溶性淀粉維生素： 硫胺素(VB1)、煙酸（VB3又稱VBPP ） 、泛酸(VB5)、吡哆醇(VB6)、酸銨、鈷胺素(VB12)、葉酸(VM又稱VB11)、抗壞血酸(VC)等等.作用：作用：利于細(xì)胞代謝和器官分化。利于細(xì)胞代謝和器官分化。 B1是是植物組培必須加入的維生素，其用量在植

13、物組培必須加入的維生素，其用量在0.1-30 mg/L之間，當(dāng)組培中細(xì)胞分裂素之間，當(dāng)組培中細(xì)胞分裂素特別少時(shí)，特別少時(shí)，B1更為需要；煙酸和更為需要；煙酸和B6可促可促進(jìn)細(xì)胞生長進(jìn)細(xì)胞生長 瓊脂瓊脂: :是從海藻中提取的一種高分子碳是從海藻中提取的一種高分子碳 水化合物，其主要作用是使培養(yǎng)基在常溫水化合物，其主要作用是使培養(yǎng)基在常溫下凝固，但不參與代謝。下凝固，但不參與代謝。 活性炭活性炭: :主要目的是利用其主要目的是利用其吸附能力吸附能力，減少一些有害物質(zhì)的影響，如可以防止酚減少一些有害物質(zhì)的影響，如可以防止酚類物質(zhì)污染而引起組織褐化死亡。類物質(zhì)污染而引起組織褐化死亡。 3 3、附加物、

14、附加物這類物質(zhì)為這類物質(zhì)為非植物細(xì)胞生長所必須非植物細(xì)胞生長所必須，但對(duì)細(xì)胞，但對(duì)細(xì)胞生長有利生長有利,主要包括主要包括瓊脂和活性炭。瓊脂和活性炭。 作用：提供一些必要的微量營養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長激素等。 這類物質(zhì)常指天然提取物 ： 麥芽提取物、 椰乳、 鮮果汁、 酵母提取物4 4、 其它有益有機(jī)添加物或未知復(fù)合成分其它有益有機(jī)添加物或未知復(fù)合成分5、pH值： 即酸堿度，培養(yǎng)的植物材料大多數(shù)要求弱酸性的環(huán)境，一般將培養(yǎng)基調(diào)整至pH5.65.8。常用0.1mol/l氫氧化鈉或鹽酸來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH。注意： 第一、經(jīng)高溫高壓滅菌后，培養(yǎng)基的pH會(huì)下降0.2-0.8,故調(diào)整后的pH應(yīng)該高于目標(biāo)

15、pH 0.5個(gè)單位； 第二、 pH的大小會(huì)直接影響到瓊脂的凝固能力，一般pH 大于6.0時(shí)，培養(yǎng)基就會(huì)變硬，低于5.0時(shí)瓊脂就不能很好地凝固。1、生長素2、細(xì)胞分裂素3、赤霉素4、脫落酸 生長素是指能引起完整組織中的細(xì)胞擴(kuò)展的化合物。 在自然界中，即內(nèi)生生長素影響莖和莖節(jié)的伸長、向性、頂端優(yōu)勢(shì)、葉片脫落和生根等現(xiàn)象 在組織培養(yǎng)中的主要作用是：，促進(jìn)細(xì)胞脫分化，促進(jìn)細(xì)胞的伸長，促進(jìn)生根。 組織培養(yǎng)中常用的生長素有： 二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（2，4D） ； 萘乙酸（萘乙酸（NAA） 吲哚乙酸（吲哚乙酸（ IAA ） ； 吲哚吲哚3丁酸（丁酸（IBA） 萘氧乙酸（萘氧乙酸（NOA） ； 對(duì)氯苯氧

16、乙酸（對(duì)氯苯氧乙酸（P-CPA） 三氯苯氧乙酸（三氯苯氧乙酸（2，4，5 T）；）； 生根粉（生根粉（ABT） NAA 、IAA、 IBA易引起生根，易引起生根， 2，4D 、2，4，5 T有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長。有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長。 （二）、常見培養(yǎng)基中植物激素配方類型激 素 配 方 再生方式及用途1.無植物激素誘導(dǎo)生根、無性胚、愈傷組織形成2.單加生長素誘導(dǎo)生根、愈傷組織、無性胚、不定芽3.單加細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)不定芽、側(cè)芽增殖、愈傷組織形成4.高生長素低細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)芽、原球莖增殖、愈傷組織形成5.低生長素高細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)叢芽、愈傷組織形成6.低生長素低細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)不定芽、側(cè)芽

17、增殖7.等量生長素與細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)側(cè)芽增殖8.加生長仰制劑（多效唑、矮壯素等）壯苗、延緩生長、利于試管苗保存9.加GA3打破種子、芽休眠，促進(jìn)伸長生長名稱 分子量 溶解性質(zhì) 主要作用吲哚乙酸（IAA）175.19易溶于熱水、乙醇、乙醚、丙酮促進(jìn)細(xì)胞的延伸生長和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的松馳，也可用于誘導(dǎo)生根 吲哚丁酸 (IBA)203.24溶于醇、丙酮、醚、稀堿、稀酸液為生根刺激劑 a-萘乙酸 (NAA)186.20易溶于熱水、丙酮、醚、乙酸、稀堿液促進(jìn)細(xì)胞生長，刺激生根2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)221.04易溶于醇、丙酮、乙醇、稀堿液促進(jìn)愈傷組織形成 赤霉酸(GA3) 346.38易溶于醇、乙酸乙

18、酯、碳酸氫鈉和醋酸鈉的水溶液，其鈉促進(jìn)莖、葉伸長生長，打破休眠（三）、常見生長調(diào)節(jié)劑及主要性能一覽表（四）、常見生長調(diào)節(jié)劑的微摩爾/升濃度與毫克/升的轉(zhuǎn)換微摩爾/升毫克/升IAAIBANAA2,4-DKTBA2iPZTTDZGA310.1750.20320.18620.22100.21520.22530.20270.21900.22020.346420.35040.40640.37240.44210.43040.45050.40540.43800.44040.692730.52550.60940.55860.66310.64560.67580.60810.65700.66061.039140.

19、70070.81280.74480.88420.86080.90100.81080.87600.88081.385550.87591.01600.93101.10521.07611.12631.01351.09501.10101.731961.05111.21921.11721.32621.29131.35161.21621.31401.32122.078271.22631.42241.30341.54731.50651.57681.41891.53301.54142.424681.40141.62561.48961.76831.72171.80211.62161.75201.76162.77

20、1091.57661.82881.67581.98941.93692.02731.82431.97101.98183.1173三、常用培養(yǎng)基的種類、配方及其特點(diǎn)（一）、培養(yǎng)基的種類 1、培養(yǎng)基，根據(jù)其態(tài)相不同分為固體培養(yǎng)基與液體固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基是指加凝固劑的培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基是指不加凝固劑的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基加入一定量的凝固劑，加熱溶解后，分別裝入常用的培養(yǎng)基中冷卻后即得到固體培養(yǎng)基。 2、根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程，培養(yǎng)基分為初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基基和繼代培養(yǎng)基。初代培養(yǎng)基是指用來第一次接種外植體的培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)基是指用來接種繼初代培養(yǎng)基之后的培養(yǎng)物的培養(yǎng)物。 3、根

21、據(jù)其作用不同，培養(yǎng)基分為誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。 4、根據(jù)其營養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基（就是通常稱呼的培養(yǎng)基）主要有MS、White、 N6、B5 、改良MS、Heller、Nitsh、SH、 Miller等。完全培養(yǎng)基就是基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗(yàn)的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)等。（二）幾種常見培養(yǎng)基： MS、N6、B5、LS、RM-1964、H、T、B5、DBM、米勒、改良懷特、尼特、努森C等。 MS培養(yǎng)基是目前應(yīng)用最多最普遍的培養(yǎng)基。無機(jī)鹽的濃度較高，能保證組織培生長所需的礦物質(zhì)營養(yǎng)。并且因?yàn)殡x子濃度高，在配制、

22、貯存、消毒過程中，即使有些成分略有出入，也不致影響培養(yǎng)基中的離子平衡四、培養(yǎng)基的配制 （一）、貯備液（母液）的配制為什么要配制母液？ 1）、方便 2）、準(zhǔn)確（有些成分量太小） 3）、母液要分類配， 否則有些成分混合一起會(huì)產(chǎn)生沉淀 以MS培養(yǎng)基為例： 表11MS培養(yǎng)基母液的配制成分培養(yǎng)基配方（mg）每升母液的用量（mg）母液擴(kuò)大倍數(shù)每升培養(yǎng)基用量（ml）大量元素（母 液）KNO319001900010100NH4NO3165016500MgSO4.7H2O3703700KH2PO41701700CaCl2.2H2O4404400微量元素（母液 ）MnSO4.4H2O22.3223010010Zn

23、SO4.7H2O8.6860H3BO36.2620KI0.8383Na2MoO4.2H2O0.2525CuSO4.5H2O0.0252.5CoCl2.6H200.0252.5鐵鹽母液 FeSO4.7H2O27.85278510010Na2EDTA.2H2O37.25 3725 有機(jī)成分（母液 ）甘氨酸220010010鹽酸硫胺素0.440鹽酸吡哆素0.550煙酸0.550肌醇10010000貯備液（大量元素） 10倍貯備液（微量元素微量元素） 1001000倍貯備液 （鐵鹽鐵鹽） 1001000倍貯備液 （有機(jī)成分） 100倍母液、按表稱量藥品溶解定容冰箱冷藏母液，F(xiàn)eSO4.7H2O和Na2.EDTA稱量后，分別溶于水中，加熱，然后混合一起；或者混合一起后加熱，顏色黃色變深，生成Fe.EDTA ,冷卻后，冰箱冷藏。（二）、培養(yǎng)基的配制1、向燒杯加入適量的水，按量加入4種貯備液（母液）2、按所需濃度加激素，或其他成分，如AgNO