狂犬病的試驗室檢測與診斷技術

1、狂犬病的實驗室檢測與診斷技術 1. 臨床診斷與實驗室診斷 實驗室手段對狂犬病的確診非常必要。 要求狂犬病病例的統(tǒng)計上報資料要注明診斷的依據(jù)（是否包括實驗室診斷？）。目前國際上公認狂犬病的死亡率是100%，原則上不承認有狂犬病康復的可能，即狂犬病的發(fā)病率應與死亡率相等。沒有合格實驗室給出的肯定診斷的康復病例應從狂犬病病例的統(tǒng)計數(shù)字中剔除。 “狂犬病患者必死無疑，不死不算狂犬病” ，要挑戰(zhàn)這個命題，必須提供確切、完整的病史和權威的實驗室診斷資料。2. 人狂犬病的生存期內診斷 生存期內的診斷技術的選擇主要隨著病程的不同而異。 在病后最初幾天，檢測抗原一般是敏感的。 腦脊液及血清中的病毒中和抗體常常趨

2、向于在病后710天出現(xiàn)。 檢測抗原可用熒光抗體（FA）法檢查狂犬病患者角膜印片或皮膚活組織，但是，F(xiàn)A陽性標本在發(fā)病的后期更常見。皮膚活組織檢查常常從頸背部取含有末稍神經(jīng)的帶有毛囊的標本。 角膜印片(切勿劃痕)取自伴有腦炎的患者，用顯微鏡的載波片輕輕觸及角膜的中心部位。 角膜印片及皮膚活組織標本的質量很重要，采取后應立即冷凍，直至檢測。不過，用FA技術做生存期內的診斷，其敏感性是有限的。 人狂犬病的生存期內診斷 已證實患者及自然感染和實驗感染動物的角膜印片中存在狂犬病抗原。但是，角膜印片檢出率較低，陽性結果可肯定是狂犬病，而陰性結果并不能排除是狂犬病的可能。 雖然在臨床癥狀開始時，在皮膚活組織

3、中可能檢出狂犬病抗原，但早期癥狀時僅有25-50%的患者為陽性，隨著病情的進展陽性率也增加。頸背部皮膚活組織檢查只有一些患者呈陽性結果，特別是在臨床疾病的早期。 用FA檢查皮膚活組織的靈敏度一般高于檢查角膜印片。 3. 動物和人狂犬病的死后診斷 抗原檢測 病毒分離 病毒鑒定等。 為了確保實驗室結果的可信性，必需滿足若干條件： 1. 標本質量要好； 2. 標本送達實驗室的條件要好（符合GLP標準， 獲得一定級別的資格認證）； 3. 獲得結果的等待時間要短； 4. 結果的傳遞要迅速。二狂犬病診斷實驗室的安全措施 1. 危險性 在一般的實驗室條件，技術人員暴露于以下傳染的危險： 野生狂犬病毒(即街毒

4、)，當實驗室對接收到的動物標本進行尸體解剖時或對標本進行加工時(懸液制備，離心)等，這一類操作是非常危險的，必須在P3以上條件的專業(yè)實驗室中進行。 實驗室適應的病毒(即固定毒)，當接種實驗動物或操作感染的細胞培養(yǎng)時，特別是制備大量的高濃度病毒時，主要的傳染來源為手指被有感染的玻璃或工具刺傷或割破；新糜爛的皮膚或粘膜與感染物接觸也應認為是一種傳染的危險。雖然固定毒的毒力已大為下降，歷史上僅有一例死于固定毒操作的報道，但仍有一定的危險性，因此操作固定毒仍須十分小心。生物安全級別對工作人員的要求 (Biological Safety Level, BSL ) (Protection, P )BSL-

5、1：實驗人員在實驗程序方面受過特殊訓練，由受過微生物學或相關科學一般訓練的科學工作者監(jiān)督實驗。BSL-2：實驗人員均接受過病源處理方面的特殊培訓，并由有資格的科學工作者指導。BSL-3：實驗人員應在處理致病性的和可能使人致死的病源方面受過專業(yè)訓練，并由對該病源工作有經(jīng)驗的、有資格的科學工作者監(jiān)督。BSL-4：實驗室成員應在處理特別危險的傳染源方面受過特殊和全面的訓練，應了解標準和特殊操作中一級和二級遏制的作用、遏制設備、實驗室設計性能。實驗由在有關病源方面受過訓練、并有工作經(jīng)驗的、有資格的科學工作者監(jiān)督。2. 對安全操作的建議 操作所有潛在狂犬病感染的材料均應在 P2或P3生物安全實驗室內進行

6、。 對狂犬病實驗室診斷的安全性要求： 一個封閉的環(huán)境，專作狂犬病感染性工作 通過緩沖更衣間并限制一定的專業(yè)人員進入； 穿專用的實驗室隔離無菌衣和鞋； 操作完畢對操作臺進行消毒(當材料偶然地溢出時應立即用3的雷蘇爾溶液或其他相應的消毒劑消毒)； 每日應至少消毒地板一次； 所有用后剩余的標本，尸解工具，實驗室材料在拿出實驗室前應進行高壓蒸氣消毒。 在生物安全柜或隔離器內打開動物顱蓋骨的操作很困難，技術人員在操作這項工作時應帶面罩，護目鏡、手套和圍裙。 由于與狂犬病相關病毒對人的致病性還不很了解，所有操作可能含有這些病毒的標本均應在生物安全柜內進行。 所有實驗室工作人員務必進行狂犬病疫苗的暴露前免疫

7、，這些人員的中和抗體應定期檢查，所有意外地暴露于感染時必需立即報告負責人。三 狂犬病毒抗原的檢測 1. 標本選擇 在選擇、運送標本前，實際操作獲得標本的人員與實驗室檢測人員事先取得聯(lián)系共同選擇實驗方法是很重要的。1) 標本取自個體的生命期 檢查病毒和(或)抗原：樣品應放在干燥試管內。樣品的獲取可按下述方法進行。 (1)用注射器或吸管吸入法采集唾液(不用棉拭)，CSF，皮膚活檢等樣品。 (2)角膜涂片，用顯微鏡載玻片直接接觸角膜操作(不要用棉拭)，標記玻片，空氣干燥并用鋁錫紙單片包裹。 。檢測抗體：血液、CSF或血清采集于干燥試管內，并低溫冰凍存放。 2) 標本取自死亡后的個體 送至實驗室標本的

8、方式依動物種類不同而不同。 (1) 小的野生動物(包括蝙蝠) 送完整的個體以便對動物品種進行準確鑒定。 (2) 家養(yǎng)食肉動物(狗、貓)或野生食肉動物 (狐貍、貉、浣熊、臭鼬、豺等) 僅送頭部。 (3) 更大的動物(家養(yǎng)或野生食草動物) 打開頭蓋骨并取腦送至實驗室。標本取自死亡后的個體（人） 對人狂犬病在有可能進行全面尸解時，把整個腦取出，或選擇一些部位切下(海馬角、腦干、皮質、小腦)送至實驗室。 在特殊情況下(困難的野外條件，動物流行病學檢測)以及因宗教或傳統(tǒng)原因對狂犬病人無法尸解時，可以用塑料管或吸管穿進枕骨孔或眼窩后取出一些腦組織)。 2. 標本的運送 標本運送必需嚴格遵循安全要求，包裝務

9、必要有保證。 1)可靠的診斷要有一個保存良好的標本； 2)運送狂犬病標本的服務人員應事先進行過抗狂犬病免疫并證明已得到完全的保護。 3) 小動物的軀體或較大動物切下的頭部標本可用10甲醛溶液處理過的材料包裹，然后放入一個厚塑料袋內扎緊。 如僅取腦(大動物)則應把腦放人一個堅固的塑料或金屬容器內并密封，標本作好標記，外加第二層包裝并放人泡沫塑料盒中。遠距離運送時可用干冰保冷。 泡沫塑料盒用牢固的粘性帶仔細封固；把全部有關標本的資料放在信封內固定在盒上，再裝進一個紙板箱內。箱上應清楚地標明“小心，有感染性生物材料，狂犬病診斷用生物學標本”字樣。 當無冷凍條件且標本較小時，可以將小塊腦組織放進裝有8

10、0甘油緩沖液的小瓶內，以保存其感染性。 在無需保存標本的感染性，準備用免疫熒光法檢測抗原時，則可將腦組織標本用10甲醛固定(固定液內應含有苦味酸)。 3. 標本的獲取 1) 動物腦組織的獲取 1) 將動物頭部放在解剖臺上用骨固定鉗于上頒骨處牢牢固定住，用鋒利的屠刀從眼部至顱骨底部作一中線切割。 然后將顳肌從顱部切除，顱蓋骨用割刀和錘子等工具割掉。 對大動物可用一外科骨鋸在眼部二側上方將頭蓋骨橫切，切除腦膜，將髓質和腦神經(jīng)切割后，即可將腦取出放在一紙盤或大平皿內。動物腦組織的獲取 2) 特異性病毒包涵體在腦的一些部位更豐富，特別是海馬回，為了暴露海馬回，從一腦半球背面約半球間溝外側2cm處往下通

11、過灰質和白質直到側腦室作一縱切。海馬角像一半園柱形閃光體從腦室底部凸出，小腦和腦干也富有病毒包涵體。當標本保存不好時，通常腦干，髓質和視神經(jīng)還能保持完好。 在常規(guī)的操作中，采集海馬角、一小塊腦干和一小塊皮質放在平皿內，在底部和上面標上標本的序號。平皿立即放置于通風柜內處理或保存在4冷柜內。2) 唾液腺的獲取 為取出頜下腺，在復蓋于下頜骨間的皮膚上作一切割，將皮膚往外側翻，兩側的頜下腺位于頜骨后部邊緣表面。在下頜下淋巴結的后面（這二種不要相混淆）。 4. 標本的快速收集技術 在某些情況下可能難于或不可能尸解以便打開顱骨取腦, 為減少這些困難已經(jīng)設計出簡便的技術，即用塑料管插入顱骨采集一小塊腦組織

12、體。 第一種技術是用吸管通過枕骨孔插入并往前推至一眼睛部位，則吸管中的腦組織內含有部分腦干，小腦，海馬回和皮質。 第二種技術為將吸管通過眼窩后壁(用套管穿孔)并推至枕部，腦組織內含有部分皮質、海馬回、小腦。 1) 材料 取樣試管、塑料或玻璃吸管、套管。 保存或運送溶液：80甘油 PBS。2) 方法 (1) 枕部途徑： 把動物頸部往前彎曲，切開枕部和第一頸椎間的皮膚和肌肉； 割開寰椎一枕部韌帶，打開關節(jié)； 將取樣管通過枕孔插入并推向一只眼，拔出吸管，里面含有腦組織柱狀體。 (2) 后眼框途徑： 將眼球推向一邊，用套管在眼窩后壁穿孔； 將取樣管插人推向顱骨后部對側拔出，吸管內即含有腦組織柱狀體。

13、(3) 腦柱體的收集： 用合適的棉拭子或用橡皮球從管于的清凈端吹氣將腦柱體從管子內推在平皿內； 如試驗診斷需延期進行則將腦柱體放進裝有甘油溶液的螺旋蓋小瓶中。 5. 熒光抗體實驗 Fluorescent Antibody Test (FAT) 該方法的特點是： 耗時短，整個FAT操作需30分鐘，若加上涂片、固定，則需2-4小時。 與小鼠顱內接種試驗MIT相比，符合率達99% 。 需熒光顯微鏡及高質量的熒光標記抗體?？袢《究乖瓱晒鈽擞浛箍袢《究贵w免疫熒光實驗檢測狂犬病毒抗原熒光抗體實驗檢測狂犬病毒抗原 FATFAT的技術要求： 由于狂犬病毒多分布在動物腦海馬回及腦干處，因此合適的取樣部位對抗

14、原的檢測很重要。 腦樣品印片必須用丙酮固定5-10分鐘，因為丙酮可去除細胞膜表面的脂類，以便抗體到達細胞內與狂犬病毒結合。 腦樣品必須保存在含50%甘油的生理鹽水中，印片染色前需用生理鹽水洗滌數(shù)次。 熒光標記抗體需最大限度降低非特異性反應，因此制備特異性、高效價的抗體是FAT的關鍵。 熒光抗體實驗檢測狂犬病毒抗原 操作要求： 印片不能太厚，否則易出現(xiàn)假陽性 一個切面最多可印4次，否則易出現(xiàn)假陰性 丙酮固定時間不宜太長 洗滌不宜過度 判讀結果應快速，以免熒光淬滅用抗狂犬病毒核蛋白的單克隆抗體制備熒光結合物 我室目前采用抗狂犬病毒核蛋白的單克隆抗體制備熒光結合物，經(jīng)法國巴斯德研究所多次實驗，分別檢

15、測了人、犬、貓、狐貍、臭鼬、蝙蝠等動物來源的樣品，證實我們的熒光抗體具有非特異性小、靈敏度高的特點，質量上不比法國的產品差。 我們用該方法檢測了我國廣西狗肉市場上出售的食用狗的腦組織，結果發(fā)現(xiàn)在154份外觀健康的犬中，有5份為狂犬病毒抗原陽性，并且通過乳鼠顱內接種，我們已分離到這5株狂犬病街毒株。 6. 快速狂犬病酶免疫診斷法 Rapid Rabies Enzyme Immunodetection (RREID抗狂犬病毒單抗狂犬病毒樣品酶標抗狂犬病毒抗體6. 快速狂犬病酶免疫診斷法 技術特點： 本試劑盒操作方便、快速靈敏，適于大量樣本的檢測。 本試劑盒中酶標板包被后需立即使用或保存于-20C備

16、用。 肉眼觀察：陽性對照顯黃顏色，陰性對照完全無色。所有顯黃色樣品，無論深淺均認為是陽性。這種肉眼觀察已足夠作出診斷，非常經(jīng)濟，因為不需要昂貴的酶標儀，也最適合于作現(xiàn)場流行病學調查。 酶標儀讀數(shù)：仔細擦凈平板底面，用450nm濾光片讀數(shù)。陽性對照光密度值（OD）必須大于1.0單位，陰性對照OD值須低于0.1單位，判定值（CUT OFF）的確定：陰性對照OD值 0.008。OD值等于或大于CUT OFF的標本均視為陽性。 福爾馬林固定的樣品不適宜作RREID。7. 各種抗原檢測方法的比較： 直接熒光抗體試驗（FAT）: 最大優(yōu)點是快速、費用低且敏感性和特異性高。 快速狂犬病酶免疫診斷（RREID

17、）試驗: 也是一種快速的診斷方法，有非常好的敏感性和特異性；與 FAT一樣，即使標本的運輸條件不太好，也不會過多影響結果。RREID也與腦標本快速收集方法相適應。 細胞培養(yǎng)感染試驗(RTCIT）: 成神經(jīng)細胞瘤細胞對非常敏感和特異。能在24小時以內得出結果，可替代小鼠分離病毒的方法。但此法只適合在裝備較好、工作人員受過較好訓練的實驗室中進行。 四 狂犬病毒的分離和滴度測定 1.小鼠顱內接種分離狂犬病毒法（MIT）： 該方法敏感，適于不具備組織培養(yǎng)條件的實驗室分離狂犬病毒街毒。 耗時較長，僅憑動物發(fā)病癥狀不足以確定為狂犬病毒，需配合免疫熒光法作特異性鑒定。小鼠顱內接種分離狂犬病毒法 4-6只小白

18、鼠(9-11g重) 樣品，0.03ml/只 4天后觀察小鼠發(fā)病情況2.細胞培養(yǎng)分離技術Cell-culture Isolation Techniques (CIT) 該方法敏感，配合免疫熒光法可進行特異性快速診斷。 需在具備組織培養(yǎng)條件的實驗室中進行。 狂犬病毒抗原的檢測與診斷30%腦懸液樣品，5000rmp， 30minN2a細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h后固定，加熒光標記的抗狂犬病毒核蛋白抗體細胞無熒光，表明樣品中不含狂犬病毒細胞有熒光，表明樣品中含有狂犬病毒膠體金免疫層析法檢測狂犬病毒抗原 試紙有效性標志狂犬病毒陽性標志膠體金墊樣品插入端3. 組織培養(yǎng)狂犬病毒快速滴定法 待測RV樣品經(jīng)系列稀釋后，

19、分別感染96孔細胞培養(yǎng)板中的BSR細胞。該細胞在感染RV后會在細胞質內形成大量包涵體，其主要成分為RV的NP。感染24小時后，經(jīng)抗RV NP熒光標記抗體特異性染色，可在熒光顯微鏡下觀察到熒光灶（FF, Fluorescence Focus）。 通常在低倍顯微鏡(160X)下檢查8個視野。滴度用 Reed & Muench 方法計算，用熒光灶單位(FFU/ml) 2) 結果 我們將同一份CVS毒種分裝保存于一70，在半年時間內重復測定6次，其滴度相當穩(wěn)定（對于病毒稀釋度1：103.5，t=0.445，P0.05；對于病毒稀釋度1：104.2，t=0.353，P0.05）。 此 C V S 毒 種

20、 在 小 鼠 中 的 毒 力 滴 度 為 5 . 5 LogLD50/ml (Sm=0.4 Log LD50/ml),可用作毒力參考標準品。 根據(jù)未知RV樣品與此參考樣品在組織培養(yǎng)中用熒光灶單位(FFU/ml)表示的滴度的比值，可直接換算出其在小鼠中的LD50滴度。狂犬病毒抗原檢測方法的比較診斷技術 免疫熒光 快速酶 小鼠顱內 細胞培養(yǎng) 膠體金 實驗 免疫診斷 接種 分離技術 免疫層析法所需時間 2-3h 3-4h 5-10d 20-24h 5-10min特異性 99.99% 99.96% ND 99.99% ND敏感性 99.99% 98.06% ND 98.21% ND 狂犬病毒抗原的檢測

21、與診斷多種方法對廣西狗肉市場狂犬病街毒檢測結果樣品例數(shù) MIT RREID IFA PCR（狗腦） 陽性數(shù) 陽性數(shù) 陽性數(shù) 陽性數(shù) 102 4* 4 4 4*3份為狂躁型，1份為麻痹型五 滅活疫苗效價的測定 1.改良抗體結合試驗(ABT)在體外快速檢測滅活狂犬病疫苗效力 基本原理： 將定量的RV中和抗體與系列稀釋的滅活狂犬病疫苗在試管中進行抗原抗體反應，疫苗中的有效抗原成分會與相應中和抗體結合，即消耗掉部分(或全部)中和抗體。 然后將剩余的中和抗體用 RFFIT方法在細胞培養(yǎng)中進行快速測定。 疫苗中的有效抗原成分含量越高，剩余的中和抗體的含量越低；經(jīng)與已知效力的疫苗標準品所作的對照進行比較，即

22、可推算出待測疫苗的效價。改良抗體結合試驗(ABT)在體外快速檢測滅活狂犬病疫苗效力 實例： 我們對6批滅活狂犬病疫苗用ABT方法測定4次，并與用NIH試驗的結果進行比較，兩種方法所得結果的差別均無顯著意義(t1.39, P0.05)，即這兩種方法的結果基本相符。 ABT 與NIH 效力試驗的結果有很好的相關性，而且更加快速、經(jīng)濟，重復性更好。該方法在大多數(shù)情況下可取代 NIH 效力試驗。改良抗體結合試驗(ABT)的應用 改良ABT 相對于 NIH 試驗有許多明顯的優(yōu)點, 在德國等國已作為常規(guī)方法，在狂犬病疫苗的生產和科研中已普遍使用了約二十年，基本取代了NIH 效力試驗。 此方法已載入WHO

23、1996年版的狂犬病實驗室技術手冊（第四版）。WHO推薦將此方法用于疫苗生產過程的質量控制。 不過在歐洲藥典2000年版中，此方法僅是推薦用于RV糖蛋白濃度檢測的方法之一。當然RV糖蛋白濃度與疫苗的效力直接相關。2. 簡化的NIH小鼠試驗法 簡化的NIH小鼠試驗法原則上與傳統(tǒng)的NIH法沒有區(qū)別。 此方法的核心: 將常規(guī)的測定三個稀釋度簡化為一個稀釋度，而且此稀釋度只用10只小鼠。 此方法的關鍵: 正確選定稀釋度。此稀釋度應為假定該疫苗剛好達到2.5 IU/劑的最低合格要求時的50終點稀釋度(即ED50, 又稱50%有效劑量)。 按此稀釋度接種10只小鼠，以有8只小鼠存活（得到保護）為合格標準。

24、 稀釋度計算公式 此稀釋度可由以下公式計算決定： D=Dm + log10 (n) - log10 (N) log10 (v) 其中，D待測疫苗的最小ED50（用常用對數(shù)表示）。 Dm參考品疫苗的平均ED50（用常用對數(shù)表示）。 n 待測疫苗效力的最低合格要求（IU/ml）。 N 參考品疫苗的效力（IU/ml）。 v= 單劑待測疫苗的體積(ml) 國外文獻上通常采用上述公式。 如參照國內規(guī)程上的表述方式（不用對數(shù)），則上式可改寫為更直觀的形式： D=(Dm n) (N v) 稀釋度計算舉例： 某參考品疫苗的效力N=2 IU/ml，其ED50平均 值 是 1 6 倍 稀 釋 ， 用 常 用 對

25、數(shù) 表 示 為 1 . 2 ， 即Dm=1.2；單劑待測疫苗體積v=2 ml, 對其效力的最低合格要求是2.5 IU/劑，因此n=2.5IU / 2ml = 1.25 IU/ml。 按公式計算：D=1.2 + log1 0 (1.25) - log10 (2) log10 (2) =0.7 100.7=5 即ED50 為5倍稀釋。 如 不 用 對 數(shù) 而 直 接 計 算 ， 結 果 也 相 同 ：D=(161.25)(22)= 5。將待測疫苗按1:5稀釋接種10只小鼠，實驗結果如有8只以上的小鼠存活，則表明該待測疫苗的效力大于1.25 IU/ml x 2ml = 2.5 IU，即肯定該待測疫苗

26、達到最低合格要求。五狂犬病毒核酸的檢測 1直接檢測法：用已知的互補于選定的基因區(qū)的一小段核酸序列作探針，進行直接分子雜交檢測目的基因是否存在。 2間接檢測法：在進行分子雜交檢測目的基因是否存在以前，事先對目的基因進行擴增，再作分子雜交檢測。由于狂犬病毒的轉錄和復制產生的是RNA，所以擴增的第一步必須將病毒的RNA進行逆轉錄，成為互補鏈DNA，然后再將該DNA用多聚酶鏈反應(PCR)進行擴增。1. 基因擴增(PCR)及檢測 PCR技術于1990年首次用于檢測狂犬病毒RNA，近幾年來狂犬病毒分子流行病學研究的進展都與該技術的應用有關。 對原始樣品中的微量病毒RNA經(jīng)逆轉錄(RT)產生cDNA后，再

27、經(jīng)PCR進行放大。 對放大產物可根據(jù)診斷或分型的不同需要分別用不同方法進行分析，如凝膠電泳、斑點雜交、限制性片段長度分析(RFLP)、直接測序等。 與傳統(tǒng)的病毒分離或免疫學檢測法相比，PCR在敏感性、特異性、特別是在能提供精確的序列資料等方面都要優(yōu)越得多，因此有希望更廣泛地用于狂犬病的常規(guī)檢測及分子流行病學研究。 PCR產物的瓊脂糖凝膠電流電泳圖譜RV PCR的目標基因 在選擇RV基因組中的目標基因時， 為診斷的目的應選基因組上的保守區(qū)。 為分型及鑒別變異株應選易變區(qū)。 N基因: 高度保守且大量轉錄，適用于常規(guī)檢測，可檢出大樣品中含量很低的多種狂犬病毒。 L基因: 其內的若干區(qū)段也極穩(wěn)定，但轉

28、錄量較低，需采用特別敏感的檢測方法。 G和 L基因間的間隔序列又稱偽基因: 是進化上某個蛋白編碼基因的殘跡。它最易發(fā)生突變，更能代表病毒的自然進化，是最好的進化“時鐘”。對偽基因的比較特別適用于區(qū)分親緣關系相近的毒株。 G蛋白: 是誘生中和抗體的主要抗原且不如N蛋白穩(wěn)定。N蛋白雖不能誘生中和抗體，但與免疫保護反應也有一定關系。為了解不同毒株的抗原特性和交叉保護的分子基礎，常需要對G基因和N基因進行序列比較分析。2. 以基因擴增對狂犬病毒進行分型和來源鑒定 以PCR為基礎的一種簡便實用的狂犬病毒分型方法是限制性片段長度多形性分析 (RFLP)。 例如，用3種限制性內切酶即能方便地鑒別基因1、4、

29、5和6型：一套引物可使樣品中N基因的PCR產物為長約15Kb的片段，對產物分別用3種限制酶消化： 1)只有Pst I選擇性地切割6型(1個切點)； 2)只有4型不被PvuI切割(其余均為1個切點)； 3)DdeI可將1型切成2段，將5型切成多段。 另一套覆蓋G-L的引物可經(jīng)PCR放大在狂犬病毒及相關病毒中最多變的偽基因，可用于對關系極近及極遠的毒株定型。對放大產物用5種限制酶可區(qū)分6種主要疫苗株(PV、ERA、SADB9、 HEP、CVS和PM株)，并可與當前流行的野毒株作比較。 若用免疫學方法，需用8種抗N和 6種抗G單抗才能完成同樣的鑒別任務。 狂犬病的潛伏期到底能有多長？PCR技術應用于

30、狂犬病毒來源鑒定的一個精彩例證： 美國CDC的Smith等對從美國3名狂犬病死者分離的毒株的鑒定。死者均為移民，其一移民時間已達6年。 由于在美國感染狂犬病的機會極少，而且PCR序列分析的結果直接證明分離株分別與死者來源國家的狗中流行的毒株相同，所以該作者以迄今最令人信服的方式證明了狂犬病的潛伏期可長達6年以上。3. 狂犬病毒G基因的序列測定和系統(tǒng)樹進化分析 1981年Anilionist等報道了狂犬病毒G基因序列，隨后幾年里，又對幾株狂犬病毒部分的或全部的基因進行測定。由此，通過序列分析，對各毒株之間的相互關系有了進一步了解，明確了狂犬病毒分類的分子基礎。逐漸將狂犬病毒的核酸、氨基酸序列與已

31、知的生物學和免疫學的特性聯(lián)系起來?？梢酝茰y或確定病毒的抗原決定簇，和病毒致病力有關的分子基礎，以及病毒感染、復制和變異等的重要功能性氨基酸區(qū)域。這對研制狂犬病毒新型疫苗和抑制狂犬病毒感染和復制有著重要的指導作用，從而更有利于對狂犬病毒的預防和和亞洲不同地區(qū)、不同來源的RV街毒株的基因的全序列，確定決定其毒力、免疫原性和致病性的主要功能區(qū)，進行了序列的系統(tǒng)進化比較分析，探討我國及周連地區(qū)RV的遺傳變異規(guī)律。我所與法國巴斯德研究所一項合作研究的實例： (1)RT-PCR及測序引物參考文獻和PV株序列，并用Oligo4.0軟件進行校驗，最后選取的引物為： N（55-73）5ATG-TAA-CAC-C

32、TC-TAC-AAT-GG3 PA(3000-3019)5TGG-TGT-ATC-AAC-ATG-RAY-TC3 PB(4077-4096)5ACC-CAT-GTY-CCR-TCC-ATA-AG3 PC(3894-3913)5GAT-TAC-ACY-ATY-TGG-ATG-CC3 PD(5516-5536)5GAG-TTN-AGR-TTG-TAR-TCA-GAG3 P15CTC-ATG-TGA-ACG-GGG-TGT3(2) 病毒RNA的提取及RT-PCR 于四日齡乳鼠腦內接種狂犬病病毒，注射量為0.02ml/只。待小鼠出現(xiàn)明顯癥狀時，取腦進行熒光抗體檢測（IFA）。 對陽性鼠腦，采用TRIz

33、olReagent(GIBCOBRL)提取總RNA。用N與PC為引物，采用AMVReverseTranscriptase(Promega)逆轉錄合成cDNA。 在0.5 ml Ep管中依次加入35.5 l滅菌水、1l dNTP、5 l 10Buffer、3 l MgCl2 、1 l PA(1ul PC)、1 l PB(1ul PD)、1 l cDNA，短暫離心后100水浴1 min，再加入0.5 l DNA聚合酶，50 l液體石蠟，短暫離心后置于PCR儀：經(jīng)94 1min，58 50 s，72 90 s共循環(huán)40次，72保溫10 min后冷卻至4。10000 r/min離心5 min后取下層水

34、相轉入1.5 ml Ep管，取5 l用于電泳鑒定，余下的-20保存用于純化。 (3)產物純化采用WizaedPCRPrepsDNAPurificationSystem(Promega)純化PCR產物。 (4)電泳鑒定、cDNA序列測定取5l未純化產物或1l純化產物進行1.2%瓊脂糖電泳。測序由大連寶生物有限公司完成。 (5)序列分析 序列的比較排序采用CLUSTER以及GENEDOC軟件處理。 聚類分析(進化系統(tǒng)樹的構建)2) 結果和討論： 用計算機分析四株病毒糖蛋白基因（G基因）開放讀碼框架（ORF），四株病毒G基因編碼區(qū)均從起始密碼ATG開始，除終止密碼廣西-4株為TAA外均為TGA，從A

35、TG到終止密碼全長共1575個核苷酸殘基。(1)與其它狂犬病毒GP基因核苷酸序列同源性的比較(2)狂犬病毒G基因不同區(qū)段比較(3)疫苗的評價(4)聚類分析(進化系統(tǒng)樹的構建)五、 狂犬病毒抗體的檢測 WHO狂犬病專家委員會認為大于或等于0.5 IU/ml的抗體水平表示能得到有效的保護。 1992年第八屆WHO狂犬病專家委員會肯定并推薦將小鼠中和試驗(MNT)和RFFIT作為檢測RV中和抗體的兩項基本方法，這兩種方法應作為其它方法的基準和參考。 MNT是從上世紀30年代就開始采用的經(jīng)典方法。 自上世紀70年代初開始，RFFIT逐漸成為國際上最廣泛接受的對MNT的替代方法。WHO專家委員會建議在可

36、能時盡量用RFFIT代替MNT，因前者更快速、價廉，且靈敏度與MNT相同。1.小鼠中和試驗（Mouseneutralizing test, MNT） 原理： 將一定量預先滴定好的攻擊病毒，與待滴定的系列稀釋血清孵育。試驗中需設已知滴度的參照血清。然后將病毒/血清混和物經(jīng)腦內注射初成年小白鼠，計算死亡率和保護50%動物的血清稀釋度。 特點： 可定量檢測狂犬病毒中和抗體效價。 需專門技術培訓，操作較繁瑣。 需14天出結果，耗時長，不利于快速診斷。 需較多試驗小鼠，成本高。 動物間的個體差會影響試驗結果。小鼠中和試驗 三倍系列稀釋待測血清 預先滴定過的中和用狂犬病毒（設 已 知 國 際 單 位 的

37、標 準 血 清 對 照 ） C VS 鼠 腦 懸 液 （ 稀 釋 成 3 0 -300LD50） 等量混合 37保溫1小時后 37中和1小時 重復滴定LD50 顱內接種10-12克小白鼠 觀察并記錄小鼠發(fā)病及死亡情況 根據(jù)試驗結果計算中和指數(shù)及中和抗體含量2. 快速熒光灶抑制試驗 （RFFIT） Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test 基本實驗過程： 將固定劑量的CVS病毒與系列稀釋的待測血清(包括已知滴度的參考血清)一起在96孔細胞培養(yǎng)板中溫育(體外中和反應)。 病毒的最適劑量在預實驗中預先確定，為經(jīng)24小時溫育后能使80%的細胞感染(產生熒光包含體)

38、的最高稀釋度。 中和反應結束后在每孔中加入等量敏感細胞(BSR)懸液。 再經(jīng)24小時溫育后, 細胞單層用丙酮固定, 用熒光標記的抗NP抗體染色, 以檢測未被中和的病毒的存在(熒光灶FFU)。與病毒對照組比較, 計算每種待測血清使固定量CVS病毒的FFU/ml 減少50% 的稀釋度，然后與已知滴度的參考血清比較，計算每種待測血清的中和抗體滴度。快速熒光灶抑制試驗 三倍系列稀釋待測血清 預先滴定過的中和用狂犬病毒（設已知國際單位的標準血清對照） CVS病毒懸液（稀釋成30- 100FFD50） 等量混合 37保溫1小時后 37中和1小時 復滴定TCID50 接種96孔已形成單層的BSR細胞 CO2

39、孵箱37培養(yǎng)24小時 固定并用熒光抗體染色，熒光鏡觀察， 記錄每孔熒光灶數(shù)量，計算血清抗體效價病毒最適攻擊量的確定： 24小時能使80%細胞被感染的最高稀釋度。MNT和RFFIT檢測RV中和抗體含量的變異范圍： MNT ： 67% 149% RFFIT： 68% 146%MNT和RFFIT檢測2種抗RV血清參考品的結果參考品 RFFIT(IU/ml) MNT(IU/ml） A 13.4 14.0 20.2 19.5 12.7 13.9 15.5 18.0（GMT） 15.2 16.2 B 40.5 52.2 70.0 42.2 52.3 60.0 66.2 47.3 （GMT） 56.0 50

40、.0微量RFFIT方法的建立 我所在八年前已開始建立起微量RFFIT方法，并對該方法的重復性、特異性和靈敏度與MNT進行了比較，共檢測了數(shù)百份人畜血清樣品。該方法有希望在狂犬病的臨床診斷、疫苗質量控制和流行病學調查等項工作中獲得廣泛應用。A. 實驗方法 1) 攻擊病毒的制備和滴定： (1) 通常采用的毒株為固定的狂犬病毒CVS株, 在BHK/BSR細胞中制備。 (2) 細胞上清分裝安瓶, 儲存在-80。 (3) 最適攻擊劑量為24小時溫育后能使80%的細胞感染(產生熒光包含體)的最高病毒稀釋度(預試驗確定，參見前述組織培養(yǎng)狂犬病毒快速滴定法)。2) 血清病毒中和反應： (1) 待檢血清經(jīng)56

41、30分鐘滅活。 (2) 在96 孔板上設置 “未感染細胞對照” 和 “病毒對照”孔。 (3) 每個血清稀釋度設2個孔。 (4) 除病毒對照孔外, 每個孔加入100l D-MEM 培養(yǎng)基。 (5) 直接在孔中進行待檢血清和參考血清的系列3倍稀釋: (每孔已加入100l 培養(yǎng)基) 將50l血清加入第一排孔, 依次從1/3 到1/81 稀釋。在 “病毒對照” 孔, 加入100l培養(yǎng)基。 (6) 在含稀釋血清的每個孔內, 加入50l預先滴定的病毒懸液。 在 “未感染細胞對照” 孔內, 加入50l培養(yǎng)基。 在“病毒對照孔”, 對病毒懸液進行4次2倍稀釋, 從1/2 到1/16。 (7) 在375%恒濕溫

42、箱中保溫1小時。3) 加入細胞： (1) 用胰酶消化細胞, 制備濃度為1x106細胞/ml的細胞懸液. 每孔加入50l細胞懸液(5x104 細胞)。 (2) 在375% CO2 恒濕溫箱中溫育24小時。 4) 固定和染色： (1) 用與盛有漂白粉溶液的大瓶相連的真空裝置抽吸去各孔中的上清液。 (2) 用PBS 浸泡各孔3次, 每次5分鐘(抽吸上清液)。 (3) 以80% 丙酮浸洗各孔, 重復一次(在-20C放置5分鐘)。抽干各孔, 空氣干燥。 (4) 每孔加入40l抗NP 抗體熒光結合物( 預先1:20) 稀釋), 在37C 濕盒中保溫30 分鐘。 (5) 吸出結合物, 以PBS 洗2次，第一

43、次1分鐘, 第二次5分鐘。 (6) 空氣干燥, 每孔加1 滴甘油。 (7) 螢光顯微鏡下觀察。 B. 結果觀察 1) 記錄每孔的螢光數(shù)(FF)。 2) 與病毒對照組比較, 對每種待測血清計算FF數(shù)減少50% 的稀釋度。 3) 與參考血清比較, 計算每種待測血清的滴度。 C. 計算實例: 血清X 1/27: 15% 參考血清: 10 IU/ml 1/81: 20% 1/81: 60% 1/243: 70% (50-15)/(60-15)xLog3+Log 27 (50-20)/(70-20)xLog3+Log 81 =0.371+1.4314=1.80 =0.286+1.9=2.194 101.

44、8=63 102.194=156.5 X / 10 = 63 / 156.5 X=4.03 IU /ml用MNT和RFFIT測定2種抗RV中和血清參考品的結果 參考品 RFFIT(IU/ml) MNT(IU/ml） A 13.4 14.0 20.2 19.5 12.7 13.9 15.5 18.0（GMT） 15.2 16.2 B 40.5 52.2 70.0 42.2 52.3 60.0 66.2 47.3 （GMT） 56.0 50.0RFFIT的特點： 可定量檢測狂犬病毒中和抗體效價。 耗時較短，可用于精確定量的快速診斷。 重復性好。 需專門技術培訓，操作較繁瑣。 需熒光顯微鏡。3. 酶

45、免疫吸附法（ELISA）： 酶免疫吸附法是七十年代建立的方法，目前世界上用于檢測狂犬病毒抗體的酶免疫法基本上是采用間接ELISA法，其吸附抗原有全病毒顆粒、純化的狂犬病毒糖蛋白以及純化的狂犬病毒核衣殼蛋白（RNP），并以過氧化物酶標記的抗抗體作為標記抗體，即可檢測人及不同動物血清中的抗狂犬病毒抗體。 各種檢測狂犬病毒抗體的ELISA法的抗原抗體比較酶免疫吸附法吸附抗原所檢測的抗體間接ELISA純化狂犬病毒糖蛋白抗 狂 犬 病 毒 糖 蛋 白 抗 體（中和抗體）間接ELISA純化全病毒顆?？箍袢《究贵w（含中和抗體）間接ELISA粗制狂犬病毒抗吸附抗原的抗體（含中和抗體）間接ELISA純化狂犬病

46、毒核衣殼蛋白抗狂犬病毒核衣殼蛋白夾 心 間 接ELISA狂犬病毒抗原抗狂犬病毒抗原抗體（含中和抗體） 酶免疫吸附法 抗狂犬病毒單抗包被 狂犬病毒抗原待檢人血清中的抗狂犬病毒抗體酶標抗人IgG抗體顯色底物ELISA的特點： ELISA只需簡單的實驗室設備，尤其適合檢測大量的血清樣品，且在很短的時間內即可出結果。 ELISA法與MNT有較好的相關性，在小鼠飼養(yǎng)及組織培養(yǎng)不具備的實驗室里，ELISA可視為MNT的替代方法。 嚴格地講，ELISA實驗并沒有測定真正的中和抗體，所測抗體為幾乎所有的與包被板上抗原結合的IgG抗體，包括一些非特異性抗體，所以其結果不用國際單位（IU/ml）表示，而是用等價單

47、位（EU/ml）表示。EIA檢測維爾博疫苗首劑注射后抗體陽檢率EIA檢測維爾博疫苗首劑注射后抗體陽檢率0 00.20.20.40.40.60.60.80.81 11.21.20 07 71414282845459090天抗體陽檢率維爾博維爾博 EIA與MNA檢測狂犬病毒抗體結果比較免疫用疫苗 例數(shù) MNA EIA EIA 陽性數(shù) 陽性數(shù) 陽檢率 維爾博苗 74 74 74 100%aG濃縮苗 67 67 62 92.5%CTN精制苗 34 / 31 / 4.其他檢測抗體的方法： 1） 斑點免疫結合法（DIA）： 1986年由Heberling等建立，用于檢測人血清中狂犬病毒抗體，其結果與RFF

48、IT具有可比性，但須稍作改進以檢測狂犬病毒中和抗體水平。該方法只需一滴血、僅30-40分鐘即可出結果。2） 快速凝集法（RAT）： 以抗原致敏乳膠，可檢測2.5IU/ml以上的抗體水平, RAT與MNT符合率達97%以上。3） 間接免疫熒光法（IFA）： 以狂犬病毒感染細胞，制成細胞片，用間接免疫熒光法檢測人血清中狂犬病毒抗體，但該方法只能作半定量測定抗狂犬病毒抗體，其靈敏度隨待測血清的稀釋度增加而降低，同時與細胞片制備過程中病毒接種的量及感染時間長短有關。 各血清學試驗獲得結果所需時間 方法 MNTRFFITELISA IFA 時間21天26小時 4小時 2小時 定性或定量定量定量定量 定性

49、六實驗室檢測技術發(fā)展的趨勢：盡量少用或不用動物 RV的傳統(tǒng)的檢測方法是小鼠動物試驗。在中國生物制品規(guī)程2000年版中，規(guī)定的狂犬病疫苗的多項檢定均采用小鼠動物實驗，如病毒滴定、病毒滅活確證試驗以及疫苗效力測定等。 這些實驗都需要大量動物，實驗費用高，操作繁瑣，而且每次實驗需時14天以上，其中測定疫苗效力的實驗甚至需要至少28天。 由于影響動物實驗結果的因素很多，如動物的品系、飼養(yǎng)條件，實驗人員的操作水平等，所以實驗結果的誤差較大、重復性較低。細胞培養(yǎng)法相對于小鼠動物試驗的優(yōu)點 廉價：一個細胞培養(yǎng)孔可取代一組小鼠，實驗費用可顯著降低?？焖伲喝繉嶒炈钑r間能降至2個工作日。簡便、重復性高：由于細

50、胞培養(yǎng)是在96孔細胞培養(yǎng)板中的無菌條件下進行，實驗條件規(guī)范，各種試劑定量的精確性能得到保證，對實驗人員的操作水平的要求較易滿足，因而所得實驗結果有更高的一致性。 靈敏度：與小鼠動物試驗基本相同。避免使用動物。 在歐洲藥典2000年版中，相應的檢定絕大多數(shù)均由細胞培養(yǎng)法所取代。 保護動物、善待動物 采用細胞培養(yǎng)取代小鼠動物試驗，也符合保護動物這一國際流行趨勢。保護動物、善待動物是一個國家或社會文明進步程度的標志之一。許多發(fā)達國家都已有明確的有關保護動物的立法，例如在歐洲已頒布 保護用于科學和其它試驗目的的脊椎動物公約 要求在同時有其它實驗方法可用時，盡量不用實驗動物；在沒有其他替代方法時，也應盡量減少動物的用量。隨著中國改革開放的深入，我國在科研動物的使用方面也應逐步與國際接軌，今后盡量減少動物用量已是大勢所趨。 在我國推廣應用細胞培養(yǎng)法