新生隱球菌的致病機理

1、1隱球菌病的致病菌1CC.1Mature basidiaPostmeiotic mitosisMeiosisKaryogamyin basidiumDikaryotic hyphaeConjugationHaploid cycleaa aLife CycleMATa X MATa a1Blood streamBrainCryptococcosis: Route of infection and dissemination1隱球菌病隱球菌病病原菌病原菌: :新生隱球菌新生隱球菌感染途徑感染途徑 : : 吸入，皮膚，胃腸道？吸入，皮膚，胃腸道？分布分布 : : 世界范圍世界范圍 腦、肺、皮膚、骨和

2、關(guān)節(jié)腦、肺、皮膚、骨和關(guān)節(jié) HIV, HIV, 淋巴瘤淋巴瘤, , 激素治療激素治療, , 器官移植器官移植 原發(fā)性原發(fā)性CD4 CD4 淋巴細胞減少淋巴細胞減少未治療的腦膜炎死亡率為未治療的腦膜炎死亡率為100% 100% 易感因素易感因素 : :易感器官：易感器官：預(yù)后預(yù)后 : :1莢莢 膜膜黑黑 素素磷脂酶磷脂酶37 37 下生長良好下生長良好1新生隱球菌是如何穿過血腦屏障后進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的？新生隱球菌是如何穿過血腦屏障后進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的？為什么新生隱球菌易于感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)？為什么新生隱球菌易于感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)？新生隱球菌進入機體的途徑是否只有吸入肺部后入血一個？新生隱球菌進入機體

3、的途徑是否只有吸入肺部后入血一個？1人臍靜脈內(nèi)皮細胞（人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）建立血腦屏障模型，觀察新生隱球菌對）建立血腦屏障模型，觀察新生隱球菌對HUVEC的影響的影響 新生隱球菌靜脈感染新生隱球菌靜脈感染C57BL/6小鼠后，檢測大腦皮質(zhì)內(nèi)新生隱球菌感染情況，大腦皮小鼠后，檢測大腦皮質(zhì)內(nèi)新生隱球菌感染情況，大腦皮質(zhì)內(nèi)細胞凋亡及大腦皮質(zhì)中特異蛋白的表達質(zhì)內(nèi)細胞凋亡及大腦皮質(zhì)中特異蛋白的表達 1Mouse model of cryptococcosis1 血腦屏障模式圖血腦屏障模式圖1 緊密連接緊密連接血腦屏障血腦屏障病原體病原體1231: 1: 細胞內(nèi)侵襲細胞內(nèi)侵襲2: 2: 細胞旁通

4、過打開緊密連接細胞旁通過打開緊密連接3: 木馬機制：通過巨嗜細胞穿越木馬機制：通過巨嗜細胞穿越ECM巨嗜細胞巨嗜細胞病原體穿越血腦屏障的方式病原體穿越血腦屏障的方式 1HBMEC HBMEC 單層單層半通透膜半通透膜Filter- insertFilter- insert腦側(cè)腦側(cè)血液側(cè)血液側(cè)新生隱球菌新生隱球菌檢測新生隱球菌通過血腦屏障的體外模型檢測新生隱球菌通過血腦屏障的體外模型1A: A: 對照組對照組 B: 2h C: 6h D: 12h B: 2h C: 6h D: 12h 新生隱球菌侵襲血腦屏障新生隱球菌侵襲血腦屏障ECEC細胞的凋亡率細胞的凋亡率 1A: A: 對照組對照組 B:

5、0.5h C: 0.5h D: 0.5h E: 0.5h F: 6h G: 6h H: 12h B: 0.5h C: 0.5h D: 0.5h E: 0.5h F: 6h G: 6h H: 12h 1 A: A: 對照組對照組 B: 2h C: 6h D: 12h B: 2h C: 6h D: 12h 1A A：對照組：對照組 B B：2h C2h C：6h6h：DD：12h 12h 1A A：對照組：對照組 B B：2h C2h C：6h6h：DD：12h 12h 1HUVEC 緊密連接相關(guān)蛋白表達緊密連接相關(guān)蛋白表達緊密連接胞質(zhì)附著蛋白緊密連接胞質(zhì)附著蛋白 ZO-1ZO-1血管滲透因子血管

6、滲透因子VEGFVEGFIL-6IL-61 大腦皮質(zhì)大腦皮質(zhì)PASPAS染色染色 A A：C group BC group B：CTX group CTX group C C：0.5h D0.5h D：2h E2h E：6h F6h F：12h G12h G：24h H24h H：72h72h大腦皮質(zhì)透射電鏡大腦皮質(zhì)透射電鏡 A A：C group BC group B：24h C24h C：72h D72h D：C C group Egroup E：24h F24h F：72h 72h 1 小鼠大腦皮質(zhì)Bcl-2在不同時相點的比較 不同時相點的小鼠大腦皮質(zhì)凋亡細胞比較 不同時相點的小鼠大腦皮

7、質(zhì)Bax比較 1 1新生隱球菌入血后到達血腦屏障，新生隱球菌入血后到達血腦屏障，通過相關(guān)細胞因子如通過相關(guān)細胞因子如IL-6IL-6和和VEGFVEGF等作用引起腦微血管內(nèi)皮細胞的凋亡，等作用引起腦微血管內(nèi)皮細胞的凋亡，緊密連接開放，細胞間隙增大，并可能使血腦屏障完整性被破壞，緊密連接開放，細胞間隙增大，并可能使血腦屏障完整性被破壞，穿越血腦屏障，感染宿主腦組織穿越血腦屏障，感染宿主腦組織 1新生隱球菌的跨膜作用新生隱球菌的跨膜作用穿越腦微血管內(nèi)皮細胞緊密連接穿越腦微血管內(nèi)皮細胞緊密連接腦微血管內(nèi)皮細胞凋亡腦微血管內(nèi)皮細胞凋亡其它相關(guān)因子導(dǎo)致的通透性的增加其它相關(guān)因子導(dǎo)致的通透性的增加1利用蛋

8、白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析新生隱球菌與血管內(nèi)皮細胞共孵育后血管內(nèi)皮細胞蛋白質(zhì)譜利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析新生隱球菌與血管內(nèi)皮細胞共孵育后血管內(nèi)皮細胞蛋白質(zhì)譜的變化的變化篩選差異表達蛋白，并在基因的轉(zhuǎn)錄層面進行驗證篩選差異表達蛋白，并在基因的轉(zhuǎn)錄層面進行驗證 1實驗組蛋白二維凝膠電泳圖譜實驗組蛋白二維凝膠電泳圖譜 對照組蛋白二維凝膠電泳圖譜對照組蛋白二維凝膠電泳圖譜1共找到可信差異表達蛋白點共找到可信差異表達蛋白點1919個個5 5個蛋白點僅在對照組細胞中表達個蛋白點僅在對照組細胞中表達3 3個蛋白點僅在實驗組細胞中表達個蛋白點僅在實驗組細胞中表達1010個蛋白點在實驗組細胞中表達降低個蛋白點在實驗組細胞中表

9、達降低1 1個蛋白點在實驗組細胞中表達升高個蛋白點在實驗組細胞中表達升高 1S100A10S100A10Prx Prx Prohibitin (PHB)Prohibitin (PHB) HSP27HSP27Malate dehydrogenase Malate dehydrogenase CacyBP CacyBP PSA7_HUMAN PSA7_HUMAN cofilin cofilin 1增強細胞骨架活動能力，促進細胞胞吞胞吐活動增強細胞骨架活動能力，促進細胞胞吞胞吐活動 減少減少HUVECHUVEC對氧應(yīng)激的耐受能力，細胞損傷增加，增殖能力下降對氧應(yīng)激的耐受能力，細胞損傷增加，增殖能力下

10、降 促進細胞凋亡促進細胞凋亡 影響了影響了HUVECHUVEC正常的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程正常的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程 抑制細胞能量代謝抑制細胞能量代謝 1小鼠原發(fā)性皮膚隱球菌感染模型的建立小鼠原發(fā)性皮膚隱球菌感染模型的建立宿主免疫狀態(tài)、隱球菌變種和莢膜與皮膚隱球菌感染的關(guān)系宿主免疫狀態(tài)、隱球菌變種和莢膜與皮膚隱球菌感染的關(guān)系小鼠隱球菌皮膚感染后是否發(fā)生播散小鼠隱球菌皮膚感染后是否發(fā)生播散人角質(zhì)形成細胞株人角質(zhì)形成細胞株HaCatHaCat體外與新生隱球菌相互作用體外與新生隱球菌相互作用 11傳染性軟疣樣皮損傳染性軟疣樣皮損潰瘍潰瘍結(jié)節(jié)樣皮損結(jié)節(jié)樣皮損PASPAS染色染色 1免疫抑制與免疫正常小鼠各個

11、臟器及血液真菌培養(yǎng)均為陰性免疫抑制與免疫正常小鼠各個臟器及血液真菌培養(yǎng)均為陰性免疫抑制小鼠血清乳膠凝集試驗陽性免疫抑制小鼠血清乳膠凝集試驗陽性 乳膠凝集試驗是目前比較成熟的技術(shù)，在去除試驗本身因素影響后，其陽性率接近乳膠凝集試驗是目前比較成熟的技術(shù)，在去除試驗本身因素影響后，其陽性率接近100100 免疫嚴重受損的患者，皮膚局部創(chuàng)傷后大劑量接種隱球菌還是可能引起播散性的隱球菌感染免疫嚴重受損的患者，皮膚局部創(chuàng)傷后大劑量接種隱球菌還是可能引起播散性的隱球菌感染 1免疫抑制的作用可以使隱球菌感染皮損出現(xiàn)時間提前，感染加重。免疫抑制的作用可以使隱球菌感染皮損出現(xiàn)時間提前，感染加重。無莢膜株與父代有莢

12、膜株在皮膚的致病力方面沒有明顯差別無莢膜株與父代有莢膜株在皮膚的致病力方面沒有明顯差別 兩個變種之間的致病力沒有顯著差別兩個變種之間的致病力沒有顯著差別1新生隱球菌對角質(zhì)形成細胞的時間粘附率0%5%10%15%20%25%30%35%0.5124時間：h粘附率cap64B3501ATCC32609新生隱球菌對角質(zhì)形成細胞的時間通過率0%5%10%15%20%25%2468時間：h通過率cap64B3501ATCC32609新生隱球菌對角質(zhì)形成細胞活力的影響0510152025300.512時間：h調(diào)亡率：cap64B3501ATCC32609空白對照killed-B3501不同共同培養(yǎng)方式對角

13、質(zhì)形成細胞活力的影響0510152025300.5h1h2h時間調(diào)亡率：cap64cap64不接觸B3501B3501不接觸killed-B3501ATCC32609ATCC32609不接觸空白對照1角質(zhì)形成細胞中的角質(zhì)形成細胞中的B3501B3501，可見菌體正在出芽。可見菌體正在出芽。角質(zhì)形成細胞中的角質(zhì)形成細胞中的cap64cap64，可見菌體中出現(xiàn)空泡?？梢娋w中出現(xiàn)空泡。1空白對照空白對照 B3501作用作用2h cap64作用作用2hGenistein預(yù)處理前后粘附率的比較0%5%10%15%20%25%30%35%0.5124時間：h粘附率cap64cap64-預(yù)處理B3501B3501預(yù)處理ATCC32609預(yù)處理ATCC32609-Genistein預(yù)處理前后隱球菌通過率的比較0%5%10%15%20%25%2468時間：h透過率cap64cap64-預(yù)處理B3501B3