巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展ppt課件

1、生科院生科院 楊軍楊軍宿主系統(tǒng)載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)蛋白修飾與分泌系統(tǒng) 一、前言 二、畢赤酵母簡(jiǎn)介 三、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)四、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化 啟動(dòng)子選擇 外源基因的特性 基因劑量 mRNA的非翻譯區(qū) 翻譯后修飾 產(chǎn)物的穩(wěn)定性 發(fā)酵條件五、前景展望 在過去的數(shù)十年中，遺傳學(xué)家努力于DNA的鑒定和基因重組的研討，而重組有機(jī)體主要運(yùn)用于蛋白質(zhì)的消費(fèi)。由于一些蛋白具有宏大的商業(yè)價(jià)值，因此大多數(shù)研討努力于尋覓可以高效消費(fèi)有功能蛋白的途徑。隨著蛋白質(zhì)工程和DNA重組技術(shù)的開展，諸多有運(yùn)用潛力的蛋白分子有待開發(fā)， 不同在蛋白在不同系統(tǒng)中表達(dá)程度有顯著差別，目前運(yùn)用的表達(dá)系統(tǒng)包括細(xì)菌、酵母、昆蟲、哺乳動(dòng)

2、物細(xì)胞等表達(dá)體系。其中酵母表達(dá)系統(tǒng)相對(duì)于其他表達(dá)系統(tǒng)有以下優(yōu)點(diǎn)：不存在原核表達(dá)系統(tǒng)的內(nèi)毒素難以除去的問題，也不存在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的病毒和支原體污染等問題；并可以對(duì)目的蛋白進(jìn)展類似高等真核生物的信號(hào)肽剪切、二硫鍵構(gòu)成、糖基化等過程的翻譯后蛋白加工。在酵母表達(dá)系統(tǒng)中，巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris,Pp)表達(dá)外源基因最理想。下面就巴斯德畢赤酵母表達(dá)的特點(diǎn)和研討進(jìn)展作一簡(jiǎn)要綜述。 巴斯德畢赤酵母是一種甲基營(yíng)養(yǎng)菌，可以在低 廉的甲醇培育基中生長(zhǎng)，甲醇能高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達(dá)，因此生長(zhǎng)迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所屬?gòu)?qiáng)啟動(dòng)子、表達(dá)的可誘導(dǎo)性是巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的

3、三大優(yōu)勢(shì)。由于巴斯德畢赤酵母沒有適宜的自主復(fù)制型載體，所以外源基因的表達(dá)序列普通整合入受體的染色體DNA上，因此可以穩(wěn)定遺傳。目前已有500多種外源蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得勝利表達(dá)。 二、巴斯德畢赤酵母簡(jiǎn)介Pichia pastoris甲醇代謝途徑 目前廣泛運(yùn)用于外源基因表達(dá)和研討的畢赤酵母宿主菌有兩種主要類型：營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主菌和蛋白酶缺陷型宿主菌 宿主系統(tǒng)l營(yíng)養(yǎng)缺陷型： GS115his4最常用，此菌株的組氨酸脫氫酶基因突變，因此不能合成組氨酸，在不含組氨酸的培育基上不能生長(zhǎng)，以此作為挑選標(biāo)志。但由于本身合成蛋白酶對(duì)外源蛋白有降解，因此產(chǎn)物存在不均一的問題。 其中KM71和SMD116

4、8最常用，KM71his4 arg4 aox1 : : SARG的AOX1部分缺失，并且被S.cerevisiae的ARG4取代。因此AOX1強(qiáng)啟動(dòng)子基因不能編碼醇氧化酶，只能依托AOX2基因弱啟動(dòng)子編碼醇氧化酶，因此KM71為甲醇利用緩慢型Muts。l蛋白酶合成缺陷型 SMD1168pep4:URA3 his4 ura3由于pep4部分缺失，不能合成蛋白酶A，而蛋白酶B和羧肽酶Y由蛋白酶A激活，因此可以有效減少對(duì)外源蛋白的降解。但消費(fèi)緩慢，導(dǎo)致蛋白產(chǎn)量上不去。載體系統(tǒng) 由于畢赤酵母沒有穩(wěn)定的游離型載體，故運(yùn)用整合型載體，經(jīng)過同源重組整合到酵母染色體來實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，整合位點(diǎn)普通是在AOX1或H

5、IS4處，因此，載體上帶有HIS4和AOX1基因的部分序列；還包括MCS和大腸桿菌復(fù)制所必需的元件，如復(fù)制起始位點(diǎn)，氨芐抗性基因；用于分泌表達(dá)的載體上還包括有信號(hào)肽序列。General diagram of a p.pastoris expression vector .YFG,Your Favorite Gene; *,sites for cassette amplificationl胞內(nèi)表達(dá)型載體l分泌表達(dá)型載體l轉(zhuǎn)化程序 l重組子在酵母細(xì)胞中的命運(yùn)l用于轉(zhuǎn)化子挑選的基因標(biāo)志 主要有三種方法：原生質(zhì)體法：早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，在Ca2+和PEG的存在下，

6、轉(zhuǎn)化細(xì)胞可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1-2% ；離子溶液法:酵母的完好細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子如Li+等、PEG、熱休克處置后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA。 103104個(gè)轉(zhuǎn)化子/g DNA；電穿孔法(electroporation) ：酵母菌原生質(zhì)體和完好細(xì)胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA。105個(gè)轉(zhuǎn)化子/g DNA。 導(dǎo)入畢赤酵母的重組質(zhì)粒能經(jīng)過同源重組整合到染色體上，不同的整合方式可產(chǎn)生不同表型的轉(zhuǎn)化子：1同源雙交換：表達(dá)載體線性化后，兩端分別為5AOX1和3AOX1序列，與基因組的同源序列發(fā)生雙交換后，導(dǎo)致畢赤酵母基因組內(nèi)AOX1編碼區(qū)被表達(dá)單元所交換，胞內(nèi)醇氧化酶只能來自AOX2基因，酶活性大大降低。因此

7、轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)為甲醇利用緩慢，表型為Muts。 2特異性的單交換：表達(dá)載體在5AOX1或3AOX1處線性化后，與染色體基因組中的相應(yīng)序列發(fā)生同源重組，整合入AOX1基因的上游或下游。由于AOX1基因未被破壞，仍具有活性，所以轉(zhuǎn)化子能正常利用甲醇，表型為Mut+，在甲醇為獨(dú)一碳源的培育基中正常生長(zhǎng)。 通常有5%-10%轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)多拷貝整合，可用重組子上標(biāo)志基因如G418來挑選多拷貝轉(zhuǎn)化子，斑點(diǎn)雜交來測(cè)定外源基因拷貝數(shù)。普通情況下，整合的外源基因表達(dá)單元的拷貝數(shù)越多，表達(dá)效率越高，可直接經(jīng)過SDS-PAGE電泳來測(cè)定外源蛋白表達(dá)量。此外也可利用同尾酶體外構(gòu)建多拷貝重組子。 假設(shè)整合發(fā)生在his4位點(diǎn)處

8、，能夠出現(xiàn)表達(dá)單元喪失景象，這能夠是由于基因組中突變的his4與表達(dá)單元中的his4基因之間發(fā)生了基因轉(zhuǎn)換gene conversion所致，所以普通選擇AOX1位點(diǎn)整合。his4l用于轉(zhuǎn)化子挑選的基因標(biāo)志用于轉(zhuǎn)化子挑選的基因標(biāo)志 用于畢赤酵母轉(zhuǎn)化子挑選的基因標(biāo)志主要有營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因和顯性基因： 營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因主要氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：HIS4, ARG4精氨酸琥珀酸裂合酶, URA3 (尿嘧啶合成酶基因 顯性標(biāo)志基因，如Zeocin，Blasticidin滅瘟素,G418l 信號(hào)肽對(duì)分泌表達(dá)效率的影響l 畢赤酵母啟動(dòng)子的可控性常用的啟動(dòng)子有誘導(dǎo)型和組成型。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括：

9、PAOX1、PFLD1、PICL1組成型啟動(dòng)子：PGAP1PAOX1：是由甲醇誘導(dǎo)的強(qiáng)啟動(dòng)子，也是畢赤酵母表達(dá)中運(yùn)用最廣泛的啟動(dòng)子，AOX1基因是利用的甲醇的第一個(gè)酶基因，它的表達(dá)是在轉(zhuǎn)錄程度被調(diào)控的。具有以下優(yōu)勢(shì)：以甲醇作為獨(dú)一碳源時(shí)，才干誘導(dǎo)AOX1的表達(dá)，因此可嚴(yán)密調(diào)控外源蛋白的表達(dá)?？梢愿咝П磉_(dá)外源蛋白。缺陷：甲醇添加時(shí)間和添加量不好掌握；甲醇易燃，大量?jī)?chǔ)存危險(xiǎn)性大；甲醇為石油化工原料，因此不適宜消費(fèi)食用蛋白。 2PFLD1：FLDFormaldehyde dehydrogenase是甲醛脫氫酶基因，是甲醇代謝途徑中的另一關(guān)鍵酶，同時(shí)參與甲胺代謝。FLD1基因既可受甲醇誘導(dǎo)，又可以受甲

10、胺誘導(dǎo)。因此它利用甲醇或甲胺誘導(dǎo)PFLD1表達(dá)外源蛋白，當(dāng)用甲胺誘導(dǎo)時(shí)，葡萄糖或甘油可替代甲醇做為碳源。其嚴(yán)風(fēng)格控和轉(zhuǎn)錄效率與PAOX1相當(dāng)。Resina等發(fā)現(xiàn)用甲醇和甲胺共誘導(dǎo)PFLD1與單純用甲醇誘導(dǎo)相比，外源蛋白R(shí)hizopus oryzae lipase稻根霉菌脂肪酶的表達(dá)量有所提高。3PICL1：檸檬酸裂合酶啟動(dòng)子是一種能以甲醇為獨(dú)一碳源誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，它可以在畢赤酵母中高效表達(dá)葡聚糖酶。但是，關(guān)于它能否在畢赤酵母中啟動(dòng)外源蛋白表達(dá)及其誘導(dǎo)表達(dá)條件，還需求進(jìn)一步的研討。 4PGAP：是一種組成型表達(dá)啟動(dòng)子，不需甲醇，操作簡(jiǎn)單，誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)量與PAOX1相當(dāng)。但不適宜表達(dá)對(duì)畢赤酵母

11、有毒性作用的蛋白。 因畢赤酵母只能識(shí)別很少的外源蛋白信號(hào)序列,所以更多的是利用酵母的同源信號(hào)序列,如來自畢赤酵母的酸性磷酸酶信號(hào)序列PHO1)和釀酒酵母的交配因子前導(dǎo)肽-Factor prepropeptide，其中交配因子前導(dǎo)肽運(yùn)用最廣泛。 -Factor prepropeptide: 來自釀酒酵母，由19個(gè)氨基酸殘基的前體序列和66個(gè)氨基酸的殘基的前導(dǎo)肽序列組成，其中前導(dǎo)肽序列中含有三個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和一個(gè)Kex2蛋白內(nèi)切酶位點(diǎn)，是目前運(yùn)用最勝利的信號(hào)肽。信號(hào)肽構(gòu)造的改動(dòng)能夠會(huì)提高分泌效率信號(hào)肽構(gòu)造的改動(dòng)能夠會(huì)提高分泌效率 Antonio等發(fā)現(xiàn)，改造了的信號(hào)肽大大提高了外源蛋白表等發(fā)現(xiàn)，改

12、造了的信號(hào)肽大大提高了外源蛋白表達(dá)量。用經(jīng)過修飾的人血潔白蛋白天然信號(hào)肽可使達(dá)量。用經(jīng)過修飾的人血潔白蛋白天然信號(hào)肽可使HSA在畢在畢赤酵母中的分泌提高幾倍。赤酵母中的分泌提高幾倍。 Thomas 等將編碼等將編碼10個(gè)氨基酸銜接肽的序列插入到個(gè)氨基酸銜接肽的序列插入到-Factor與胰島素前體基因之間，使胰島素前體在畢赤酵母中與胰島素前體基因之間，使胰島素前體在畢赤酵母中的表達(dá)提高了的表達(dá)提高了3倍。倍。 作為真核生物，畢赤酵母可以進(jìn)展類似哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白翻譯后修飾，如信號(hào)肽加工，蛋白折疊，二硫鍵構(gòu)成和糖基化修飾等畢赤酵母中外源糖蛋白的糖基化： 酵母菌中的蛋白糖基化修飾有兩個(gè)主要步驟，即在

13、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)腔中的寡聚多糖核裝配以及在高爾基體中的糖外鏈延伸。 糖基分為兩種類型：O-糖基和N-糖基。O-寡聚多糖只需甘露糖，但許多高等真核生物的蛋白在一樣的糖基化位點(diǎn)上都含有唾液酸基團(tuán)，而且糖基化位點(diǎn)也存在差別。N-寡聚多糖核與高等真核生物完全一樣，但外側(cè)鏈卻有明顯差別。而這種差別往往會(huì)導(dǎo)致蛋白生物活性下降、免疫原性添加等不良影響。 線性化重組載體感受態(tài)菌株平板挑選PCR鑒定與挑選MD和MM平板挑選挑選多拷貝外源基因轉(zhuǎn)化子G418表達(dá)鑒定與挑選mRNA程度蛋白表達(dá)程度高效表達(dá)種子工程菌發(fā)酵罐工藝建立Muts和Mut+技術(shù)道路： 根據(jù)啟動(dòng)子的特性選擇 甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如PAOX1 ，但甲醇易燃，

14、也不適用于食品消費(fèi)，這時(shí)可選擇PGAP,但不宜用于表達(dá)對(duì)宿主有毒的蛋白。強(qiáng)啟動(dòng)子能夠產(chǎn)生無功能的蛋白 由于超越宿主本身翻譯后修飾加工的才干，引起蛋白的錯(cuò)折疊、不加工或錯(cuò)定位。這是可選用較溫暖的啟動(dòng)子如PPEX8(一種過氧化物酶體基質(zhì)蛋白啟動(dòng)子)。啟動(dòng)子的選擇 目的基因的堿基組成 基因富含A+T，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提早終止 種屬特異性影響 稀有密碼子制約翻譯速率 此時(shí)需求進(jìn)展全基因的合成，使編碼序列符合畢赤酵母密碼子的偏愛性和具有更高的G+C含量。目的基因特性 相對(duì)劑量效應(yīng) 普通情況下，隨著整合拷貝數(shù)的添加，表達(dá)量也會(huì)添加，例如，1-8整合拷貝數(shù)范圍內(nèi)，HBsAg表達(dá)量成比例升高。但也有例外，如小牛溶菌

15、酶的表達(dá)隨著拷貝數(shù)從1-3的上升反而減少，這能夠與mRNA翻譯、蛋白折疊效率有關(guān)。 過高表達(dá)對(duì)分泌途徑抑制 對(duì)于分泌蛋白，過高表達(dá)會(huì)對(duì)分泌途徑產(chǎn)生負(fù)反響抑制 基因劑量 UTR對(duì)蛋白表達(dá)的影響主要外表在mRNA的翻譯程度上， 目的蛋白mRNA5UTR應(yīng)盡能夠與AOX1mRNA一樣。 Sreekrishna等經(jīng)過調(diào)整人血潔白蛋白mRNA與AOX1mRNA的5UTR一樣后表達(dá)程度提高50倍以上。 mRNA5非翻譯區(qū) 畢赤酵母糖蛋白因與哺乳動(dòng)物糖蛋白糖鏈構(gòu)造的差別而具有潛在的抗原性，使其在醫(yī)藥工業(yè)上的運(yùn)用遭到一定的制約。它們?cè)诓溉閯?dòng)物體內(nèi)可被免疫系統(tǒng)去除而失去效能，而且有引起超敏反響的危險(xiǎn)性。 處理糖

16、基化戰(zhàn)略：嘗試胞內(nèi)表達(dá)，防止目的蛋白的糖基化；對(duì)非活性中心的糖基化位點(diǎn)進(jìn)展突變改造，去除糖基化；共表達(dá)糖鏈加工酶，使糖鏈構(gòu)造接近哺乳動(dòng)物，從而降低抗原性。 翻譯后修飾l表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性l l 處理外源蛋白降解的三條根本途徑：l在培育基中參與富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物等，添加蛋白酶的底物以減少對(duì)目的蛋白的降解；l調(diào)理培育基PH值抑制蛋白酶活性；l運(yùn)用蛋白酶缺陷型菌株，如SMD1168、 SMD1165等溫度：必需選擇適宜的溫度。溫度升高，反響速率加溫度：必需選擇適宜的溫度。溫度升高，反響速率加大，生長(zhǎng)代謝加快，但溫度過高，又會(huì)使酶易因熱而大，生長(zhǎng)代謝加快，但溫度過高，又會(huì)使酶易因熱而

17、失去活性。失去活性。pH值：畢赤酵母生長(zhǎng)的值：畢赤酵母生長(zhǎng)的pH值范圍比較寬，因此應(yīng)中選值范圍比較寬，因此應(yīng)中選擇適宜外源蛋白表達(dá)的擇適宜外源蛋白表達(dá)的pH值。值。溶氧量：甲醇代謝過程中需求耗費(fèi)大量氧，因此在發(fā)溶氧量：甲醇代謝過程中需求耗費(fèi)大量氧，因此在發(fā)酵過程及時(shí)補(bǔ)充畢赤酵母代謝所需求的氧氣對(duì)于外源酵過程及時(shí)補(bǔ)充畢赤酵母代謝所需求的氧氣對(duì)于外源蛋白表達(dá)量是至關(guān)重要的。蛋白表達(dá)量是至關(guān)重要的。甲醇的濃度和監(jiān)測(cè)：在發(fā)酵過程中，需求定期補(bǔ)加一甲醇的濃度和監(jiān)測(cè)：在發(fā)酵過程中，需求定期補(bǔ)加一定量的甲醇以補(bǔ)償甲醇的耗費(fèi)和揮發(fā)。普通液體培育定量的甲醇以補(bǔ)償甲醇的耗費(fèi)和揮發(fā)。普通液體培育時(shí)，補(bǔ)加甲醇的終深度到達(dá)時(shí)，補(bǔ)加甲醇的終深度到達(dá)0.5%即可。但詳細(xì)情況需即可。但詳細(xì)情況需求根據(jù)實(shí)驗(yàn)而定，同時(shí)可以根據(jù)溶氧和氣候色譜控制求根據(jù)實(shí)驗(yàn)而定，同時(shí)可以根據(jù)溶氧和氣候色譜控制甲醇