蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)學時

1、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)（structure of protein） 為研究的方便，可將蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分為兩類： 初級結(jié)構(gòu)（primary structure）:即一級結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的最基本結(jié)構(gòu)； 高級結(jié)構(gòu)（ advanced structure ）又稱為三維結(jié)構(gòu)、立體結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)、構(gòu)象 二級結(jié)構(gòu)（secondary structure） 三級結(jié)構(gòu)(tertiary structure) 四級結(jié)構(gòu)(quaternary structure) 初級結(jié)構(gòu)與高級結(jié)構(gòu)的關系:一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)第3節(jié) 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（primary structure of proteins） 1 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的概念 （con

2、cept of proteins primary structure ） 2 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的例子胰島素（ insulin） 3 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定 4 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與功能的關系 5 肽與蛋白質(zhì)的人工合成（自學）1蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的概念（concept of proteins primary structure)） 蛋白質(zhì)的一結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸的排列順序。在基因編碼的蛋白質(zhì)中，這種序列是由mRNA中的核苷酸序列決定的即DNA分子中核苷酸的序列決定的。 蛋白質(zhì)的一結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)最基本的結(jié)構(gòu)。 其表示方法與多肽相同：從左到右，從N-末端寫到C-末端，寫出組成多肽鏈的氨基酸的三個字母或

3、單個字母的簡寫符號，氨基酸殘基之間用“-”或 “”連接。 多肽鏈中氨基酸之間的連接鍵主要是肽鍵（peptide bonde），另外有的還有二硫鍵(disulfide bond) ，有鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵之分。 二硫鍵起著穩(wěn)定空間結(jié)構(gòu)的作用，二硫鍵越多越稱穩(wěn)定，而且往往與生物活性有關。鏈間二硫鍵、鏈內(nèi)二硫鍵2 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的例子胰島素（insulin） 胰島素是動物胰臟中胰島細胞分泌的一種分子量較?。? 700）的激素蛋白質(zhì)； 其主要功能是促進糖原的合成和加速葡萄糖的氧化，從而使體內(nèi)血糖濃度降低，即低血糖效應。 分泌不足時，組織中的糖利用發(fā)生障礙，肝糖原分解加速，并從尿中排而患糖尿病，因此，臨床上

4、胰島素可用來治療糖尿病。 胰島素的一級結(jié)構(gòu)是由英國的Sanger(桑格)等于1953年首先完成的，花費了10年時間，這是蛋白質(zhì)化學研究史上一項重大成就。HGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnOH15102015A鏈711621HPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His- Leu-Val- Glu- Ala- Leu- Tyr Leu -Val-Cys-GlyGlu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-

5、AlaOHB鏈157101519 20212530SSSSSS結(jié)構(gòu)特點 1）胰島素由A、B二條鏈組成，A鏈21個氨基酸殘基（含4個Cys），B鏈30個氨基酸殘基(含2個Cys) 2）有3個二硫鍵：A6-A11（鏈內(nèi)）；A7-B7；A20-B19（鏈間） 3）沒有Trp, Met，（Asp都以Asn形式存在，共有17種氨基酸）a.使人們從根本上認識由于20種氨基酸的排列順序不同而組成不同的蛋白，并具有各種不同的生物學功能。b.許多先天性疾病是由于某一種重要的蛋白的一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而引起的，所以測定蛋白的一級結(jié)構(gòu)有助于臨床醫(yī)學上對疾病的診斷。c.因為蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)中氨基酸的排列順序是由遺傳密碼所

6、決定的，氨基酸的改變最根本的原因是DNA上的核苷酸順序發(fā)生改變所致，研究蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)可以從分子水平上診斷和治療遺傳病。核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)3 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定（主要內(nèi)容） 3.1 一級結(jié)構(gòu)測定的一般步驟(或策略) 3.2 幾個重要的測定步驟 3.3 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫3.1 一級結(jié)構(gòu)測定的一般步驟(或策略) 1）測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目； 2）拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈； 3）斷開多肽鏈內(nèi)的二硫鍵； 4）分析測定每一多肽鏈的氨基酸組成（amino acid composition）； 5）鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端的氨基酸； 6）裂解多肽鏈成較小片段； 7）測定各肽段的氨基酸序列；

7、8）確定肽段在多肽鏈中的次序，即重建完整多肽鏈的一級結(jié)構(gòu)； 9）確定多肽鏈中二硫鍵的位置。3.2 幾個重要的測定步驟（內(nèi)容） 3.2.1 肽鏈末端的測定:N-末端;C-末端 3.2.2 肽鏈的拆開和分離(-S-S-的斷裂) 3.2.3 氨基酸組成的分析測定 3.2.4 肽鏈的部分裂解:化學法, 酶法 3.2.5 肽段氨基酸序列的測定 3.2.6 肽段在多肽鏈中次序的確定 3.2.7 二硫鍵位置的確定3.2.1 肽鏈末端的測定:N-末端;C-末端 1） N-末端分析 二硝基氟苯（DNFB，或Sanger）法 丹磺酰氯(DNS)法 苯異硫氰酸酯(PITC,或Edman降解)法 氨肽酶（amino

8、peptidase）法 2）C-末端分析 肼解法 還原法 羧肽酶法二硝基氟苯（DNFB，或Sanger）法 多肽鏈的游離NH2與DNFB(又稱為Sanger試劑)反應后，生成DNP-多肽， 酸水解生成DNP-氨基酸衍生物和其它游離氨基酸， DNP-氨基酸為黃色，然后用有機溶劑(如已酸已酯)抽提出來， 用紙層析、薄層層析或高效液相層析法(HPLC)進行定性、定量測定。丹磺酰氯(DNS)法 該法原理與DNFB相同，只是將DNS代替DNFB試劑； DNS具有強烈的熒光，靈敏度比DNFB法高100倍，并且水解后的DNS-氨基酸不需要提取，可直接用紙電泳或薄層層析或熒光光度計檢測。苯異硫氰酸酯(PITC

9、，或Edman降解)法 PITC（Edman試劑）與多肽的氨基端反應生成PTC-多肽， 在酸性有機溶劑中加熱時生成PTH-氨基酸和少一個氨基酸的多肽，（PTC基只使第一個肽鍵的穩(wěn)定性下降）， 然后用有機溶劑抽提干燥后，用薄層層析、氣相色譜或HPLC等分析鑒定。 該法也可用業(yè)測定短肽的氨基酸序列，是多肽氨基酸自動測序儀的原理氨肽酶（amino peptidase）法 氨肽酶是專門水解肽鏈N-末端氨基酸的一類外切酶（exopeptidase）,它們能從多肽鏈的N-末端逐個地向里切。 根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放的氨基酸種類和數(shù)量，按反應時間和殘基釋放量作動力學曲線，就能知道該多肽鏈的N-末端

10、氨基酸是什么。 此法測定有很多困難，因酶對肽鍵的敏感性不同，常很難判斷哪個殘基在前，哪個在后。 亮氨酸氨肽酶(leucine amino peptidase,LAP)是最常用的氨肽酶，其作用位點是： (N-端) Leu(或非極性aa) CONHaa(除Pro,Hyp外)肼解法 是測定C-末端最重要的化學方法， 多肽同肼（聯(lián)氨）在無水條件下加熱，C-末端aa被切割下來以游離形式存在，而其他的aa轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳陌被狨ｋ禄衔? 氨基酸酰肼可與苯甲醛作用變?yōu)榉撬苄曰衔铮瑥亩c水溶性的C-末端氨基酸分開， C-末端氨基酸可用FDNB法或DNS法以及層析技術(shù)進行鑒定。 注意，在肼解中，Gln,Asn

11、,Cys,等被破壞，不易測出，Arg轉(zhuǎn)變?yōu)镺rn肼解反應還原法 肽鏈C-末端氨基酸能被硼氫化鋰還原為-氨基醇， 肽鏈完全水解后，代表原來C-末端氨基酸的-氨基醇，可用層析法鑒定。 Sanger早期就是采用此法鑒定胰島素A，B鏈的C-末端氨基酸的。羧肽酶（carboxypeptidase）法 羧肽酶法是最為有效、最常用的方法； 羧肽酶是一類肽鏈外切酶，它專一地從肽鏈C-末端開始逐個降解，釋放出游離氨基酸。 羧肽酶A：CH（R）CONHaa (除Pro, Arg,Lys外) 羧肽酶B：CH（R）CONHaa (Arg,Lys) 羧肽酶C：CH（R）CONHaa (除Hyp,二肽外) 羧肽酶Y：CH

12、（R）CONHaa (任何氨基酸)羧肽酶（carboxypeptidase）法圖示3.2.2 肽鏈的拆開和分離(-S-S-的斷裂) 二硫鍵的斷裂有過甲酸氧化法和巰基化合物還原法。 用過量的巰基已醇處理，同時加變性劑如8M尿素或6M鹽酸胍，然后用烷基化試劑如碘已酸保護-SH，以防止重新被氧化。還原法打開二硫鍵3.2.3 氨基酸組成的分析測定 肽鏈的水解用酸水解，同時輔以堿水解； 6M 鹽酸于110在真空或充氮的條件下水解1024h,水解后去除鹽酸，但Trp破壞；也可用甲基磺酸代替鹽酸。 堿水解用5M氫氧化鈉于110在真空或充氮的條件下水解20h左右，測出Trp。 蛋白質(zhì)的氨基酸組成一般用每mol

13、蛋白質(zhì)中含氨基酸殘基的mol數(shù)表示，或用每100g蛋白質(zhì)中含有的氨基酸克數(shù)表示。3.2.4 肽鏈的部分裂解 1）化學裂解法 溴化氰（CNBr）：MetCONHCH（R） 羥胺（NH2OH）：Asn Gly; Asn Leu; Asn Ala 2) 酶裂解法 胰蛋白酶（trypsin） 糜蛋白酶(chymotrypsin) 嗜熱菌蛋白酶(thermolysin) 胃蛋白酶(pepsin)肽鏈的部分裂解酶法3.2.5 肽段氨基酸序列的測定 1) Edman降解法 2）酶解解法 3）質(zhì)譜法 4）根據(jù)核苷酸序列的推定法3.2.6 肽段在多肽鏈中次序的確定重疊肽法例如：10個氨基酸殘基的肽鏈用A/B兩種

14、方法的到兩套肽段 方法A 方法BN-末端殘基A，C-末端殘基S1、AF AFGR2、GRLY LYKW3、KW WHS4、HS10肽的順序：AFGRLYKWHS3.2.7 二硫鍵位置的確定對角線電泳 用胃蛋白酶水解多肽鏈，把水解后的混合肽段點到濾紙的中央，在pH6.5的條件下，進行第一向電泳，肽段將按其大小及電荷 的不同分離開來。 把濾低暴露在過甲酸蒸氣中，使-S-S斷裂，含二硫鍵的肽被氧化成一對含磺基丙氨酸的肽。 濾紙旋轉(zhuǎn)900解在與第一向完全相同的條件下進行第二向電泳。 肽斑用茚三酮顯色確定，大多數(shù)肽段遷移率不變，并位于濾紙的一條對角線上，只有磺基丙氨酸的肽段偏離了對解線。 將每對含磺基丙

15、氨酸的肽段取下，進行氨基酸序列分析，然后與多肽鏈的氨基酸序列比較，即可確定二硫鍵的位置。對角線電泳圖示3.3 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（database or databank ） 著名的數(shù)據(jù)庫： 美國國家生物醫(yī)學基金會主持的PIR（Protein Information Resource,蛋白質(zhì)信息庫；或Protein Identification Resource,蛋白質(zhì)鑒定庫） 美國政府支持的Gen Bank(Gene Sequence Data Bank,基因序列數(shù)據(jù)庫) 歐洲的EMBL（European Molecular Biology Laboratory Data Bank,歐洲分子生

16、物學實驗室數(shù)據(jù)庫）4 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與功能的關系 4.1同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進化 4.2蛋白質(zhì)的激活 4.3 分子病一級結(jié)構(gòu)似，蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和功能也相似，例如：不同哺乳類動物的胰島素分子。一級結(jié)構(gòu)不同，蛋白質(zhì)功能不同。4.1同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進化 1）同源蛋白質(zhì) 2）細胞色素C 3）系統(tǒng)樹（進化樹）：物種之間進化關系的圖解幾個名詞 同源蛋白質(zhì)：在不同生物中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì), 同源蛋白質(zhì)一般具有幾乎相同長度的多肽鏈。 同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性，這種相似性稱為序列同源（sequence homology）。 同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列中有許多位置的氨基酸殘基對

17、所有已研究過的物種來說都是相同的，這樣的aa殘基稱為不變殘基（invariant residue），對生物功能起決定作用； 但其他位置的氨基酸殘基對不同物種有相當大的變化，這樣的殘基稱為可變殘基（variable resdue），殘基的變化不影響蛋白質(zhì)的功能，并且能提供物種之間親緣關系遠近的信息。2）細胞色素C細胞色素c c是廣泛存在于生物體的一類同源蛋白，一條肽鏈含有血紅素輔基。物種間親緣關系越近，細胞色素c c的一級結(jié)構(gòu)相似，其空間結(jié)構(gòu)和功能也相似。細胞色素c c的作用是在生物體內(nèi)傳遞電子。細胞色素c c的氨基酸殘基有一部分在不同的生物屬間有差異。不同物種間細胞色素C序列間氨基酸差異數(shù)目的

18、比較3）系統(tǒng)樹系統(tǒng)樹4.2蛋白質(zhì)的激活 1）血液的凝固 2）胰島素的形成凝血酶原凝血酶凝血酶作用使血纖蛋白原裂解血液凝固的激活過程2）胰島素分泌：前胰島素原胰島素原胰島素3 3）分子病 *對于維持蛋白質(zhì)功能區(qū)的特定構(gòu)象，一級結(jié)構(gòu)中某些氨基酸殘基是必需的，如果這些氨基酸殘基發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的特定構(gòu)象必將被破壞，蛋白質(zhì)的生物學活性喪失。 *由于蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導致的疾病稱為分子病。 其根本原因是基因發(fā)生變異。如：鐮刀型貧血病血紅蛋白 由此引起三級結(jié)構(gòu)多一疏水鍵，四級結(jié)構(gòu)發(fā)生線性締合，導致紅細胞發(fā)生溶血，不易透過毛細血管，血流速度減慢。-鏈 1 2 3 4 5 6 7正常：Hb-A Val-Hi

19、s-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys變異：Hb-S Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-LysHb-S 22 6 GluVal注意*并非一級結(jié)構(gòu)中所有的氨基酸都很重要。*有時蛋白質(zhì)中某個或某幾個氨基酸殘基改變，并不影響蛋白質(zhì)的功能。*有些蛋白質(zhì)的功能發(fā)揮僅與其某部位的特定構(gòu)象有關。通常稱這些特定部位為功能區(qū)。*只要蛋白質(zhì)的功能區(qū)結(jié)構(gòu)完好，蛋白質(zhì)的其它部位發(fā)生改變，不影響蛋白質(zhì)的功能。3.2.1 肽鏈末端的測定:N-末端;C-末端 1） N-末端分析 二硝基氟苯（DNFB，或Sanger）法 丹磺酰氯(DNS)法 苯異硫氰酸酯(PITC,或Edman降解)法 氨肽酶（amino

20、 peptidase）法 2）C-末端分析 肼解法 還原法 羧肽酶法苯異硫氰酸酯(PITC，或Edman降解)法 PITC（Edman試劑）與多肽的氨基端反應生成PTC-多肽， 在酸性有機溶劑中加熱時生成PTH-氨基酸和少一個氨基酸的多肽，（PTC基只使第一個肽鍵的穩(wěn)定性下降）， 然后用有機溶劑抽提干燥后，用薄層層析、氣相色譜或HPLC等分析鑒定。 該法也可用業(yè)測定短肽的氨基酸序列，是多肽氨基酸自動測序儀的原理氨肽酶（amino peptidase）法 氨肽酶是專門水解肽鏈N-末端氨基酸的一類外切酶（exopeptidase）,它們能從多肽鏈的N-末端逐個地向里切。 根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放的氨基酸種類和數(shù)量，按反應時間和殘基釋放量作動力學曲線，就能知