蛋白質(zhì)的研究方法0

1、1高高 級級 生生 物物 化化 學(xué)學(xué)2 蛋白質(zhì)的研究方法蛋白質(zhì)的研究方法 第一節(jié)第一節(jié) 蛋白質(zhì)對象的選擇和樣品的獲取蛋白質(zhì)對象的選擇和樣品的獲取3 一、研究對象的選擇一、研究對象的選擇無論何種來源的生物材料一般都含有成千上萬種不同無論何種來源的生物材料一般都含有成千上萬種不同的蛋白質(zhì)分子；的蛋白質(zhì)分子；在一種生物組織中，同時又存在著多種蛋白質(zhì)組分。在一種生物組織中，同時又存在著多種蛋白質(zhì)組分。雖然它們都具有肽鏈結(jié)構(gòu)，但在雖然它們都具有肽鏈結(jié)構(gòu)，但在分子大小分子大小、極性極性以以及及電荷電荷上會有所差異。上會有所差異。 4 選擇研究蛋白質(zhì)的原則選擇研究蛋白質(zhì)的原則： 在組織中含量比較高在組織中含

2、量比較高 相對比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)（如血液中的相對比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)（如血液中的HbHb；肌肉中的；肌肉中的 肌球蛋白和肌動蛋白等）肌球蛋白和肌動蛋白等）從模式生物基因組測序結(jié)果來看，每一種生物有機體從模式生物基因組測序結(jié)果來看，每一種生物有機體內(nèi)都還有大量的蛋白質(zhì)（內(nèi)都還有大量的蛋白質(zhì)（5050左右）從來沒有被研究左右）從來沒有被研究過。過。5獲取蛋白質(zhì)樣品的方法獲取蛋白質(zhì)樣品的方法： u直接從生物組織中提純蛋白質(zhì)直接從生物組織中提純蛋白質(zhì)為主為主u根據(jù)基因組測序獲得的信息根據(jù)基因組測序獲得的信息 （1 1）可以獲得所要研究的特定蛋白質(zhì)的）可以獲得所要研究的特定蛋白質(zhì)的AAAA序列。序列。 （先根

3、據(jù)推出的（先根據(jù)推出的AA序列合成對象蛋白中的一段肽，用它去獲得有關(guān)的抗體，序列合成對象蛋白中的一段肽，用它去獲得有關(guān)的抗體，然后用抗體去探測蛋白質(zhì)的存在，甚至可以用抗體通過親和層析純化對象然后用抗體去探測蛋白質(zhì)的存在，甚至可以用抗體通過親和層析純化對象蛋白）蛋白） （2 2）去獲得有關(guān)基因的）去獲得有關(guān)基因的cDNAcDNA全序列，然后通過重組全序列，然后通過重組DNA技術(shù)去表達重組蛋白。技術(shù)去表達重組蛋白。 有偏差，甚至完全是假象。有偏差，甚至完全是假象。 即使推測得到的蛋白質(zhì)編碼信息是對的，在細胞內(nèi)還存在轉(zhuǎn)錄后的即使推測得到的蛋白質(zhì)編碼信息是對的，在細胞內(nèi)還存在轉(zhuǎn)錄后的RNARNA加工，

4、翻譯后的蛋白質(zhì)的修飾和加工等基因序列上目前還無法反映的信息。加工，翻譯后的蛋白質(zhì)的修飾和加工等基因序列上目前還無法反映的信息。 6直接從生物組織中提純蛋白質(zhì)直接從生物組織中提純蛋白質(zhì)應(yīng)用各種分辨效果好的應(yīng)用各種分辨效果好的化學(xué)化學(xué)及及物理化學(xué)物理化學(xué)方法方法蛋白質(zhì)的分離純化包括以下過程：蛋白質(zhì)的分離純化包括以下過程：1.1. 破碎生物組織，并用適當(dāng)?shù)木彌_液將蛋白質(zhì)破碎生物組織，并用適當(dāng)?shù)木彌_液將蛋白質(zhì) 抽提出來；抽提出來； 2.2.將有關(guān)的蛋白質(zhì)分級沉淀下來將有關(guān)的蛋白質(zhì)分級沉淀下來; ; （鹽析法或有機溶劑法）（鹽析法或有機溶劑法）3.3.應(yīng)用應(yīng)用層析法層析法或或電泳法電泳法使它們各自分開使

5、它們各自分開； 4.4.蛋白質(zhì)結(jié)晶；蛋白質(zhì)結(jié)晶；5.5.蛋白質(zhì)純度鑒定和含量測定。蛋白質(zhì)純度鑒定和含量測定。7制備過程中注意事項：制備過程中注意事項： 要求自始至終保持在要求自始至終保持在天然狀態(tài)天然狀態(tài)1.1. 避免一切過激因素如：過酸或過堿，高溫，避免一切過激因素如：過酸或過堿，高溫， 重金屬等的影響。重金屬等的影響。2. 2. 通常都在低溫條件下操作。通常都在低溫條件下操作。3. 3. 盡可能使樣品中蛋白質(zhì)的濃度維持在較高盡可能使樣品中蛋白質(zhì)的濃度維持在較高 水平。水平。8二、細胞的破碎二、細胞的破碎 少數(shù)蛋白質(zhì)少數(shù)蛋白質(zhì)-存在于細胞外面的（如血液和體液中等），存在于細胞外面的（如血液和

6、體液中等）， 大多數(shù)蛋白質(zhì)大多數(shù)蛋白質(zhì)-都存在于細胞的里面。都存在于細胞的里面。 一般固形生物材料首先都必須加以破碎，一般固形生物材料首先都必須加以破碎， 以釋放出細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組分。以釋放出細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組分。 生物材料生物材料 必須新鮮必須新鮮 1. 1. 材料材料 -80-80 2. 2. 或者制成干粉（丙酮）或者制成干粉（丙酮） 3. 3. 低溫存放低溫存放 破碎的方法：破碎的方法：1. 機械破碎法機械破碎法：利用利用機械機械力的攪切作用，使細胞研碎力的攪切作用，使細胞研碎 高速攪切器、玻璃勻漿器、家用攪肉器、研缽、高速攪切器、玻璃勻漿器、家用攪肉器、研缽、 玻璃珠高速勻漿器以及靜壓器

7、（高壓破碎）。玻璃珠高速勻漿器以及靜壓器（高壓破碎）。2.滲透破碎法滲透破碎法：利用低滲條件，使細胞溶脹破碎。利用低滲條件，使細胞溶脹破碎。紅血球放于水中，便發(fā)生自溶。紅血球放于水中，便發(fā)生自溶。 3.交替凍融法交替凍融法：生物組織經(jīng)凍結(jié)后，細胞內(nèi)液結(jié)冰生物組織經(jīng)凍結(jié)后，細胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹，而使細胞脹破。膨脹，而使細胞脹破。4.超聲波法超聲波法： 利用超聲波震蕩，使細胞膜上所受張利用超聲波震蕩，使細胞膜上所受張 力不均而解體。力不均而解體。5.酶消化法酶消化法： 利用蛋白酶、溶菌酶、蝸牛復(fù)合酶等利用蛋白酶、溶菌酶、蝸牛復(fù)合酶等 對細胞膜或細胞壁的分解作用，使它對細胞膜或細胞壁的分解作用，使它 們

8、解體們解體10*抽提作用抽提作用： 生物材料在破碎的過程中，通常被浸在生物材料在破碎的過程中，通常被浸在適當(dāng)?shù)木彌_液中，使細胞中的蛋白質(zhì)等內(nèi)容適當(dāng)?shù)木彌_液中，使細胞中的蛋白質(zhì)等內(nèi)容物釋放到這種溶液中去。物釋放到這種溶液中去。膜蛋白的處理：復(fù)雜膜蛋白的處理：復(fù)雜 細胞膜的結(jié)構(gòu)細胞膜的結(jié)構(gòu)12按其所在按其所在位置位置大體可分為：大體可分為：兩種類型兩種類型 外周蛋白（外周蛋白（通過次級鍵和外膜脂質(zhì)的通過次級鍵和外膜脂質(zhì)的極性頭極性頭螯合在一起）螯合在一起） 固有蛋白（固有蛋白（嵌合在膜雙層中，它通過嵌合在膜雙層中，它通過疏水作用疏水作用 與與膜內(nèi)部脂質(zhì)層膜內(nèi)部脂質(zhì)層的疏水性尾部相結(jié)合的疏水性尾部相

9、結(jié)合 具有具有螺旋結(jié)構(gòu)）螺旋結(jié)構(gòu)）外周蛋白外周蛋白-選擇適當(dāng)離子強度及選擇適當(dāng)離子強度及PHPH的含有的含有EDTAEDTA的的 緩沖液抽提（高鹽溶液）緩沖液抽提（高鹽溶液）固有蛋白固有蛋白-？13* *增溶作用：增溶作用： 抽提固有蛋白質(zhì)時，既要削弱它與抽提固有蛋白質(zhì)時，既要削弱它與膜脂的疏水性結(jié)合，又要使它仍保持疏膜脂的疏水性結(jié)合，又要使它仍保持疏水基暴露在外的水基暴露在外的天然狀態(tài)天然狀態(tài)，這一過程通，這一過程通常稱為增溶作用。常稱為增溶作用。14 常用的增溶試劑有：常用的增溶試劑有： 有機溶劑有機溶劑-易使蛋白質(zhì)變性易使蛋白質(zhì)變性離液性離子離液性離子-CNCN- -、CIOCIO4 4

10、- -及及I I- -等雖能削弱疏水等雖能削弱疏水 作用，也易使蛋白質(zhì)變性。作用，也易使蛋白質(zhì)變性。磷酸酯酶磷酸酯酶-水解去磷酯，只適用于那些僅僅部水解去磷酯，只適用于那些僅僅部 分插入雙層的膜蛋白分插入雙層的膜蛋白. . 去污劑去污劑-同時包含有疏水和親水部分同時包含有疏水和親水部分. . 按其結(jié)構(gòu)特征按其結(jié)構(gòu)特征: :陰（陽）離子去污劑陰（陽）離子去污劑 兩性離子去污劑兩性離子去污劑 非離子型去污劑等。非離子型去污劑等。 去污劑去污劑：一類具有一類具有 親水性頭部親水性頭部 疏性尾巴疏性尾巴 的雙親性（的雙親性（amphipathicamphipathic）脂類分子）脂類分子作用：作用：

11、既可以破壞細胞的既可以破壞細胞的磷脂雙層結(jié)構(gòu)磷脂雙層結(jié)構(gòu)，又可以與具有，又可以與具有疏水性表面的疏水性表面的膜蛋白結(jié)合膜蛋白結(jié)合，從而阻止釋放出來的膜蛋，從而阻止釋放出來的膜蛋白通過疏水相互作用形成大的、可沉淀的聚集體。白通過疏水相互作用形成大的、可沉淀的聚集體。 16臨界微團濃度臨界微團濃度（critical micelle concentration，CMC)： 每一種去污劑都具有一特征性的每一種去污劑都具有一特征性的CMC。 CMCCMC值與其分子中值與其分子中疏水部分疏水部分與與親水部分親水部分的結(jié)構(gòu)有的結(jié)構(gòu)有 關(guān)。關(guān)。 當(dāng)當(dāng) 去污劑去污劑 低于此值的時候，去污劑分子在水溶液低于此值的

12、時候，去污劑分子在水溶液中將不形成微團，達到此值的時候，微團開始形成。中將不形成微團，達到此值的時候，微團開始形成。 17有的有的去污劑的親水性頭部可離子化去污劑的親水性頭部可離子化（即含有一帶電基團）（即含有一帶電基團）如如： 脫氧膽酸鈉（脫氧膽酸鈉（sodium deoxycholatesodium deoxycholate）和）和 十二烷基硫酸鈉（十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfatesodium dodecylsulfate，SDSSDS）等）等；有的有的去污劑不能解離，所以分子中缺少帶電基團去污劑不能解離，所以分子中缺少帶電基團，如：如： Triton X-100

13、 Triton X-100，辛基葡萄糖苷，辛基葡萄糖苷( octylglucoside( octylglucoside）等。）等。18 離子化去污劑（離子化去污劑（SDSSDS）：作用：作用： 其其“疏水尾巴疏水尾巴”破壞蛋白質(zhì)分子的疏水性部分的結(jié)構(gòu)，破壞蛋白質(zhì)分子的疏水性部分的結(jié)構(gòu)， 其帶電的其帶電的“頭部頭部”破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和離子鍵。破壞蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和離子鍵。作用的結(jié)果是作用的結(jié)果是：使任何蛋白（不管是膜蛋白還是水溶性：使任何蛋白（不管是膜蛋白還是水溶性 蛋白）都蛋白）都，并，并溶溶 液中，同時液中，同時。在部分情況下，當(dāng)去污劑被透析掉后，蛋白質(zhì)可以復(fù)性在部分情況下，當(dāng)去污劑

14、被透析掉后，蛋白質(zhì)可以復(fù)性并恢復(fù)生物活性。并恢復(fù)生物活性。 19SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel SDS-polyacrylamide gel electrophoresiselectrophoresis，SDS-PAGESDS-PAGE）：）：就是利用就是利用SDSSDS的這種結(jié)合在整個蛋白分子上，并使蛋白的這種結(jié)合在整個蛋白分子上，并使蛋白完全變性的特性。完全變性的特性。這樣經(jīng)過這樣經(jīng)過SDSSDS變性的蛋白質(zhì)在電場中完全變性的蛋白質(zhì)在電場中完全按大小按大小分離開。分離開。 20非離子去污劑非離子去污劑：相對溫和，一般相對

15、溫和，一般不會使蛋白質(zhì)變性不會使蛋白質(zhì)變性。只是將蛋白質(zhì)。只是將蛋白質(zhì)分子從膜上溶解下來而已。分子從膜上溶解下來而已。當(dāng)當(dāng) 去污劑去污劑 其其CMCCMC值的時候，去污劑分子與膜蛋值的時候，去污劑分子與膜蛋白表面的疏水區(qū)域結(jié)合，使蛋白質(zhì)在水溶液中溶解白表面的疏水區(qū)域結(jié)合，使蛋白質(zhì)在水溶液中溶解而不聚集。而不聚集。當(dāng)當(dāng) 去污劑去污劑 其其CMCCMC值的時候，去污劑分子將與膜值的時候，去污劑分子將與膜磷脂一起形成混合微團，膜蛋白以整合在微團中的磷脂一起形成混合微團，膜蛋白以整合在微團中的形式存在。形式存在。一般選擇非離子去污劑一般選擇非離子去污劑來來保持膜蛋白生物活性保持膜蛋白生物活性 22 2

16、3 穩(wěn)定劑：穩(wěn)定劑：防止蛋白質(zhì)分子可能被同時釋放的蛋白質(zhì)水解酶降解、防止蛋白質(zhì)分子可能被同時釋放的蛋白質(zhì)水解酶降解、Pr空間結(jié)構(gòu)可能被溫度或化學(xué)試劑等環(huán)境因素破壞而空間結(jié)構(gòu)可能被溫度或化學(xué)試劑等環(huán)境因素破壞而喪失生物學(xué)活性等。喪失生物學(xué)活性等。處理處理：需要在緩沖液中加入蛋白酶抑制劑；：需要在緩沖液中加入蛋白酶抑制劑； 在低溫下操作；在低溫下操作； 加入穩(wěn)定劑加入穩(wěn)定劑(如甘油等）如甘油等）24細胞碎片的去除細胞碎片的去除離心離心( centrifugation)( centrifugation) 原理：懸浮在溶液中的兩個或多個不同質(zhì)量或密度原理：懸浮在溶液中的兩個或多個不同質(zhì)量或密度的顆粒（

17、如細胞、細胞器、大分子復(fù)合體、或分子的顆粒（如細胞、細胞器、大分子復(fù)合體、或分子等）沉降到試管的底部的速度是不一樣的，質(zhì)等）沉降到試管的底部的速度是不一樣的，質(zhì)量越大、或密度越高沉降的速度越快。量越大、或密度越高沉降的速度越快。沉淀：固體性的細胞碎片和細胞器沉降到離心管的沉淀：固體性的細胞碎片和細胞器沉降到離心管的底部形成；底部形成；上清：絕大多數(shù)蛋白分子或蛋白復(fù)合體保留在細胞上清：絕大多數(shù)蛋白分子或蛋白復(fù)合體保留在細胞抽提液中即上清中抽提液中即上清中 25 三、目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離、純化三、目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離、純化 -蛋白質(zhì)的分級沉淀和層析分離蛋白質(zhì)的分級沉淀和層析分離將不同蛋白質(zhì)分開的性質(zhì)主要包

18、括：將不同蛋白質(zhì)分開的性質(zhì)主要包括： 分子量的大小分子量的大小 帶電情況帶電情況 水溶性水溶性 與某種物質(zhì)的特異高親和力等與某種物質(zhì)的特異高親和力等 26 （一）蛋白質(zhì)的分級沉淀（一）蛋白質(zhì)的分級沉淀 常用的方法有常用的方法有鹽析法鹽析法和和有機溶劑法有機溶劑法。 蛋白質(zhì)顆粒表面有一層水膜蛋白質(zhì)顆粒表面有一層水膜，也稱水化層。水化層，也稱水化層。水化層的存在使蛋白質(zhì)顆粒相互隔開，不會聚集成大顆粒的存在使蛋白質(zhì)顆粒相互隔開，不會聚集成大顆粒而沉淀。而沉淀。蛋白質(zhì)有兩性解離性質(zhì)蛋白質(zhì)有兩性解離性質(zhì)。如果溶液的。如果溶液的PHPH值偏離了值偏離了PIPI，所有分子都帶相同電荷，又會進一步增進它們的分

19、所有分子都帶相同電荷，又會進一步增進它們的分散能力。散能力。 27#28等電點（等電點（PIPI）：）：1.1.能破壞蛋白質(zhì)分子水化作用能破壞蛋白質(zhì)分子水化作用2.2.是減弱分子間同性相斥作用的因子是減弱分子間同性相斥作用的因子 PI PI能降低蛋白質(zhì)在水中的溶解度，使能降低蛋白質(zhì)在水中的溶解度，使PrPr 29 鹽析法鹽析法 概念概念：蛋白質(zhì)在不同濃度的蛋白質(zhì)在不同濃度的中性鹽中性鹽溶液中溶液中溶解度溶解度 有不同程度的降低，采用添加有不同程度的降低，采用添加中性鹽中性鹽的方法的方法 使各種蛋白質(zhì)依次分別沉淀出來的方法。使各種蛋白質(zhì)依次分別沉淀出來的方法。 優(yōu)點：操作簡便優(yōu)點：操作簡便 對易

20、變性的蛋白質(zhì)有一定的保護作用，對易變性的蛋白質(zhì)有一定的保護作用， 適用范圍十分廣泛。適用范圍十分廣泛。 缺點：分辨能力差，純化倍數(shù)低缺點：分辨能力差，純化倍數(shù)低301 1鹽析基本原理鹽析基本原理在蛋白質(zhì)水溶液中添加無機鹽，可以產(chǎn)生兩種在蛋白質(zhì)水溶液中添加無機鹽，可以產(chǎn)生兩種影響：影響： (1)(1)鹽離子鹽離子與與PrPr分子分子中的中的 極性基團極性基團 離子基團離子基團 作用作用 降低降低PrPr分子的活度系數(shù)，趨使其溶解度分子的活度系數(shù)，趨使其溶解度 。(2)(2)鹽離子鹽離子也與也與水水這種偶極分子作用，使水分子的活這種偶極分子作用，使水分子的活 度降低，導(dǎo)致度降低，導(dǎo)致PrPr水合程

21、度的減少，從而趨使水合程度的減少，從而趨使PrPr溶溶 解度解度 。31 * *鹽溶（鹽溶（salting in)salting in)-當(dāng)溶液中的鹽離子強度比較當(dāng)溶液中的鹽離子強度比較低的時候，蛋白質(zhì)的溶解度會隨著鹽濃度的增加而低的時候，蛋白質(zhì)的溶解度會隨著鹽濃度的增加而增加，這種現(xiàn)象叫做增加，這種現(xiàn)象叫做.* *鹽析（鹽析（salting out )-salting out )-但當(dāng)溶液中的鹽離子強度但當(dāng)溶液中的鹽離子強度比較高的時候，蛋白質(zhì)的溶解度會隨著鹽濃度的增比較高的時候，蛋白質(zhì)的溶解度會隨著鹽濃度的增加而降低，這種現(xiàn)象叫做加而降低，這種現(xiàn)象叫做 . .一定的鹽濃度下，每一種蛋白都有

22、一不同的特異溶一定的鹽濃度下，每一種蛋白都有一不同的特異溶解度。解度。 322 影響鹽析作用的因素影響鹽析作用的因素（1 1）鹽的種類）鹽的種類（2 2）PHPH和溫度和溫度# #（3 3）蛋白質(zhì)濃度）蛋白質(zhì)濃度% %33（1 1）鹽的種類）鹽的種類對同一種對同一種PrPr而言，價數(shù)愈高的鹽離子，鹽析能力而言，價數(shù)愈高的鹽離子，鹽析能力也愈強也愈強: : PO3-4SO42-C2O42-（CHOHCOO-）2 ACCLNO3-Br -I-CNS- K+Rb+Na+Cs+Li+NH4+ 負(fù)離子價數(shù)較高的中性鹽（如硫酸鹽、磷酸鹽等）負(fù)離子價數(shù)較高的中性鹽（如硫酸鹽、磷酸鹽等）的的KsKs值常較一價

23、中性鹽的值常較一價中性鹽的KsKs值高。值高。 Ks:鹽析常數(shù)（價數(shù)較高時，鹽析常數(shù)（價數(shù)較高時，Ks 值也較大）。代表鹽析的效率，值也較大）。代表鹽析的效率， 是與是與Pr及鹽種類有關(guān)及鹽種類有關(guān) 的特性常數(shù)。的特性常數(shù)。34硫酸銨硫酸銨（常用鹽析劑）（常用鹽析劑） 優(yōu)點：鹽析能力較強優(yōu)點：鹽析能力較強 具有較高的溶解度具有較高的溶解度 較低的溶解度溫度系數(shù)較低的溶解度溫度系數(shù) 價格低廉價格低廉 不產(chǎn)生副作用。不產(chǎn)生副作用。 缺點：緩沖能力較差缺點：緩沖能力較差 PHPH難控制難控制# #35（2 2）PHPH和溫度和溫度S S。代表蛋白質(zhì)在無機鹽溶液中的溶解度。代表蛋白質(zhì)在無機鹽溶液中的溶

24、解度 除取決于除取決于PrPr的種類，還受的種類，還受PHPH及溫度影響及溫度影響: : PH=PI PH=PI時，時，S S。的數(shù)值極小。的數(shù)值極小 S S。隨溫度增加而減低。隨溫度增加而減低。鹽析過程中，若增高溫度，有助于鹽析過程中，若增高溫度，有助于PrPr的析出。的析出。# #36（3 3）蛋白質(zhì)濃度）蛋白質(zhì)濃度 PrPr較高較高，在較低無機鹽濃度時，在較低無機鹽濃度時, ,蛋白質(zhì)便開蛋白質(zhì)便開 始析出，鹽析界限比較寬。始析出，鹽析界限比較寬。 PrPr較低較低，需要無機鹽的濃度也高，即鹽析，需要無機鹽的濃度也高，即鹽析 界限變窄。界限變窄。 解決辦法解決辦法：對于高濃度的蛋白質(zhì)對于高

25、濃度的蛋白質(zhì) 可以應(yīng)用可以應(yīng)用稀釋稀釋作用來調(diào)節(jié)鹽析濃作用來調(diào)節(jié)鹽析濃 度界限，有利于混合物的分離。度界限，有利于混合物的分離。 37 蛋白質(zhì)濃度愈高，所需鹽的飽和度極限愈低。蛋白質(zhì)濃度愈高，所需鹽的飽和度極限愈低。 但蛋白質(zhì)濃度愈高時，其他蛋白質(zhì)的共沉淀作用但蛋白質(zhì)濃度愈高時，其他蛋白質(zhì)的共沉淀作用 也愈強也愈強 所以當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液太濃時，應(yīng)適當(dāng)稀釋，所以當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液太濃時，應(yīng)適當(dāng)稀釋， 通常在通常在2.52.53.03.0之間比較合適。之間比較合適。381.1.基本原理一基本原理一（1）在）在PI附近，附近，Pr主要以偶極離子形式存在。此時若添加主要以偶極離子形式存在。此時若添加 有機溶劑，

26、由于有機溶劑，由于有機溶劑有機溶劑有較低的介電常數(shù)，可使溶液有較低的介電常數(shù)，可使溶液 介電常數(shù)介電常數(shù)減小，增強了偶極離子間靜電引力，從而使分減小，增強了偶極離子間靜電引力，從而使分 子集合而沉淀出來。子集合而沉淀出來。（2）有機溶劑有機溶劑本身的水合作用會破壞本身的水合作用會破壞Pr表面的水合層，也表面的水合層，也 促使促使Pr變得不穩(wěn)定而聚集析出變得不穩(wěn)定而聚集析出. Q1 Q2庫侖定律庫侖定律： F = 2 F：2 2個帶電質(zhì)點之間的相互作用力個帶電質(zhì)點之間的相互作用力 ：2 2個帶電質(zhì)點之間的距離個帶電質(zhì)點之間的距離 ：介電常數(shù)介電常數(shù)有機溶劑法有機溶劑法 分辨力比鹽析方法高，提純效

27、果好分辨力比鹽析方法高，提純效果好 39 溶劑溶劑 介電常數(shù)介電常數(shù) 乙醚乙醚 4.33 丙酮丙酮 21.4 乙醇乙醇 21 甲醇甲醇 33 水水 -80 甘氨酸溶液甘氨酸溶液 137 （2.5M） 在低在低的環(huán)境中，的環(huán)境中，PrPr上基團間的作用力會受上基團間的作用力會受到影響到影響, , 超過限度時，使蛋白質(zhì)變性。超過限度時，使蛋白質(zhì)變性。40 解決辦法：解決辦法：1.1.有機溶劑沉淀一般都須控制在低溫條件下進行。有機溶劑沉淀一般都須控制在低溫條件下進行。2.2.添加甘添加甘AAAA，調(diào)節(jié)溶液中的介電常數(shù)不致過低，調(diào)節(jié)溶液中的介電常數(shù)不致過低， 創(chuàng)造合適的分離條件。創(chuàng)造合適的分離條件。

28、另：蛋白質(zhì)本身是多價離子，對溶液介電常數(shù)另：蛋白質(zhì)本身是多價離子，對溶液介電常數(shù) 有相當(dāng)貢獻。有相當(dāng)貢獻。 ( (當(dāng)?shù)爱?dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度太低時，如添加有機溶劑過度白質(zhì)濃度太低時，如添加有機溶劑過度 會產(chǎn)生變性現(xiàn)象，這時加入甘會產(chǎn)生變性現(xiàn)象，這時加入甘AAAA等物質(zhì)，可等物質(zhì)，可 以避免蛋白質(zhì)變性以避免蛋白質(zhì)變性) )。41 2. 2. 影響有機溶劑沉淀影響有機溶劑沉淀PrPr的因素的因素 （1 1） PHPH值值 PH=PIPH=PI時時 蛋白質(zhì)的溶解度最低。按蛋白質(zhì)的溶解度最低。按PIPI來調(diào)節(jié)來調(diào)節(jié)PHPH值，值， 有利于分離。有利于分離。 （2 2）蛋白質(zhì)濃度）蛋白質(zhì)濃度 PrPr越高，加入一

29、定量有機溶劑后，越高，加入一定量有機溶劑后，PrPr析出越多。析出越多。 此時溶液的此時溶液的也相應(yīng)提高，可以減少也相應(yīng)提高，可以減少PrPr的變性。的變性。 Pr Pr越高越高,Pr,Pr分子間作用引起的共沉淀現(xiàn)象也顯著分子間作用引起的共沉淀現(xiàn)象也顯著 增強，這樣分離效果差，不利于分級沉淀。增強，這樣分離效果差，不利于分級沉淀。 只有選擇恰當(dāng)?shù)闹挥羞x擇恰當(dāng)?shù)腜rPr才有可能獲得良好的分高效果才有可能獲得良好的分高效果。42（3 3）離子強度）離子強度 中性鹽的加入能促使中性鹽的加入能促使PrPr在有機溶劑中溶解，在有機溶劑中溶解， 并且能防止并且能防止PrPr的變性。但含鹽過多，卻會使的變性

30、。但含鹽過多，卻會使PrPr 過度析出，不利于分級沉淀。過度析出，不利于分級沉淀。 一般一般0.05M0.05M的稀鹽溶液。的稀鹽溶液。（4 4）多價陽離子）多價陽離子 PrPr與多價的陽離子如（與多價的陽離子如（ ZnZn2+2+、 CuCu2+2+等）能結(jié)等）能結(jié) 合成復(fù)合物。這種復(fù)合物在有機溶劑中往往使合成復(fù)合物。這種復(fù)合物在有機溶劑中往往使PrPr 溶解度變小。溶解度變小。 43 ( (二）二）蛋白質(zhì)的層析分離法蛋白質(zhì)的層析分離法 （色譜法）（色譜法）最基本的特征：最基本的特征： 固定相固定相 流動相流動相44 原理原理 各種物質(zhì)得以分離的最基本原因：就在于它們在這各種物質(zhì)得以分離的最

31、基本原因：就在于它們在這 兩個相之間具有不同的分配系數(shù)兩個相之間具有不同的分配系數(shù). .兩相作相對運動時，兩相作相對運動時， 這些物質(zhì)在兩相間進行多次的分配，即使它們的分這些物質(zhì)在兩相間進行多次的分配，即使它們的分 配系數(shù)只有微小的差異，通過這個過程也能得到最配系數(shù)只有微小的差異，通過這個過程也能得到最 大的分離效果。大的分離效果。45 層析分離能力的實質(zhì)層析分離能力的實質(zhì)物質(zhì)的分配問題物質(zhì)的分配問題 *分配系數(shù)：分配系數(shù)： 當(dāng)一種溶質(zhì)分布在兩個互不相溶的溶劑中時，它在固當(dāng)一種溶質(zhì)分布在兩個互不相溶的溶劑中時，它在固定相和移動相兩相內(nèi)的定相和移動相兩相內(nèi)的濃度之比濃度之比是一個常數(shù)，這稱為分是

32、一個常數(shù)，這稱為分配系數(shù)配系數(shù)。 C1 K = C2 *質(zhì)量分配系數(shù)：質(zhì)量分配系數(shù)：若不用濃度而用若不用濃度而用物質(zhì)的絕對量的比值物質(zhì)的絕對量的比值來表示，則稱為質(zhì)來表示，則稱為質(zhì)量分配系數(shù)即：量分配系數(shù)即： Vs D= K Vm Vs : 固定相的體積固定相的體積 Vm : 流動相的體積流動相的體積46 層析種類：層析種類： 氣相層析氣相層析 按按兩相狀態(tài)兩相狀態(tài)來分來分 液相層析液相層析 吸附層析吸附層析 分配層析分配層析 按按層析機理層析機理來分來分 離子交換層析離子交換層析 凝膠排阻層析凝膠排阻層析 親和層析親和層析 柱層析柱層析 按按操作方式操作方式來分來分 薄層層析薄層層析 紙層析

33、紙層析層析法分離、純化層析法分離、純化：Pr、多肽和多肽和AA47 離子交換層析法離子交換層析法*原理：原理：陰（陽）離子交換樹脂顆粒（作為固定相）陰（陽）離子交換樹脂顆粒（作為固定相） 填充在層析柱內(nèi)，由于陰（陽）離子交換樹填充在層析柱內(nèi)，由于陰（陽）離子交換樹 脂顆粒上帶正（負(fù)）電荷，能吸引溶液中的脂顆粒上帶正（負(fù)）電荷，能吸引溶液中的 陰（陽）離子。然后再用含陰（陽）離子的陰（陽）離子。然后再用含陰（陽）離子的 溶液洗柱。含負(fù)電量小的蛋白質(zhì)首先被洗脫溶液洗柱。含負(fù)電量小的蛋白質(zhì)首先被洗脫 下來，增加陰離子濃度，含負(fù)電量多的蛋白下來，增加陰離子濃度，含負(fù)電量多的蛋白 質(zhì)也被洗脫下來，于是兩

34、種蛋白質(zhì)被分開。質(zhì)也被洗脫下來，于是兩種蛋白質(zhì)被分開。48固定相：固定相：1.1.纖維素纖維素- - DEAE DEAE纖維素、纖維素、 CM CM纖維素纖維素2.2.葡聚糖葡聚糖49u纖維素纖維素 : : 骨架為柔性長鏈骨架為柔性長鏈1.1.加入量加入量-加入層析柱的蛋白質(zhì)量通常纖維素量加入層析柱的蛋白質(zhì)量通常纖維素量 的十分之一。的十分之一。2.2.提高分辨率，樣品體積應(yīng)盡可能地少。提高分辨率，樣品體積應(yīng)盡可能地少。3.3.在洗脫時，可以通過在洗脫時，可以通過改變洗脫緩沖液的改變洗脫緩沖液的PHPH， 而使蛋白質(zhì)分子電荷減少而被解吸下來，也而使蛋白質(zhì)分子電荷減少而被解吸下來，也 可以通過可

35、以通過提高洗脫緩沖液中離子強度提高洗脫緩沖液中離子強度，減弱，減弱 蛋白質(zhì)分子與載體親和力的辦法，將蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)分子與載體親和力的辦法，將蛋白質(zhì) 組分逐一洗脫下來。組分逐一洗脫下來。50u葡聚糖的離子交換樹脂葡聚糖的離子交換樹脂: :骨架為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)骨架為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 優(yōu)點優(yōu)點：1. 1. 同時具有分子篩的作用同時具有分子篩的作用2. 2. 因其高度的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，所帶有的交換基團也比纖維因其高度的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，所帶有的交換基團也比纖維 素多得多。交換容量為離子交換纖維素的素多得多。交換容量為離子交換纖維素的3 35 5倍。倍。 缺點：缺點： 它的床體積常受它的床體積常受PHPH或鹽濃度影響而變化，

36、對分離或鹽濃度影響而變化，對分離效果有一定程度的干擾。效果有一定程度的干擾。 51凝膠排阻層析凝膠排阻層析又稱又稱分子篩或凝膠過濾分子篩或凝膠過濾（gel filtrationgel filtration）原理：原理：載體為有一定孔徑的多孔性親水性凝膠。載體為有一定孔徑的多孔性親水性凝膠。當(dāng)分子大小不同的混合物通過這種凝膠當(dāng)分子大小不同的混合物通過這種凝膠柱時，直徑大于孔徑的分子將不能進入柱時，直徑大于孔徑的分子將不能進入凝膠內(nèi)部，便直接沿膠粒間隙流出凝膠內(nèi)部，便直接沿膠粒間隙流出（全排出）。較小的分子進入能容納它（全排出）。較小的分子進入能容納它的孔穴，繞道而行，在柱內(nèi)保留時間就的孔穴，繞道

37、而行，在柱內(nèi)保留時間就比較長。這樣，較大的分子被先洗脫下比較長。這樣，較大的分子被先洗脫下來，而較小的分子后被洗脫下來，從而來，而較小的分子后被洗脫下來，從而達到相互分離的目的達到相互分離的目的. .5253常用過濾層析凝膠的截留分子量范圍54用作凝膠的載體物質(zhì)有三類用作凝膠的載體物質(zhì)有三類： u 交聯(lián)葡聚糖凝膠交聯(lián)葡聚糖凝膠 商品名為商品名為 Sephadex GSephadex Gu 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 商品名為商品名為Bio-gel PBio-gel P ( (丙烯酰胺丙烯酰胺 + N+ N，N N- -次甲基二丙烯酰胺聚合而成次甲基二丙烯酰胺聚合而成 P P值表示不同的交聯(lián)度

38、值表示不同的交聯(lián)度) )u 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 商品名為商品名為 SepharoseSepharose或或 Bio-gel ABio-gel A （從海藻瓊脂中分離除去瓊脂膠后的中性級成分從海藻瓊脂中分離除去瓊脂膠后的中性級成分 是是D-D-半乳糖和半乳糖和3,6-3,6-脫水脫水-L-L-半乳糖相間重復(fù)結(jié)半乳糖相間重復(fù)結(jié) 合而成的鏈狀化合物）合而成的鏈狀化合物）55瓊脂糖凝膠優(yōu)點：瓊脂糖凝膠優(yōu)點：1.1.其機械強度比葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝其機械強度比葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝 膠好得多。膠好得多。2.2.對蛋白質(zhì)等高分子的吸附作用也小得多對蛋白質(zhì)等高分子的吸附作用也小得多3.3.適用分子量

39、的范圍寬，最大可以到適用分子量的范圍寬，最大可以到10108 8。56凝膠排阻層析的應(yīng)用：凝膠排阻層析的應(yīng)用：1.1.作為分析工具作為分析工具 ( (分子量差別大的物質(zhì)分子量差別大的物質(zhì)) ) 2.2.作為脫鹽工具作為脫鹽工具(Sephadex G-25)(Sephadex G-25)3.3.高分子溶液的濃縮高分子溶液的濃縮 ( (不穩(wěn)定的高分子不穩(wěn)定的高分子) )4.4.去除熱原物質(zhì)去除熱原物質(zhì)(DEAE-A-25)(DEAE-A-25)5.5.物質(zhì)的分離提純物質(zhì)的分離提純6.6.用于測定高分子物質(zhì)的分子量用于測定高分子物質(zhì)的分子量57吸附層析法吸附層析法原理：原理：柱層析中，含有柱層析中，

40、含有Pr分子的混合物隨流動相通分子的混合物隨流動相通 過由過由吸附劑吸附劑組成的固定相時，組成的固定相時，Pr分子通過各分子通過各 種次級作用能夠吸附在吸附劑上種次級作用能夠吸附在吸附劑上,由于不同分由于不同分 子的吸附能力不同，可以通過洗脫使它們逐子的吸附能力不同，可以通過洗脫使它們逐 一解脫出來，而使混合物得以分離。一解脫出來，而使混合物得以分離。優(yōu)點：優(yōu)點：1.1.物理吸附，吸附能量比較低，洗脫也比較容易。物理吸附，吸附能量比較低，洗脫也比較容易。2.2.操作簡便，吸附劑容易獲得，價格較低廉操作簡便，吸附劑容易獲得，價格較低廉 58固定相固定相：吸附劑吸附劑磷酸鈣凝膠磷酸鈣凝膠磷酸鈣膠磷

41、酸鈣膠CaCa3 3（POPO4 4）2 2磷酸氫鈣膠磷酸氫鈣膠CaHPOCaHPO4 42H2H2 2O O羥基磷酸鈣膠羥基磷酸鈣膠CaCa5 5（POPO4 4）3 3OH OH 羥基磷灰石羥基磷灰石 磷酸鈣膠對蛋白質(zhì)的吸附作用原理磷酸鈣膠對蛋白質(zhì)的吸附作用原理: :主要是由于主要是由于 . Ca. Ca2+2+與與PrPr負(fù)電荷性基團負(fù)電荷性基團 結(jié)合。結(jié)合。 . . 磷酸基團與磷酸基團與PrPr正電荷基團正電荷基團59 流動相流動相： 洗脫劑洗脫劑-檸檬酸鹽檸檬酸鹽作用：檸檬酸離子因與作用：檸檬酸離子因與CaCa2+2+有更強的相互作用，有更強的相互作用， 它能大大它能大大降低降低蛋白

42、質(zhì)和凝膠的吸附能力。蛋白質(zhì)和凝膠的吸附能力。 NaClNaCl，KCIKCI甚至濃度高達甚至濃度高達3M3M時，也不影響時，也不影響PrPr負(fù)電荷負(fù)電荷的吸附，相反這些鹽可以大大降低的吸附，相反這些鹽可以大大降低PrPr正電荷的吸附。因正電荷的吸附。因此在高濃度的這些鹽溶液中應(yīng)用羥基磷灰石進行層析時，此在高濃度的這些鹽溶液中應(yīng)用羥基磷灰石進行層析時，可以專門吸附酸性蛋白質(zhì)及中性蛋白質(zhì)而排除堿性蛋白可以專門吸附酸性蛋白質(zhì)及中性蛋白質(zhì)而排除堿性蛋白質(zhì)。質(zhì)。60親和層析法親和層析法1.1.原理原理：利用生物高分子具有能和某些相對應(yīng)的專一：利用生物高分子具有能和某些相對應(yīng)的專一 分子可逆結(jié)合的特性。分

43、子可逆結(jié)合的特性。 如，如，酶的活性部位能和底物酶的活性部位能和底物 抑制劑抑制劑 輔助因子專輔助因子專 一性地結(jié)合一性地結(jié)合, ,改變條件又能使這種結(jié)合解除改變條件又能使這種結(jié)合解除. . 酶的變構(gòu)中心與變構(gòu)因子（或稱效應(yīng)物）之酶的變構(gòu)中心與變構(gòu)因子（或稱效應(yīng)物）之 間、抗體與抗原之間、激素與受體之間，結(jié)間、抗體與抗原之間、激素與受體之間，結(jié) 合蛋白與結(jié)合物之間合蛋白與結(jié)合物之間 。 這些被作用的對象物質(zhì)稱之為這些被作用的對象物質(zhì)稱之為配基（配基（ligand) ligand) 。 61固定相固定相-配基配基固定在固定在固相載體固相載體上上62632.2.優(yōu)點優(yōu)點：具有高度的吸附專一性：具有

44、高度的吸附專一性 層析過程簡便、快速層析過程簡便、快速3.3.載體的選擇載體的選擇：(1)(1)必須具有高度親水性，使必須具有高度親水性，使PrPr分子容易與它接近分子容易與它接近. .(2)(2)非專一性吸附要十分小。非專一性吸附要十分小。(3)(3)必須具有大量可供活化而能與配基結(jié)合的基團。必須具有大量可供活化而能與配基結(jié)合的基團。 常用載體常用載體：纖維素、纖維素、 葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、 聚丙烯酸胺凝膠和多孔玻璃聚丙烯酸胺凝膠和多孔玻璃等等。 64高效液相層析法（高效液相層析法（HPLCHPLC） 液相層析液相層析: :凡是以液體作為流動相的層析法。凡是以液體

45、作為流動相的層析法。高效液相層析法高效液相層析法: : 高壓輸液的情況下高壓輸液的情況下, ,數(shù)分鐘甚至數(shù)分鐘甚至1min1min就可就可以完成一次理想的分離以完成一次理想的分離, ,這種方法為這種方法為HPLC.HPLC.條件條件: 1.柱長柱長 50-100cm, 50-100cm, 柱徑柱徑2-3mm;2-3mm; 2. 2.固定相載體顆粒的直徑通常固定相載體顆粒的直徑通常10-15um;10-15um; 3. 3.高壓輸液泵加壓，一般壓力在高壓輸液泵加壓，一般壓力在20-200Kg/cm20-200Kg/cm2 2 4. 4.保持保持1ml/min1ml/min的流速的流速65 固定相

46、固定相: :聚苯乙烯凝膠聚苯乙烯凝膠 多孔性二氧化硅微球多孔性二氧化硅微球 多孔玻璃珠等多孔玻璃珠等 流動相流動相: : (1(1）與固定相不互溶或溶解很少）與固定相不互溶或溶解很少; ; （2 2）避免與固定相發(fā)生不可逆反應(yīng)；）避免與固定相發(fā)生不可逆反應(yīng)； （3 3） 對樣品要有適當(dāng)?shù)娜芙舛?；對樣品要有適當(dāng)?shù)娜芙舛龋?（4 4）與采用的檢測器相適應(yīng)。）與采用的檢測器相適應(yīng)。 666768 HPLC分析圖譜051 01 52 0OD380nm0 .0 0 00 .0 0 50 .0 1 0051 01 52 00 .0 0 00 .0 0 50 .0 1 00 .0 1 50 .0 2 0R

47、e te n tio n tim e (m in )051 01 52 0OD380nm0 .0 0 00 .0 0 50 .0 1 00 .0 1 5051 01 52 00 .0 0 00 .0 0 50 .0 1 00 .0 1 50 .0 2 00 .0 2 5ABCDD N P -O PP ro d u c tProductProductProductD N P -O PD N P -O PD N P -O PR e te n tio n tim e (m in )051 01 52 00 .0 0 00 .0 0 50 .0 1 0R e te n tio n tim e (m i

48、n )051 01 52 00 .0 0 00 .0 0 50 .0 1 00 .0 1 5ProductD N P -O PProductD N P -O PM 8 -PEFA : C A s u s p e n s io n (c o n tro l)B : C M T -3 (1 0 g /m l)C : P h e n a n th ro lin e (5 m M )D : E D T A (5 m M )E : E x tra c t fro m C AF : M M P -8 (1 0 0 g /m l70分類：分類：(1)(1)液一液分配層析液一液分配層析：利用溶質(zhì)在流動相中分配

49、系利用溶質(zhì)在流動相中分配系 數(shù)的差別而達到分離目的，數(shù)的差別而達到分離目的， 是應(yīng)用最多的方法之一。是應(yīng)用最多的方法之一。(2)(2)液一固吸附層析液一固吸附層析: :利用溶質(zhì)在固體吸附劑上吸利用溶質(zhì)在固體吸附劑上吸 附能力的差別而達到分離目的。附能力的差別而達到分離目的。(3)(3)離子交換層析離子交換層析：通過溶質(zhì)和固體（樹脂）的離子通過溶質(zhì)和固體（樹脂）的離子 交換作用，利用不同溶質(zhì)離子交交換作用，利用不同溶質(zhì)離子交 換能力的差別而達到分離目的。換能力的差別而達到分離目的。(4)(4)凝膠滲透層析凝膠滲透層析：按溶質(zhì)分子量大小而分離，也即按溶質(zhì)分子量大小而分離，也即 分子篩層析。分子篩層

50、析。 71 第二節(jié)第二節(jié)蛋白質(zhì)的檢測和鑒定蛋白質(zhì)的檢測和鑒定72 一般可通過以下幾個方面進行：一般可通過以下幾個方面進行： 光譜學(xué)特性光譜學(xué)特性 電泳行為電泳行為 特異抗體反應(yīng)特異抗體反應(yīng) 特異生物學(xué)活性特異生物學(xué)活性 N N一末端氨基酸序列測定一末端氨基酸序列測定 質(zhì)譜檢測質(zhì)譜檢測 排阻層析排阻層析 73 一、光譜學(xué)特性一、光譜學(xué)特性 蛋白質(zhì)光譜特性的總原則是：蛋白質(zhì)光譜特性的總原則是：當(dāng)一定波長的光（即電磁波）與當(dāng)一定波長的光（即電磁波）與PrPr分子接觸分子接觸時，所吸收的或反射的輻射能量與時，所吸收的或反射的輻射能量與PrPr分子結(jié)分子結(jié)構(gòu)特征和濃度是密切相關(guān)的。構(gòu)特征和濃度是密切相關(guān)

51、的。 圓二色譜、磁共振技術(shù)、圓二色譜、磁共振技術(shù)、X X一射線晶體衍射法、紅外一射線晶體衍射法、紅外光譜、拉曼光譜技術(shù)等光譜學(xué)技術(shù)等。光譜、拉曼光譜技術(shù)等光譜學(xué)技術(shù)等。 74 不同波長范圍的電磁波與其作用后的剩余能量值反不同波長范圍的電磁波與其作用后的剩余能量值反映的是蛋白質(zhì)分子的不同特征映的是蛋白質(zhì)分子的不同特征: :190 -200nm190 -200nm波長范圍的光吸收反映的是波長范圍的光吸收反映的是蛋白質(zhì)主鏈蛋白質(zhì)主鏈上的酞胺鍵中電子的被激發(fā)；上的酞胺鍵中電子的被激發(fā)；230 - 300nm230 - 300nm波長范圍的光吸收譜（最大吸收值在波長范圍的光吸收譜（最大吸收值在280nm

52、280nm波長處）反映的是波長處）反映的是蛋白質(zhì)分子中芳香族氨基酸蛋白質(zhì)分子中芳香族氨基酸側(cè)鏈上電子的被激發(fā)。側(cè)鏈上電子的被激發(fā)。所以一般情況下，溶液在所以一般情況下，溶液在280nm280nm波長處（屬紫外波長處（屬紫外光范圍）的光吸收能力被當(dāng)做是光范圍）的光吸收能力被當(dāng)做是存在存在蛋白質(zhì)的證據(jù)。蛋白質(zhì)的證據(jù)。75二、電泳檢測二、電泳檢測 蛋白質(zhì)分子為兩性電解質(zhì)，在不同蛋白質(zhì)分子為兩性電解質(zhì)，在不同PHPH的溶液中帶的溶液中帶有不同的電荷，從而在直流電場中能夠泳動，這就是有不同的電荷，從而在直流電場中能夠泳動，這就是電泳現(xiàn)象電泳現(xiàn)象。按按介質(zhì)狀態(tài)介質(zhì)狀態(tài)來分來分: :自由電泳自由電泳 區(qū)帶電

53、泳區(qū)帶電泳按按操作原理操作原理可分為可分為: : 一般電泳一般電泳 等電電泳等電電泳 等電聚焦電泳等電聚焦電泳 免疫電泳等免疫電泳等 76自由電泳自由電泳-以以溶液溶液為介質(zhì)，在溶液中將蛋白質(zhì)分離為介質(zhì)，在溶液中將蛋白質(zhì)分離 缺點缺點: :自由電泳過程中擴散嚴(yán)重，分辨率有限自由電泳過程中擴散嚴(yán)重，分辨率有限區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳-在固體支持物上所進行的電泳在固體支持物上所進行的電泳 固體支持物有固體支持物有: :濾紙、醋酸纖維薄膜、濾紙、醋酸纖維薄膜、瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 優(yōu)點優(yōu)點: :分辨率很高。分辨率很高。77SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（

54、SDS-PAGE)SDS-PAGE) SDSSDS ( (十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉) )是陰離子型去污劑是陰離子型去污劑(Sodium dodecyl sulfate, SDS)(Sodium dodecyl sulfate, SDS) Q Q u = u = （遷移率）（遷移率）6r 6r u u 與與 Q Q、 r r有關(guān)有關(guān) 若蛋白質(zhì)分子帶有足夠的電荷，在若蛋白質(zhì)分子帶有足夠的電荷，在SDS-PAGESDS-PAGE中進中進行電泳，由于分子篩效應(yīng)，行電泳，由于分子篩效應(yīng)， u u 僅取決于分子的大小。僅取決于分子的大小。因此因此 SDS SDS一凝膠電泳可以按一凝膠電泳可以按蛋白質(zhì)分

55、子大小的不同蛋白質(zhì)分子大小的不同將其將其分開。分開。 這時，若以分子量的對數(shù)（這時，若以分子量的對數(shù)（logMlogM）對相對于染料前沿）對相對于染料前沿的遷移率（的遷移率（RfRf）作圖，呈現(xiàn)線性關(guān)系。）作圖，呈現(xiàn)線性關(guān)系。 7879 這種關(guān)系，對一種膠濃度時，只適用于一定的這種關(guān)系，對一種膠濃度時，只適用于一定的分子量范圍：分子量范圍： 5 5膠濃度時，適用于分子量膠濃度時，適用于分子量6 6200200萬的區(qū)間；萬的區(qū)間； 10 10膠濃度時，適用于分子量膠濃度時，適用于分子量1.61.67 7萬的區(qū)間；萬的區(qū)間； 15 15膠濃度時，適用于分子量膠濃度時，適用于分子量1.21.24.5

56、4.5萬的區(qū)間。萬的區(qū)間。 80聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜等電聚焦電泳等電聚焦電泳（isoelectric focusing, IEF） PrPr分子有一定的分子有一定的PIPI，當(dāng)它處在一個由當(dāng)它處在一個由陽極陽極 陰極陰極梯度逐漸增加的梯度逐漸增加的介質(zhì)中，并通過以直流介質(zhì)中，并通過以直流電時，它便電時，它便“聚焦聚焦”在與在與其其PIPI相同的相同的pHpH位置上。位置上。 PIPI不同的蛋白質(zhì)泳動后不同的蛋白質(zhì)泳動后形成位置不同的區(qū)帶而形成位置不同的區(qū)帶而得到分離。得到分離。82優(yōu)點：優(yōu)點：1.1.有很高的分辨率；有很高的分辨率；2.2.可以區(qū)分等電點只有可以區(qū)分等電點只有 0.01 pH

57、0.01 pH單位差異的蛋白質(zhì)；單位差異的蛋白質(zhì)；3.3.根據(jù)其所在位置還能夠測定蛋白質(zhì)的分子量；根據(jù)其所在位置還能夠測定蛋白質(zhì)的分子量；4.4.對很稀的樣品，最后達到高度的濃縮。對很稀的樣品，最后達到高度的濃縮。83能形成能形成 PH PH 梯度的物質(zhì)必須具有以下特性：梯度的物質(zhì)必須具有以下特性：（1 1）有足夠的緩沖能力，樣品存在時也能保持穩(wěn)定）有足夠的緩沖能力，樣品存在時也能保持穩(wěn)定 的的PHPH梯度；梯度；（2 2）有足夠的電導(dǎo)能力，以使一定的電流能夠透過；）有足夠的電導(dǎo)能力，以使一定的電流能夠透過；（3 3）是小分子的物質(zhì)，電泳后易于除去；）是小分子的物質(zhì)，電泳后易于除去；（4 4）

58、化學(xué)組成與被分離的蛋白質(zhì)物質(zhì)不同，不干擾）化學(xué)組成與被分離的蛋白質(zhì)物質(zhì)不同，不干擾 測定；測定；（5 5）不會使蛋白質(zhì)變性或與其發(fā)生副反應(yīng)）不會使蛋白質(zhì)變性或與其發(fā)生副反應(yīng) 84雙向電泳雙向電泳（two-dimensional gel electrophoresis） 第一向采用聚丙烯酸胺凝膠等電聚焦電泳第一向采用聚丙烯酸胺凝膠等電聚焦電泳-PIPI第二向采用第二向采用SDSSDS一凝膠電泳一凝膠電泳-分子量分子量 由于結(jié)合了蛋白質(zhì)的等電點和分子量兩種完全不由于結(jié)合了蛋白質(zhì)的等電點和分子量兩種完全不同的特一性來進行分離，因此具有非常高的分辨率同的特一性來進行分離，因此具有非常高的分辨率85雙向

59、PAGE86 雙向電泳技術(shù)缺點，具有以下特征的蛋白質(zhì)在二維雙向電泳技術(shù)缺點，具有以下特征的蛋白質(zhì)在二維電泳中還很難被檢測到：電泳中還很難被檢測到：等電點（等電點（pl)pl)值很大或很小的，比如大于值很大或很小的，比如大于8 8和小于和小于4 4的那些蛋白質(zhì)；的那些蛋白質(zhì)；分子質(zhì)量很大的蛋白質(zhì)，比如大于分子質(zhì)量很大的蛋白質(zhì)，比如大于l00kDal00kDa的蛋白的蛋白質(zhì)就比實際的少了，而大于質(zhì)就比實際的少了，而大于150kDa150kDa的蛋白質(zhì)就幾的蛋白質(zhì)就幾乎完全探測不到了（盡管在一維電泳凝膠上這些乎完全探測不到了（盡管在一維電泳凝膠上這些大蛋白質(zhì)都能清楚地被觀察到；大蛋白質(zhì)都能清楚地被觀

60、察到；疏水性蛋白質(zhì)。疏水性蛋白質(zhì)。 免疫電泳免疫電泳 將將電泳分離電泳分離和和專一性免疫沉淀專一性免疫沉淀相結(jié)合的分析方法：相結(jié)合的分析方法： 蛋白質(zhì)樣品先在瓊脂或瓊脂糖凝膠中電泳，然后在蛋白質(zhì)樣品先在瓊脂或瓊脂糖凝膠中電泳，然后在與泳動路線相距幾毫米的槽中放入針對該樣品的免疫血與泳動路線相距幾毫米的槽中放入針對該樣品的免疫血清。由于雙向擴散的結(jié)果，形成抗原一抗體復(fù)合物的免清。由于雙向擴散的結(jié)果，形成抗原一抗體復(fù)合物的免疫沉淀弧線疫沉淀弧線由于免疫反應(yīng)有由于免疫反應(yīng)有很高的專一性，很高的專一性，可用于可用于鑒定鑒定PrPr的的純度，分析樣品純度，分析樣品中蛋白質(zhì)的組分中蛋白質(zhì)的組分。PH 8.