第十章胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)

1、整理ppt整理ppt 能在體外增殖又具有胚胎細(xì)胞全能性或多能性的，并通過(guò)適當(dāng)條件能被誘導(dǎo)分化為各種類(lèi)型分化細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。整理ppt20世紀(jì)70年代，胚胎性瘤細(xì)胞（EC細(xì)胞）是畸胎瘤干細(xì)胞，具有惡性生長(zhǎng)并顯示類(lèi)似于胚胎細(xì)胞發(fā)育的全能或多能的性質(zhì)。80年代初，從小鼠早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或桑椹胚分離建立了具有發(fā)育全能性的胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）。近年,多能性胚胎生殖細(xì)胞系（EG細(xì)胞），被稱(chēng)為“干細(xì)胞之母”。整理ppt一、ES細(xì)胞和EG細(xì)胞培養(yǎng)和建系的基本技術(shù)（一）飼養(yǎng)層細(xì)胞 不論ES細(xì)胞或EG細(xì)胞，原代或初代培養(yǎng)階段一般都須依賴(lài)于能分泌它們?cè)隗w外存活增殖所必需生長(zhǎng)因子的飼養(yǎng)層細(xì)胞。保持活性但不分裂增殖

2、整理ppt1 MEF細(xì)胞 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞整理ppt2 STO細(xì)胞 來(lái)自于SIM小鼠胚胎的硫代鳥(niǎo)嘌呤和烏本苷有抗性的成纖維細(xì)胞系。整理ppt二、胚胎細(xì)胞的來(lái)源 采用超排途徑 1 主要材料 動(dòng)物：雌雄小鼠 激素：PMS、HCG整理ppt2 獲取胚胎的過(guò)程（1）雌鼠，5IU PMS，48h后 5IU HCG（2）雌雄合籠，自然交配，次晨查陰道栓為交配后0.5d（即0.5dpc）。（3）3-4d，分別剖取子宮，沖出子宮內(nèi)桑椹胚和早期胚泡進(jìn)一步分離培養(yǎng)ES細(xì)胞。8.5-10.5dpc時(shí)的胚胎生殖嵴可建立EG細(xì)胞系。整理ppt（三）ES和EG細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程1 ES細(xì)胞培養(yǎng) 基本培養(yǎng)液為含15-20%F

3、CS，0.1mmol/l，-巰基乙醇和50IU/ml青霉素，50ug/ml鏈霉素的MEM培養(yǎng)液。 接種桑椹胚和胚泡于預(yù)先鋪有作為飼養(yǎng)層無(wú)有絲分裂活性的單層MEF細(xì)胞的35mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2-3d然后按下列方法分離ICM細(xì)胞，進(jìn)一步培養(yǎng)。整理ppt方法一，免疫手術(shù)法：1）取出10只左右上述體外培養(yǎng)的胚泡，放在小培養(yǎng)皿中，用酸性Tyrode液（PH2.5）處理1-2分鐘，去除透明帶。2）胚泡移入Hanks液的小培養(yǎng)皿中洗滌一次。直接露于經(jīng)培養(yǎng)液1:2000稀釋的兔抗JCR小鼠脾臟細(xì)胞抗血清（抗H-2b）。3）30分鐘后，再移到用培養(yǎng)液1:6稀釋的新鮮豚鼠血清中,處理30min左右胚泡的滋養(yǎng)層細(xì)胞

4、呈泡狀，發(fā)生免疫溶解，而ICM細(xì)胞不具有H-2b抗原，不發(fā)生細(xì)胞免疫溶解，故完整無(wú)損。整理ppt方法二、常規(guī)培養(yǎng)： 桑椹胚或胚泡不需要透明帶1)在鋪有飼養(yǎng)層的MEM基本培養(yǎng)液中培養(yǎng)3-4天，ICM細(xì)胞團(tuán)從貼壁胚泡內(nèi)長(zhǎng)出來(lái)。2）吸出ICM細(xì)胞團(tuán)，0.25%(w/v)胰蛋白酶和0.2mmol/l混合消化液在37消化5分鐘。3)部分解離的細(xì)胞團(tuán)移至鋪有MEF飼養(yǎng)層的培養(yǎng)板培養(yǎng)4天,可在一些孔內(nèi)見(jiàn)到巢狀胚胎干細(xì)胞團(tuán)。4)胰蛋白酶消化巢狀胚胎干細(xì)胞團(tuán)并繼續(xù)培養(yǎng)，一般4-5天間隔用胰蛋白酶消化，克隆和純化ES細(xì)胞，視ES細(xì)胞巢密度轉(zhuǎn)移到較大容積的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶。整理ppt2 EG細(xì)胞EG細(xì)胞建系基本過(guò)程如

5、下： 1）原始生殖細(xì)胞分離和原代培養(yǎng) （1）收集8.5-10.5dpc胚胎，清洗，取生殖嵴組織。 （2）0.02%EDTA液孵育，37，15min。 （3）吹散，接種。整理ppt2）飼養(yǎng)層細(xì)胞：宜用8代以?xún)?nèi)的小鼠MEF細(xì)胞或STO細(xì)胞系。（1）用前經(jīng)10ug/ml絲裂霉素C處理2-3h。（2）接種整理ppt3）EG細(xì)胞純化和建系（1）分裂增殖，4-6d后，解剖鏡下胰酶消化，轉(zhuǎn)移繼續(xù)培養(yǎng)。（2）從復(fù)上面2-3次，可產(chǎn)生巢狀干細(xì)胞群落。（3）最后轉(zhuǎn)移進(jìn)一步擴(kuò)增，此時(shí)可省LIF，SCF，bFCF等生長(zhǎng)因子。（4）EG細(xì)胞傳代、凍存和復(fù)蘇：常規(guī)胰蛋白酶消化法傳代，無(wú)飼養(yǎng)層細(xì)胞要加LIF。凍存與復(fù)蘇常規(guī)方法。整理ppt二、ES細(xì)胞體外誘導(dǎo) 在特定的培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)劑共同作用下，ES細(xì)胞可分化形成各種類(lèi)型的細(xì)胞。 EG細(xì)胞和ES細(xì)胞有類(lèi)似的發(fā)育全能