實(shí)驗(yàn)PCR產(chǎn)物T載體克隆和轉(zhuǎn)化

1、實(shí)驗(yàn)PCR產(chǎn)物T載體克隆和轉(zhuǎn)化重組重組DNA技術(shù)操作步驟技術(shù)操作步驟 基本原理基本原理目的基因的獲取目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選重組體的篩選克隆基因的表達(dá)克隆基因的表達(dá) 主要步驟：主要步驟： 制備目的基因和選擇相關(guān)載體制備目的基因和選擇相關(guān)載體 目的基因和有關(guān)載體進(jìn)行連接目的基因和有關(guān)載體進(jìn)行連接 重組的重組的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞 DNA重組體的篩選和鑒定重組體的篩選和鑒定 DNA重組體的擴(kuò)增、表達(dá)和其他研究重組體的擴(kuò)增、表達(dá)和其他研究 以以 質(zhì)質(zhì) 粒粒 為為 載載 體體 的的

2、DNA 克克 隆隆 過過 程程 （三）（三）PCR擴(kuò)增特定基因擴(kuò)增特定基因 （四）人工合成（四）人工合成一、目的基因的獲得一、目的基因的獲得分分 （一）從基因組文庫(kù)中獲得（一）從基因組文庫(kù)中獲得 （二）從（二）從cDNA文庫(kù)中獲得文庫(kù)中獲得組織或細(xì)胞染色體組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷基因片斷克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶受體菌受體菌基因組基因組DNA文庫(kù)文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所由克隆載體所攜帶的所有基因組有基因組DNA的集合的集合從基因組從基因組DNA文庫(kù)文庫(kù)獲取目的基因獲取目的基因限制酶切位

3、點(diǎn)限制酶切位點(diǎn)限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應(yīng)連接反應(yīng) 體外包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文庫(kù)基因文庫(kù)用隨機(jī)切割的真核生物染色體用隨機(jī)切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫(kù)片段構(gòu)建基因文庫(kù) mRNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA 重組重組DNA分子分子 cDNA文庫(kù)文庫(kù) 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄

4、酶 載體載體 受體菌受體菌 復(fù)制復(fù)制 從從cDNA文庫(kù)獲取目的基因文庫(kù)獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶堿水解堿水解 T T T T化學(xué)合成法獲取目的基因化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列。序列。幾種常用克隆載體的比較幾種常用克隆載體的比較注：注：+ +表示可用；表示可用；- -表示不可用表示不可用比較內(nèi)容比較內(nèi)容 質(zhì)質(zhì) 粒粒 噬菌體噬菌體 黏性質(zhì)粒黏性質(zhì)粒 M13噬菌體噬菌體克隆容量克隆容量 10 kb 22 kb 4050 kb 1 kb基因組基因組DNA文庫(kù)文庫(kù)

5、- + + -cDNA文庫(kù)文庫(kù) + + - -亞克隆亞克隆 + - - +序列分析序列分析 + + - +E.coli表達(dá)表達(dá) + + - -二、載體的選擇與準(zhǔn)備二、載體的選擇與準(zhǔn)備選選三、三、DNADNA分子的體外連接分子的體外連接接接（一）黏性末端（一）黏性末端（二）人工接頭的使用（二）人工接頭的使用（三）加入同聚體尾（三）加入同聚體尾（四）平端連接（四）平端連接（一）黏性末端（一）黏性末端（二）人工接頭（二）人工接頭（三）加入同聚體尾（三）加入同聚體尾待克隆待克隆DNADNA片段片段重組質(zhì)粒重組質(zhì)?；旌稀⑼嘶鸹旌?、退火空白質(zhì)粒空白質(zhì)粒（四）平端連接（四）平端連接5 3 3 5 載體載體D

6、NA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶或機(jī)械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 3 A(A)nA A(A)nA -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶連接酶15C重組體重組體5 3 5 四、外源四、外源DNADNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞導(dǎo)入宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)受體菌條件：受體菌條件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)處于感受態(tài)(competent) 導(dǎo)入方式：導(dǎo)入方

7、式：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 (transfection)感染感染 (infection) 外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞后，篩選含有目外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞后，篩選含有目的基因的陽(yáng)性克隆并加以擴(kuò)增。的基因的陽(yáng)性克隆并加以擴(kuò)增。 所用的方法主要有遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)所用的方法主要有遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法、核酸雜交法、方法、核酸雜交法、PCR等。等。五、目的基因的篩選和鑒定五、目的基因的篩選和鑒定篩篩1. 借助載體上的遺傳標(biāo)志進(jìn)行篩選借助載體上的遺傳標(biāo)志進(jìn)行篩選 (1) 利用抗生素抗性標(biāo)志篩選利用抗生素抗性標(biāo)志篩選(2) 利用基因的插入失活利用基因的插入失活/插入表達(dá)插入表達(dá) 特性篩

8、選特性篩選(3) 利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選(4)利用噬菌體的包裝特性進(jìn)行篩選利用噬菌體的包裝特性進(jìn)行篩選2. 序列特異性篩選序列特異性篩選 (1) RERE酶切法酶切法 (2) PCR法法 (3) 核酸雜交法核酸雜交法(4) DNA測(cè)序法測(cè)序法 （一）（一） 遺傳學(xué)方法遺傳學(xué)方法 1. 1. 插入滅活法插入滅活法插入失活篩選帶有重組載體的克隆插入失活篩選帶有重組載體的克隆 2. 藍(lán)藍(lán)-白篩選（白篩選（互補(bǔ)）互補(bǔ)） 許多載體（如許多載體（如M13系列、系列、pUC系列、系列、pGEM系列）都含有系列）都含有-半半乳糖苷酶基因（乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和氨基端）的調(diào)控序列和氨基端

9、145個(gè)氨基酸的編碼序個(gè)氨基酸的編碼序列。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)。這種載體適用于可列。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)。這種載體適用于可編碼編碼-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細(xì)胞。宿主和載體編碼的半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細(xì)胞。宿主和載體編碼的片段各自均無酶活性，但它們可以互補(bǔ)形成具有活性的片段各自均無酶活性，但它們可以互補(bǔ)形成具有活性的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶，使人工底物，使人工底物X-gal轉(zhuǎn)化成藍(lán)色的代謝產(chǎn)物，出現(xiàn)藍(lán)色的菌落。如果在轉(zhuǎn)化成藍(lán)色的代謝產(chǎn)物，出現(xiàn)藍(lán)色的菌落。如果在多克隆位點(diǎn)上插入外源多克隆位點(diǎn)上插入外源DNA片段，將使片段，將使lac Z基因滅活，不能生成有基因

10、滅活，不能生成有活性的活性的-半乳糖苷酶，結(jié)果菌落呈現(xiàn)白色。半乳糖苷酶，結(jié)果菌落呈現(xiàn)白色。 互補(bǔ)篩選（藍(lán)互補(bǔ)篩選（藍(lán)- -白篩選）白篩選） PCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的T載體載體克隆和轉(zhuǎn)化克隆和轉(zhuǎn)化 材料：目的基因片段（回收的材料：目的基因片段（回收的PCR產(chǎn)物）產(chǎn)物） 藥品：藥品：pEMG T-Vector (Promega公司公司)質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmidplasmid） 是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈?zhǔn)谴嬖谟诩?xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNADNA 分子。大小約為分子。大小約為 數(shù)千堿基對(duì)。常數(shù)千堿基對(duì)。常 有有1 31 3個(gè)抗藥個(gè)抗藥 性基因，以利于性基因，以利于 篩選。篩選。質(zhì)粒載體質(zhì)粒載

11、體 克隆的質(zhì)粒載體克隆的質(zhì)粒載體 允許外源的允許外源的DNADNA插入，儲(chǔ)存。主要是插入，儲(chǔ)存。主要是DNADNA水平上的操作。水平上的操作。 基因表達(dá)的質(zhì)粒載體基因表達(dá)的質(zhì)粒載體 允許外源允許外源DNADNA的插入、儲(chǔ)存和表達(dá)。的插入、儲(chǔ)存和表達(dá)。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 普通普通Taq酶會(huì)在酶會(huì)在3 末端加一個(gè)末端加一個(gè)A，這樣所有，這樣所有PCR產(chǎn)物都會(huì)產(chǎn)物都會(huì)在雙鏈在雙鏈DNA的的3 端均有一個(gè)單鏈狀態(tài)的端均有一個(gè)單鏈狀態(tài)的A； T-載體是線狀載體是線狀DNA片段，在片段，在DNA雙鏈的雙鏈的3 端均有一個(gè)單端均有一個(gè)單鏈狀態(tài)的鏈狀態(tài)的T； 二者在連接酶的作用下連接為一個(gè)重組的環(huán)狀分子，二者在連接酶的作用下連接為一個(gè)重組的環(huán)狀分子，從而達(dá)到克隆的目的。從而達(dá)到克隆的目的。載體結(jié)構(gòu)的三大要素：載體結(jié)構(gòu)的三大要素： 多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn) 選擇標(biāo)記（耐藥性，選擇標(biāo)記（耐藥性，LacZLacZ） 獨(dú)立的復(fù)制單位獨(dú)立的復(fù)制單位pGEM-T Easy 載體的結(jié)構(gòu)載體的結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟（1）目的片段的制備）目的片段的制備-膠回收法回收膠回收法回收PCR產(chǎn)物：產(chǎn)物：(2)連接實(shí)驗(yàn)：連接實(shí)驗(yàn)： 在在0.2ml