高精度PCR技術(shù)在肝病診療中的價(jià)值

1、高精度PCR技術(shù)在肝病診療中的價(jià)值病毒性肝炎感染病毒性肝炎感染 世界性流行，是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。 據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球60億人口中，約20億人曾感染過或正感染HBV，其中3.5億人為慢性感染者，每年約有60萬人死于與HBV感染相關(guān)的肝病。 近年來，我國在慢性乙型肝炎（乙肝）防治領(lǐng)域取得了重要進(jìn)展?！笆晃迨晃濉敝卮髠魅静ｍ?xiàng)計(jì)劃病毒性肝炎重大傳染病專項(xiàng)計(jì)劃病毒性肝炎重大研究專項(xiàng)啟動(dòng)重大研究專項(xiàng)啟動(dòng) 2009年，我國病毒性肝炎領(lǐng)域最重要的進(jìn)展是國家“十十一五一五”重大傳染病專項(xiàng)計(jì)劃重大傳染病專項(xiàng)計(jì)劃: :“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項(xiàng)啟動(dòng)（見表1）。 這是“十一五

2、”期間與“載人航天與探月工程、大型飛機(jī)”等相平行的16個(gè)重大專項(xiàng)計(jì)劃之一。表1 國家中長期科技發(fā)展規(guī)劃綱要（20062020年）確定的重大科技專項(xiàng)核心電子器件、高端通用芯片及基礎(chǔ)軟件新產(chǎn)品極大規(guī)模集成電路制造裝備與成套工藝新一代寬帶無線移動(dòng)通信網(wǎng)高檔數(shù)控機(jī)床與基礎(chǔ)制造裝備大型油氣田及煤層氣開發(fā)大型先進(jìn)壓水堆及高溫氣冷堆核電站水體污染控制與治理轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大新藥創(chuàng)制艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治大型飛機(jī)高分辨率對(duì)地觀測(cè)系統(tǒng)載人航天與探月工程主要內(nèi)容主要內(nèi)容臨床對(duì)高靈敏度乙肝病毒核酸定量的需求臨床對(duì)高靈敏度乙肝病毒核酸定量的需求我國乙肝病毒核酸定量我國乙肝病毒核酸定量PCRPCR檢測(cè)

3、技術(shù)現(xiàn)狀檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀艾迪康提供兩種高靈敏度病毒核酸檢測(cè)艾迪康提供兩種高靈敏度病毒核酸檢測(cè)血清血清HBV DNA水平是臨床上評(píng)價(jià)水平是臨床上評(píng)價(jià)HBV復(fù)制情況的復(fù)制情況的“金標(biāo)準(zhǔn)金標(biāo)準(zhǔn)”HBV DNAHBV DNA貫穿感染者的終生ALT正常增高或者波動(dòng)正常增高或者波動(dòng)免疫耐受期免疫清除期非活動(dòng)或低（非）復(fù)制期再活動(dòng)期肝組織學(xué)無明顯異常, 或輕度炎癥纖維化中度或嚴(yán)重炎癥、纖維化快速進(jìn)展無炎癥或僅有輕度炎癥中度或嚴(yán)重炎癥、肝纖維化臨床診斷慢性HBV攜帶者HBeAg陽性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化非活動(dòng)性HBsAg攜帶者HBeAg陰性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化Lok AS, et al. Hepatol

4、ogy. 2009;50:661-662Liaw YF, Liver International, 2009,29(s1):100-1-72012：HBV DNA detection and HBV DNA level measurement are essential for the diagnosis, decision to treat and subsequent monitoring of patients (A1). Follow-up using realtime PCR quantification assays is strongly recommended because

5、of their sensitivity, specificity, accuracy and broad dynamic range 3841 (A1). 2009： Recently, HBV DNA assays that utilize real-time PCR technology with improved sensitivity(5-10 IU/mL) and wider dynamic range (up to 8-9 log10 IU/mL) have become available乙肝治療指南：美國和歐洲Hepatology, 2009J Hepatol, 2012He

6、patol Int，2012乙肝治療共識(shí)：2012亞太(1)Hepatol Int，2012乙肝治療共識(shí)：2012亞太(2)Hepatol Int，2012乙肝治療共識(shí)：2012亞太(3)HBV DNA載量載量PCR檢測(cè)的國際指南檢測(cè)的國際指南 誰需要檢測(cè)：誰需要檢測(cè)： HBsAg陽性患者和HBsAg陰性的高危人群 攜帶者、慢乙肝患者、肝硬化和肝癌患者 什么時(shí)候檢測(cè)：什么時(shí)候檢測(cè)： 未治療患者、治療前、治療中、結(jié)束治療后均需檢測(cè)HBV DNA載量檢測(cè)在治療優(yōu)化路線圖中的作用HBV DNA載量檢測(cè)在治療優(yōu)化路線圖中的作用抗病毒治療前病毒基線的準(zhǔn)確測(cè)定：適宜抗病毒治療患者選擇、抗病毒治療方案的確定

7、、抗病毒療效的預(yù)測(cè)與后續(xù)療效比對(duì)抗病毒治療過程中療效的評(píng)估和方案優(yōu)化、耐藥突變檢測(cè)和治療終點(diǎn)的確認(rèn)抗病毒優(yōu)化治療停藥后隨訪及復(fù)發(fā)再治的判斷隱匿性病毒性肝炎的診斷高靈敏度核酸定量檢測(cè)的臨床意義HBV 核酸定量核酸定量PCR檢測(cè)的國際指南要求檢測(cè)的國際指南要求 超敏感性超敏感性（Hypersensitivity）HBV最低檢測(cè)限10-15 IU/ml 寬線性范圍寬線性范圍（ wider dynamic range ）涵蓋101109 IU/ml 高特異性高特異性（ High specificity） 可重復(fù)性好可重復(fù)性好（ Repeatability）主要內(nèi)容臨床對(duì)高靈敏度乙肝病毒核酸定量的需求我

8、國乙肝病毒核酸定量PCR檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀艾迪康提供兩種高靈敏度病毒核酸檢測(cè)HBV DNA 檢測(cè)臨床應(yīng)用檢測(cè)臨床應(yīng)用斑點(diǎn)雜交 （Dot-blot hybridization）非定量PCR（Non-PCR based quantitative HBV DNA assays定量 PCR-based quantitative HBV DNA assays1980s1990s2000s血清血清HBV DNA定量定量目前多以熒光實(shí)時(shí)PCR技術(shù)作為檢測(cè)手段；HBV DNA定量的表達(dá)多以拷貝/毫升（copies/ml）或國際單位/毫升（IU/ml）表達(dá)，二者之間粗略的換算方法為1 IU/ml = 5 copies

9、/ml。血清HBV DNA定量檢測(cè)的發(fā)展方向?yàn)楦呙舾行裕╯ensitivity）和更寬的動(dòng)態(tài)范圍（dynamic range）。HBV DNA定量使用低靈敏度試劑的后果 臨床實(shí)踐中影響臨床療效的準(zhǔn)確評(píng)估，從而使病人療效出現(xiàn)偏差 臨床研究中弱化抗病毒療效國產(chǎn)國產(chǎn)HBV DNA PCR試劑性能現(xiàn)狀試劑性能現(xiàn)狀中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012 現(xiàn)有的國產(chǎn)試劑在檢測(cè)靈敏度、線性范圍、可重復(fù)性等方面無法滿足臨床上日益增加的對(duì)HBV DNA定量準(zhǔn)確性和靈敏度的要求 部分試劑缺乏內(nèi)參，影響定量準(zhǔn)確性主要內(nèi)容臨床對(duì)高靈敏度乙肝病毒核酸定量的需求我國乙肝病毒核酸定量PCR檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀艾迪康提供兩種高靈敏度病毒核酸檢

10、測(cè)高靈敏度HBV DNA較普通檢測(cè)符合國際乙肝治療指南和標(biāo)準(zhǔn)Cobas高靈敏HBV DNA磁珠法HBV DNA普通HBV DNA靈敏度20IU/ml10 IU/mL500-1000 IU/mL線性范圍201.7x108 IU/mL202x109 IU/mL10001 x 108 IU/mL或copies/mL定量方法內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法外標(biāo)法基因型A-H基因型A-H基因型B、C型自動(dòng)化程度全自動(dòng)化一般手工操作一般手工操作校準(zhǔn)WHO標(biāo)準(zhǔn)品WHO標(biāo)準(zhǔn)品無國際化認(rèn)證FDA，CE無無*建議100IU/ml以下患者選用cobas高靈敏20例患者組成特點(diǎn)-9例服用ETV、11例服用ADV（48周）-10例大三陽、

11、8例小三陽患者、 2例小二陽患者檢測(cè)試劑病例數(shù)HBV DNA分布范圍國產(chǎn)HBV20例1000 copies/mlCAP/CTM HBV11例8例* 1例Target Not Detected103104 copies/ml104105 copies/ml*包括1例服用ETV患者高靈敏度 HBV DNA檢測(cè)及時(shí)判斷病毒突破、及時(shí)調(diào)整治療決策高靈敏核酸檢測(cè)與普通核酸檢測(cè)比較數(shù)據(jù)來源：北京大學(xué)人民醫(yī)院普通PCR法 “假陰性”率高達(dá)45% (9/20) 以核苷類藥物為基礎(chǔ)的治療 ： 用藥 24周時(shí)（拉米夫定/替比夫定）或48周時(shí)（阿德福韋）出現(xiàn)病毒學(xué)應(yīng)答（HBV DNA檢測(cè)不到），則可預(yù)測(cè)耐藥的發(fā)生率

12、低，亦即持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答的機(jī)會(huì)得到提高，并且HBeAg陽性患者抗HBe血清學(xué)轉(zhuǎn)換的機(jī)會(huì)更高。乙肝治療期應(yīng)答的預(yù)測(cè)因素：HBV DNA高靈敏度檢測(cè)方法在治療中的應(yīng)用以IFN/PEG-IFN為基礎(chǔ)的治療HBeAg陽性患者 ：1.在治療的第6/12月與治療后的第6/12個(gè)月：應(yīng)檢測(cè)HBeAg和抗HBe抗體以及血清HBV DNA水平 ； 2.在隨訪期間通過實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)不到HBV DNA是最佳的結(jié)果，因?yàn)榕cHBsAg消失這一顯著變化有關(guān);3.如HBV DNA檢測(cè)不到，在抗HBe血清學(xué)轉(zhuǎn)換之后，應(yīng)每間隔12個(gè)月檢測(cè)HBsAg ;HBeAg陰性患者 ：1.在治療的第6/12月與治療后的第6/12個(gè)月：應(yīng)檢測(cè)

13、血清HBV DNA水平；2.通過實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)不到HBV DNA是理想的期望持續(xù)治療后應(yīng)答 ;3.如HBV DNA仍然檢測(cè)不到，應(yīng)每間隔12個(gè)月檢測(cè)HBsAg ;摘自2012年EASL臨床實(shí)踐指南：慢性乙肝病毒感染管理 2. 監(jiān)測(cè)治療高靈敏度檢測(cè)方法在治療中的應(yīng)用以NAs為基礎(chǔ)的治療HBeAg陽性患者NAs有限療程治療:1.應(yīng)每6個(gè)月檢測(cè)HBeAg和抗HBe，在治療期間每3-6個(gè)月通過敏感的PCR方法檢測(cè)HBV DNA; 2.抗HBe血清學(xué)轉(zhuǎn)換之后，應(yīng)每間隔12個(gè)月檢測(cè)HBsAg NAs長期治療：1.理想上，應(yīng)達(dá)到HBV DNA下降至實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)不到的水平（即低于1015 IU/ml）以避免

14、耐藥，因而HBV DNA監(jiān)測(cè)是檢測(cè)治療失敗的關(guān)鍵;2.在第3個(gè)月時(shí)應(yīng)檢測(cè)HBV DNA水平以查明病毒學(xué)應(yīng)答情況，然后每3-6個(gè)月檢測(cè)。摘自2012年EASL臨床實(shí)踐指南：慢性乙肝病毒感染管理 2. 監(jiān)測(cè)治療高靈敏度檢測(cè)方法在治療中的應(yīng)用3. P區(qū)耐藥監(jiān)測(cè)和判斷條件高靈敏度檢測(cè)方法在治療中的應(yīng)用抗病毒治療后抗病毒治療后HBV從病毒變異到臨床耐藥從病毒變異到臨床耐藥原發(fā)無應(yīng)答病毒學(xué)（部分）應(yīng)答臨床耐藥乙型肝炎病毒YMDD突變檢測(cè)乙型肝炎病毒1896/1762/1764位點(diǎn)變異檢測(cè)HBV P區(qū)藥物敏感位點(diǎn)基因突變檢測(cè)(11位點(diǎn))HBV preC區(qū)/C區(qū)基因突變位點(diǎn)檢測(cè)(8位點(diǎn)兩個(gè)區(qū)段)HBV pre

15、S區(qū)/S區(qū)基因突變位點(diǎn)檢測(cè)(4位點(diǎn)兩個(gè)區(qū)段)艾迪康開展乙肝耐藥及基因突變檢測(cè)小結(jié)1. 高靈敏度乙肝DNA檢測(cè)： 羅氏Cobas/磁珠法：靈敏度高、線性范圍廣，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，滿足國際標(biāo)準(zhǔn)。2. P區(qū)耐藥：用藥無進(jìn)展或治療效果反彈，考慮檢測(cè)P區(qū)耐藥。高靈敏度丙肝RNA檢測(cè)病毒學(xué)反應(yīng)SVR(持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答 )RVR(快速病毒學(xué)應(yīng)答 )EVR(早期病毒學(xué)應(yīng)答 )cEVR(完全EVR)pEVR(部分EVR)非EVR(非早期病毒學(xué)應(yīng)答 )病毒學(xué)應(yīng)答的檢測(cè)及定義摘自2012年EASL臨床實(shí)踐指南：丙肝病毒感染管理 高靈敏度丙肝RNA檢測(cè)治療開始第4周、12周和24周進(jìn)行血清病毒載量測(cè)定有助于調(diào)整治療方案；（

16、這些時(shí)間點(diǎn)發(fā)生HCV RNA病毒消失直接與SVR呈正比 ）必須要進(jìn)行治療結(jié)束后病毒學(xué)應(yīng)答和治療結(jié)束24周的SVR評(píng)估； 非合并肝硬化而達(dá)到SVR患者，治療后48周和96周要檢測(cè)ALT和HCV RNA，以確保ALT正常同時(shí)血清病毒呈陰性； 可能出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)：患者達(dá)到了治療結(jié)束時(shí)的病毒學(xué)應(yīng)答(治療結(jié)束時(shí)血清 HCV RNA病毒未檢出)，但是隨后病毒學(xué)指標(biāo)惡化，未達(dá)SVR。 標(biāo)準(zhǔn)治療方案的復(fù)發(fā)率介于標(biāo)準(zhǔn)治療方案的復(fù)發(fā)率介于15%-25%，數(shù)值的變化取決于治療期間，數(shù)值的變化取決于治療期間HCV RNA轉(zhuǎn)陰時(shí)間。轉(zhuǎn)陰時(shí)間。摘自2012年EASL臨床實(shí)踐指南：丙肝病毒感染管理 診斷與監(jiān)測(cè)治療高靈敏度丙肝

17、RNA檢測(cè) 高靈敏度丙肝RNA檢測(cè)數(shù)據(jù)來源：北京大學(xué)人民醫(yī)院高靈敏HCV RNA檢測(cè)更準(zhǔn)確，國產(chǎn)普通檢測(cè)較容易造成錯(cuò)誤治療決策。RVR：快速病毒學(xué)應(yīng)答cEVR：完全早期病毒學(xué)應(yīng)答高靈敏度丙肝RNA檢測(cè)高靈敏度HCV-RNA檢測(cè)：靈敏度高，不會(huì)造成停藥過早，導(dǎo)致復(fù)發(fā)率高 高靈敏度丙肝RNA檢測(cè)基因分型乙肝基因分型（建議做）2012年EASL臨床實(shí)踐指南：慢性乙肝病毒感染管理指出：與HBV基因型為D和C比較，基因型為A和B的抗HBe血清學(xué)轉(zhuǎn)換率與HBsAg消失率更高 ;2010年中國慢性乙型肝炎防治指南更新版指出：HBV基因型和疾病進(jìn)展和干擾素治療效果有關(guān)。與C基因型感染者相比，B基因型感染者較早出現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，較少進(jìn)展為慢性肝炎、肝硬化和原