動(dòng)物源性病毒跨種間感染與傳播機(jī)制研究

1、項(xiàng)目名稱：動(dòng)物源性病毒跨種間感染與傳播機(jī)制研究首席科學(xué)家：高福 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所起止年限：依托部門(mén)：中國(guó)科學(xué)院一、研究?jī)?nèi)容本項(xiàng)目選擇發(fā)病率高、危害嚴(yán)重的動(dòng)物源性傳染病如高致病性禽流感、狂犬病和蟲(chóng)媒病毒病等為研究對(duì)象，認(rèn)識(shí)病原的致病機(jī)制，揭示病原的分子變異和進(jìn)化規(guī)律，闡明新發(fā)傳染病跨種間傳播的分子基礎(chǔ)；并開(kāi)展其生態(tài)學(xué)研究以及動(dòng)物作為某些病原的天然貯存宿主的機(jī)制。擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題：1. 動(dòng)物源性人類新發(fā)病原的致病機(jī)制動(dòng)物源性人類新發(fā)病原的致病性取決于宿主與病原的關(guān)系，病原與細(xì)胞受體結(jié)合是感染的首要步驟。病原與其細(xì)胞受體的相互作用啟動(dòng)了細(xì)胞的一連串動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。研究病原與受體的作用可揭示病毒

2、與宿主細(xì)胞的相互關(guān)系，明確病毒的細(xì)胞、組織、器官、宿主嗜性、進(jìn)人細(xì)胞機(jī)制及其對(duì)宿主細(xì)胞的影響;闡明病毒的致病機(jī)制，弄清病毒融合和侵入過(guò)程、復(fù)制動(dòng)力學(xué)及其引起的一系列細(xì)胞內(nèi)過(guò)程。2. 動(dòng)物源性人類新發(fā)病原的分子變異和進(jìn)化規(guī)律病原特性取決于其基因組的結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)，新發(fā)傳染病在絕大多數(shù)情況下是通過(guò)病原的基因變異、基因重組、基因重排等方式突破原有物種間的屏障，在其他物種間引發(fā)新型傳染病的流行。在傳播中所涉及的宿主個(gè)體愈多，其受到的選擇壓力的累積效應(yīng)就愈大，又加大了病原發(fā)生進(jìn)化的動(dòng)力。掌握病原的分子變異和進(jìn)化規(guī)律，不僅可了解病毒在群體感染過(guò)程中的進(jìn)化趨向，而且對(duì)一些新病原的出現(xiàn)和其可能來(lái)源做出判斷，并且通

3、過(guò)現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)如反向遺傳操作技術(shù)等預(yù)測(cè)新型病原對(duì)人類的威脅和危害，進(jìn)一步揭示如侯鳥(niǎo)與禽流感傳播的相關(guān)性等擺在我們面前的重大科學(xué)問(wèn)題。3. 動(dòng)物源性人類新發(fā)傳染病跨種間傳播的分子基礎(chǔ)病原基因變異所引起的致病性、抗原性及對(duì)宿主細(xì)胞嗜性等的改變是新型病原跨種間傳播的分子基礎(chǔ)。基因組重要位點(diǎn)的關(guān)鍵基因突變可導(dǎo)致病原對(duì)宿主細(xì)胞嗜性的改變，集中在幾個(gè)重要的基因片段或重要變異點(diǎn)深入進(jìn)行研究，尋找導(dǎo)致跨種間傳播關(guān)鍵基因的決定子是當(dāng)前要解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。4動(dòng)物源性病毒的自然生態(tài)與傳染病發(fā)生的關(guān)系生態(tài)環(huán)境的惡化導(dǎo)致了許多人類傳染病的產(chǎn)生，動(dòng)物在自然狀態(tài)下正?；顒?dòng)也可能將新的病原體傳播給人類，人與動(dòng)物越來(lái)越

4、密切的接觸更直接地導(dǎo)致病原體侵入人類社會(huì)。所以，研究病毒相關(guān)動(dòng)物類群在自然狀態(tài)下的生態(tài)與病原體傳播和擴(kuò)散，探討病原體與自然宿主之間的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系等問(wèn)題，是解決自然疫源性疫病來(lái)源的重要途徑。5. 動(dòng)物源性人類新發(fā)傳染病模型動(dòng)物的建立模型動(dòng)物是研究傳染病發(fā)病機(jī)制、傳播機(jī)制以及預(yù)防和治療的重要手段。理想的疾病模型應(yīng)具備再現(xiàn)性好、復(fù)制率高以及專一性好等特點(diǎn)。模型動(dòng)物的建立和發(fā)展促進(jìn)了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的飛躍。建立人類新法疫病的動(dòng)物模型，不但使我們可正確認(rèn)識(shí)新發(fā)病原的致病機(jī)制、傳播機(jī)制，更重要的是我們研發(fā)疫苗和評(píng)價(jià)藥物效果等研究中的重要手段。主要研究?jī)?nèi)容1. 病毒與宿主細(xì)胞受體的作用機(jī)制以禽流感病毒和乙型腦炎病毒

5、等為突破口，闡明病毒與受體的親和特性以及和配體的相互作用機(jī)制，分析跨種群傳播多種細(xì)胞系感染和復(fù)制機(jī)制，解析病毒跨種間感染分子基礎(chǔ)；并根據(jù)宿主高度保守的受體蛋白和病毒囊膜蛋白的受體結(jié)合設(shè)計(jì)疫苗和藥物，提出行之有效的防治措施；根據(jù)目前國(guó)情的急需，重點(diǎn)研究我國(guó)當(dāng)前H5N1亞型流行毒株與不同嵌合類型細(xì)胞受體的親和特性和基因組變異對(duì)嗜性改變的影響，了解當(dāng)前禽流感病毒對(duì)人和動(dòng)物細(xì)胞受體的親和特點(diǎn)，解析當(dāng)前流行病毒的遺傳進(jìn)化特性，闡明對(duì)人類的潛在危害，為防控政策的制定提供科學(xué)依據(jù)。2. 病毒功能蛋白與宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白的相互作用組學(xué)以禽流感病毒和朊病毒等為突破口，利用酵母雙雜交和串聯(lián)親和純化技術(shù)篩選與病毒發(fā)生相

6、互作用的宿主細(xì)胞蛋白。對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，尋找蛋白與細(xì)胞靶蛋白發(fā)生結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，同時(shí)從細(xì)胞水平觀察病毒蛋白與細(xì)胞蛋白的相互作用對(duì)病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的影響。觀察病毒突變體和野生株在致病力和感染力等方面的差別。利用特異性的朊病毒多肽進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞朊病毒受體基因表達(dá)的定量，同時(shí)采用蛋白組學(xué)的研究方法確定參與蛋白構(gòu)象變化的宿主細(xì)胞因子，確定宿主的致病位點(diǎn)與朊病毒的遺傳關(guān)系，分析相關(guān)蛋白質(zhì)的多態(tài)性，對(duì)朊病毒的種間屏障進(jìn)行免疫學(xué)的分子基礎(chǔ)分析。3. 媒介/中間宿主在人畜共患病發(fā)生中的作用研究狂犬病毒和乙型腦炎等病毒等溯源，以野生動(dòng)物如蝙蝠、果子貍等為主要研究對(duì)象，開(kāi)展病毒在野生動(dòng)物中的生態(tài)學(xué)研究，確定其在自

7、然界的最終動(dòng)物宿主、病毒自然宿主庫(kù)和地域分布。研究狂犬病毒等重要流行毒株跨種感染機(jī)理；研究不同動(dòng)物（豬、鴨、鵪鶉等）在流感病毒進(jìn)化與傳播中的作用和病毒在免疫壓力下的遺傳與變異規(guī)律；蚊蟲(chóng)為代表的媒介在乙腦、登革熱（熱帶）、出血熱等病毒中中介作用的分子生態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，建立病毒資源庫(kù)、基因儲(chǔ)備庫(kù)和生物信息庫(kù)。4. 自然貯存宿主在病毒傳播中的作用 以蝙蝠源病毒和狂犬病病毒為突破口，確定我國(guó)境內(nèi)蝙蝠體內(nèi)感染和攜帶的幾種已知人類重要病毒的種類、分布及其變異規(guī)律，弄清狂犬病毒在野生動(dòng)物之間的傳播鏈，野生動(dòng)物行為生態(tài)學(xué)與病毒協(xié)同進(jìn)化之間的相互關(guān)系，弄清不同基因型狂犬病毒的地域分布情況。評(píng)價(jià)未知病毒對(duì)人畜的潛在危害

8、，研究病毒在蝙蝠等重要貯存動(dòng)物貯存和傳播的分子機(jī)理。調(diào)查禽流感病毒在侯鳥(niǎo)中的存在狀況，研究侯鳥(niǎo)遷徙與疫病流行的關(guān)系，為疫病防控政策的制定提供理論依據(jù)。5. 模型動(dòng)物在研究跨種間感染中的作用以H5亞型高致病性禽流感病毒、豬戊型肝炎病毒和狂犬病病毒等為突破口，建立致病和跨種間傳播的動(dòng)物模型。系統(tǒng)分析病毒在哺乳動(dòng)物模型的感染和致病能力。利用建立的模型動(dòng)物，闡明H5亞型禽流感病毒等的分子致病機(jī)制; 同時(shí)利用反向遺傳操作系統(tǒng)，研究決定病毒跨越宿主屏障能力以及致病力的分子機(jī)制，為人類新發(fā)動(dòng)物源性疫病的預(yù)防和控制提供信息及理論技術(shù)支撐。二、預(yù)期目標(biāo)總體目標(biāo)通過(guò)本項(xiàng)目的研究，闡明目前主要?jiǎng)游镌葱圆《静〉闹虏C(jī)

9、理、發(fā)生機(jī)制和跨種間傳播的分子和細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題，確定病毒功能蛋白基因的遺傳變異與致病性、宿主范圍、分子生態(tài)進(jìn)化等關(guān)系，揭示動(dòng)物源性病毒病的分子發(fā)生機(jī)理，在病毒演化規(guī)律、種間屏障突破機(jī)制、病毒與細(xì)胞受體關(guān)系和宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白的分子作用機(jī)制方面取得創(chuàng)新性成果，推動(dòng)我國(guó)在該領(lǐng)域的研究達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平，為研發(fā)動(dòng)物源性新發(fā)人類傳染病的科學(xué)控制技術(shù)提供理論根據(jù)，進(jìn)而為國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展、社會(huì)穩(wěn)定、公眾健康提供科學(xué)可信的保障。五年預(yù)期目標(biāo)1. 確定主要病毒識(shí)別宿主細(xì)胞受體的進(jìn)化規(guī)律與跨種間感染的分子機(jī)制，可考核指標(biāo)如下：（1）利用遺傳學(xué)方法，進(jìn)行基因突變，體外真核表達(dá)病毒識(shí)別宿主細(xì)胞受體蛋白，研究這些基因上

10、的一些重要的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)的改變，對(duì)其受體結(jié)合功能和侵入細(xì)胞功能的影響，以及與病毒高致病力的關(guān)系，從而深入了解病毒的致病機(jī)制及變異規(guī)律，探索抑制病毒入侵的方法。（2）在分子水平上進(jìn)一步了解和認(rèn)識(shí)毒種間傳播機(jī)理，并針對(duì)病毒吸附和侵入分子機(jī)制，設(shè)計(jì)小分子藥物阻斷劑。（3）應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染等現(xiàn)代技術(shù)，在不用操作活病毒的基礎(chǔ)上，找尋黃病毒受體。2. 建立主要病毒蛋白與人類宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白互作組學(xué)平臺(tái)，可考核指標(biāo)如下：（1）研究病毒蛋白與宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白的相互作用，篩選與病毒相關(guān)蛋白發(fā)生相互作用的細(xì)胞內(nèi)靶蛋白，探討相關(guān)新蛋白與靶蛋白之間的相互作用對(duì)病毒復(fù)制、裝配、出芽等方面的影響。（2）闡明蛋白的相互作用在病

11、毒復(fù)制過(guò)程中以及感染后細(xì)胞發(fā)生病變的分子機(jī)制、種間屏障突破機(jī)制和種間差異的分子機(jī)制。（3）提供研制小分子藥物治療動(dòng)物源性病毒病的理論依據(jù)。3. 建立主要?jiǎng)游镌葱圆《咎烊毁A存宿主的病原生態(tài)學(xué)研究平臺(tái)，可考核指標(biāo)如下：（1）確定禽流感、狂犬病毒等病毒的起源、病毒自然宿主庫(kù)、流行病學(xué)和分子流行病學(xué)、遺傳變異和分子進(jìn)化以及跨物種感染機(jī)制。（2）解析病毒在生態(tài)鏈中的傳播規(guī)律以及病毒與家養(yǎng)動(dòng)物、野生動(dòng)物之間的協(xié)同進(jìn)化規(guī)律，確定病毒在自然界的最終動(dòng)物宿主和病毒自然宿主庫(kù)以及病毒的地域分布圖。（3）比較不同地理區(qū)域，不同動(dòng)物來(lái)源病毒的遺傳信息，揭示其變異和分子進(jìn)化規(guī)律及跨物種感染的生態(tài)進(jìn)化規(guī)律。4. 建立動(dòng)物

12、源性疾病的生態(tài)傳播模型，可考核指標(biāo)如下：（1）確定我國(guó)主要媒介動(dòng)物蝙蝠體內(nèi)感染和攜帶的幾種已知人類重要病毒的種類、分布及其變異規(guī)律的分子流行病學(xué)。（2）通過(guò)血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)手段調(diào)查不同地區(qū)不同季節(jié)蝙蝠體內(nèi)病毒的攜帶或感染狀況和分布規(guī)律。（3）了解未知病毒的種類、分布和敏感宿主，評(píng)價(jià)未知病毒對(duì)人畜的潛在危害。（4）提供未知病毒的檢測(cè)和預(yù)防方法，建立新生病毒血清學(xué)和分子生物學(xué)診斷、監(jiān)測(cè)技術(shù)。5. 建立H5亞型病毒和豬戊型肝炎病毒等動(dòng)物模型，可考核指標(biāo)如下：（1）系統(tǒng)分析H5亞型病毒和豬戊型肝炎病毒在哺乳動(dòng)物模型的感染和致病能力，并建立禽流感、豬戊型肝炎病毒和狂犬病等動(dòng)物模型。（2）利用建立的

13、模型動(dòng)物，闡明H5亞型禽流感病毒等的分子致病機(jī)制。（3）利用反向遺傳操作系統(tǒng)，研究決定病毒跨越宿主屏障能力以及致病力的分子機(jī)制。三、研究方案總體思路：綜合現(xiàn)代病原生態(tài)學(xué)、分子病毒學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)等，利用學(xué)科交叉，發(fā)揮多學(xué)科優(yōu)勢(shì)，從群體、個(gè)體、細(xì)胞、分子不同層次上，研究動(dòng)物源性病原的結(jié)構(gòu)、致病性、分子生態(tài)、跨種間傳播的發(fā)生機(jī)理。重點(diǎn)圍繞動(dòng)物流感病毒、日本乙型腦炎病毒、狂犬病病毒、朊病毒、副粘病毒等動(dòng)物源性病毒，以解決這些疾病致病機(jī)理和跨種間傳播發(fā)生機(jī)制為關(guān)鍵，從不同角度對(duì)這些病原的分子致病特性、與宿主細(xì)胞的相互作用關(guān)系、媒介傳播與宿主之間的關(guān)系、物種之間種間屏障基

14、礎(chǔ)進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究。技術(shù)路線：詳見(jiàn)流程圖（圖1）。本研究的技術(shù)路線將全面系統(tǒng)地深入研究當(dāng)前危害嚴(yán)重發(fā)病率高的重要?jiǎng)游镌葱圆《镜闹虏⌒约捌溥M(jìn)化的分子基礎(chǔ)，疾病傳播的遺傳規(guī)律和種間傳染的分子基礎(chǔ)。動(dòng)物源性病毒疾病跨種間感染研究方案示意圖可行性分析：1. 本項(xiàng)目中有動(dòng)物學(xué)、生態(tài)學(xué)、分子病毒學(xué)、分子免疫學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的交叉，集成與優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)可以創(chuàng)新一系列方法，使我們有能力解析動(dòng)物源性傳染病的發(fā)生機(jī)制，例如蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中蛋白質(zhì)1D和2D電泳、酵母雙雜交、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等技術(shù)的綜合構(gòu)成了研究病毒與宿主細(xì)胞相互作用的技術(shù)平臺(tái)。2. 本項(xiàng)目集中了國(guó)內(nèi)最強(qiáng)勢(shì)的動(dòng)物傳染病學(xué)、分子病毒學(xué)與生態(tài)學(xué)、分子免疫學(xué)

15、研究隊(duì)伍，首次在國(guó)內(nèi)大規(guī)模協(xié)作、系統(tǒng)開(kāi)展動(dòng)物源性新發(fā)人類傳染病發(fā)生機(jī)制的基礎(chǔ)研究，由此而構(gòu)建的平臺(tái)對(duì)快速解決今后新發(fā)疫病的防控有重要作用。3. 本項(xiàng)目的研究領(lǐng)域?qū)儆趪?guó)際熱點(diǎn)領(lǐng)域，研究?jī)?nèi)容屬于該領(lǐng)域的前沿，國(guó)際上該方面的研究多數(shù)屬于某一環(huán)節(jié)的研究，涉及多個(gè)層面上的系統(tǒng)研究還較有限，我們集中國(guó)內(nèi)的優(yōu)勢(shì)力量，極有可能在該領(lǐng)域取得一些突破性成果。4. 參與單位具有良好的工作基礎(chǔ)，承擔(dān)過(guò)在新發(fā)傳染病相關(guān)領(lǐng)域的國(guó)家自然科學(xué)基金、863項(xiàng)目和國(guó)家攻關(guān)項(xiàng)目，有了相當(dāng)?shù)姆e累，具備開(kāi)展本研究的工作基礎(chǔ)。創(chuàng)新點(diǎn)與特色：1. 本課題緊緊抓住動(dòng)物源性病毒在人類及其它動(dòng)物中存活、增殖并可能同時(shí)致病的特點(diǎn)，從分子生態(tài)與分子

16、進(jìn)化（群體）和蛋白質(zhì)互作（個(gè)體）的獨(dú)特視角，系統(tǒng)探討跨種傳播模式及其相關(guān)機(jī)制。2. 運(yùn)用分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)手段，闡明病毒在其媒介及終末宿主中生物學(xué)特征差異的細(xì)胞與分子基礎(chǔ)，為進(jìn)一步設(shè)計(jì)干預(yù)這種傳播鏈的新型抑制劑提供依據(jù)。3. 通過(guò)對(duì)同種病毒在不同種屬動(dòng)物及人類中使用受體及與宿主細(xì)胞因子互作的不同，探尋人畜（動(dòng)物）共患病發(fā)生與致病機(jī)制，為設(shè)計(jì)新型藥物與疫苗提供理論基礎(chǔ)。4對(duì)一些可能傳入我國(guó)的重要?jiǎng)游镌葱圆《具M(jìn)行預(yù)研，防患于未然，尤其是在東南亞和附近地區(qū)已經(jīng)形成嚴(yán)重態(tài)勢(shì)、我國(guó)境內(nèi)又有相關(guān)動(dòng)物貯存宿主的病毒。5. 通過(guò)模型動(dòng)物的建立，分析禽流感病毒、戊型肝炎病毒等對(duì)哺乳動(dòng)物的感染性和致病能力，并

17、利用現(xiàn)代基因操作技術(shù)研究病毒跨種間傳播的分子遺傳機(jī)制。四、年度計(jì)劃研究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年研究病毒識(shí)別宿主細(xì)胞受體蛋白基因重要結(jié)構(gòu)位點(diǎn)對(duì)其受體結(jié)合功能和侵入細(xì)胞功能的影響，篩選與病毒蛋白發(fā)生相互作用的宿主細(xì)胞蛋白，探索抑制病毒入侵的方法；不同動(dòng)物在重要病毒貯存、進(jìn)化與傳播中的作用；病毒在哺乳動(dòng)物模型的感染和致病能力，并建立禽流感、豬戊型肝炎病毒等動(dòng)物模型。（1）體外制備病毒識(shí)別宿主細(xì)胞受體蛋白，了解病毒的致病機(jī)制及變異規(guī)律，探索抑制病毒入侵的方法。（2） 篩選出23種與病毒蛋白相互作用的宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白。（3）明確禽流感病毒、狂犬病毒等病原在野生禽鳥(niǎo)、動(dòng)物和家畜的生態(tài)分布和病毒進(jìn)化特點(diǎn)。（4）查明

18、重要貯存宿主如蝙蝠等體內(nèi)重要病毒的攜帶狀況，并進(jìn)行病毒基因變異和分子進(jìn)化特征分析。（5）建立H5亞型病毒和豬戊型肝炎病毒等動(dòng)物模型。第二年研究病毒蛋白與宿主蛋白的相互作用對(duì)病毒復(fù)制的影響，在分子水平上認(rèn)識(shí)病毒種間傳播機(jī)理，并針對(duì)病毒吸附和侵入分子機(jī)制，研究設(shè)計(jì)小分子藥物阻斷劑；研究在不同動(dòng)物在流感病毒進(jìn)化的作用以及病毒在選擇壓力下的變異規(guī)律；研究病毒在蝙蝠等重要貯存動(dòng)物貯存和傳播的分子機(jī)理；研究建立評(píng)價(jià)決定病毒跨越宿主屏障能力以及致病力分子機(jī)制的操作技術(shù)平臺(tái)。（1） 針對(duì)病毒吸附和侵入分子機(jī)制，設(shè)計(jì)46種小分子藥物阻斷劑。（2）應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染等現(xiàn)代技術(shù)，在不用操作活病毒的基礎(chǔ)上，找尋黃病毒類受體。（3）建立禽流感病毒和狂犬病病毒等病毒資源庫(kù)、基因儲(chǔ)備庫(kù)和生物信息庫(kù)。（4）病毒在蝙蝠等重要貯存動(dòng)物貯存和傳播的分子機(jī)理。（5）建立穩(wěn)定的反向遺傳操作技術(shù)平臺(tái)。第三年病毒功能基因組的變異對(duì)病毒受體結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別功能、致病性及嗜性的影響；選擇壓力對(duì)基因組結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用；比較不同地理區(qū)域，不同動(dòng)物來(lái)源病毒的遺傳信息，建立病毒資源庫(kù)、基因儲(chǔ)備庫(kù)和生物信息庫(kù)