2022年流式微球聯(lián)合檢測(cè)炎癥性因子(1)

1、流式微球聯(lián)合檢測(cè)炎癥性因子IL-6、TNF-和MCP-1方法學(xué)的建立和評(píng)價(jià)令狐穎1 張程2 陳艷2 黃山基金工程：貴陽(yáng)市科技局社會(huì)開(kāi)展領(lǐng)域科技攻關(guān)工程2021筑科農(nóng)合同字第1-社-35號(hào)和貴州省衛(wèi)生廳立項(xiàng)資助工程Gzwlj2009-1-007。*通訊作者。* 許健1 劉志琴3 1.貴州省人民醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，貴州貴陽(yáng) 550002；2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院09級(jí)碩士研究生；3.本院心內(nèi)科【摘要】 目的 建立流式微球分析技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)人血清中細(xì)胞介素-6IL-6、腫瘤壞死因子-TNF-和單核細(xì)胞趨化因子-1MCP-1的方法并對(duì)其進(jìn)展系統(tǒng)性評(píng)價(jià)。方法 分別將三種選擇好一定濃度的捕獲抗體IL-6、TNF-和MC

2、P-1鼠抗人單克隆抗體包被在三種已激活的不同熒光強(qiáng)度編碼的羧基化聚苯乙烯微球上，用正交試驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)展優(yōu)化選擇，并應(yīng)用CLSI的有關(guān)規(guī)那么進(jìn)展方法學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)選擇各種捕獲單克隆抗體的參加量為10µg，各種生物素標(biāo)記的羊抗人單克隆抗體的稀釋倍數(shù)為1:540，第一次反響時(shí)間為2h、洗滌二次，PE標(biāo)記親和素的稀釋倍數(shù)為1:1000，第二次反響1h洗滌一次。方法學(xué)評(píng)價(jià)顯色： IL-6線性范圍是1.133333.33 pg/mL，批內(nèi)變異系數(shù)為1.98%2.31%，批間變異系數(shù)為3.52%4.17%，準(zhǔn)確度相對(duì)偏倚為0.19%0.66%，回收率是95.4101.5%，靈敏度為1.13

3、pg/mL； TNF-線性范圍是1.071111.11 pg/mL，批內(nèi)變異系數(shù)為2.67%2.90%，批間變異系數(shù)為4.27%4.91%，準(zhǔn)確度相對(duì)偏倚為0.85%1.53%，回收率是97.3104.2%，靈敏度為1.07 pg/mL； MCP-1線性范圍是7.073333.33 pg/mL，批內(nèi)變異系數(shù)為2.63%2.92%，批間變異系數(shù)為3.70%4.23%，準(zhǔn)確度相對(duì)偏倚為0.15%1.06%，回收率是95.2104.3%，靈敏度為7.07 pg/mL.高濃度的甘油三酯、膽固醇和膽紅素對(duì)三種因子有一定的干擾率，低濃度的甘油三酯、膽固醇和膽紅素對(duì)三種因子干擾較小。分別與ELISA方法比擬

4、無(wú)顯著差異。結(jié)論 自建的IL-6、TNF-和MCP-1流式微球聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)，可拓展流式細(xì)胞分析技術(shù)，值得臨床推廣使用?！娟P(guān)鍵詞】流式微球分析技術(shù)CBA； 聯(lián)合檢測(cè)；細(xì)胞介素-6IL-6；腫瘤壞死因子-TNF-；單核細(xì)胞趨化因子-1MCP-1)Development and evaluation of a Cytometric Bead Assay Multiplex Detection Method for the detection of IL-6、TNF-and MCP-1LING-Hu ying1,HUANG Shan1，ZHANG Cheng2, CHEN Yan2, XU Jian1

5、，LIU Zhi-qin3(1. Guizhou Province Center for Clinical Laboratory;2.Guiyang Medical College;3. Guizhou Province People's Hospital)【Abstract】 Objective To development and Systematic review of a cytometric bead array Multiplex Detection Method for the detection of IL-6, TNF- and MCP-1. Method A cer

6、tain concentration of three kinds of capture antibody (mouse anti-human IL-6 monoclonal antibody, mouse anti-human TNF- monoclonal antibody, mouse anti-human MCP-1 monoclonal antibody) were respectively coated with three kinds of activated beads, and according orthogonal experiment to select the bes

7、t test conditions, and applying the relevant rules of CLSI to methodology evaluation. Result In the reaction, the best quantity of the three kinds of mouse anti-human monoclonal antibody was 10g, the best dilution of biotin-labeled monoclonal antibody was 1:540, the best incubation time was 2 hours,

8、 the first washing time was 2, the beat dilution of streptavidin-PE was 1:1000, the best incubation time of streptavidin-PE was 1 hours, the second washing time was 1. According the methodology evaluation, the linear range of IL-6 was 1.13-3333.33 pg / ml, the intra-assay of variation was 1.98% and

9、2.31%, the inter-assay of variation was 3.52% and 4.17%, the relative bias was 0.19% and 0.66%, the recovery was 95.4-101.5%, the sensitivity was 1.13 pg/ml; the linear range of TNF- was 1.07-1111.11 pg / ml, the intra-assay of variation was 2.67% and 2.90%, the inter-assay of variation was 4.27% an

10、d 4.91%, the relative bias was 0.85% and 1.53%, the recovery was 97.3-104.2%, the sensitivity was 1.07 pg/ml; the linear range of MCP-1 was 7.07-3333.33 pg / ml, the intra-assay of variation was 2.63% and 2.92%, the inter-assay of variation was 3.70% and 4.23%, the relative bias was 0.15% and 1.06%,

11、 the recovery was 95.2-104.3%, the sensitivity was 7.07 pg/ml. The high levels of triglyceride, cholesterol and bilirubin had a certain interference to detection, the low levels of triglyceride, cholesterol and bilirubin had a minor disturbance, and it had no significant difference with ELISA. Concl

12、usion Cytometric bead array multiplex detection method to detect IL-6, TNF- and MCP-1 can be used in the clinical and expansion of flow cytometry.【Key words】Cytometric bead array; Multiplex detection; IL-6、TNF-;MCP-1.目前，冠心病coronary artery heart disease, CHD已成為危害我國(guó)人民群眾生命和安康的重大疾病1。近年來(lái)的研究，明確了血管壁的炎癥性變化在

13、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化及其并發(fā)癥的發(fā)生進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮了非常大的作用。許多炎癥性因子，如白細(xì)胞介素-6IL-6、腫瘤壞死因子-TNF-和單核細(xì)胞趨化因子-1MCP-1等炎性因子參與了動(dòng)脈粥樣硬化的形成過(guò)程。隨著流式細(xì)胞技術(shù)的不斷普及，對(duì)同一標(biāo)本進(jìn)展多參數(shù)的流式微球聯(lián)合檢測(cè)，具有廣闊的應(yīng)用前景。本文利用微球熒光編碼技術(shù)，結(jié)合流式細(xì)胞分析技術(shù)，建立了IL-6、TNF-和MCP-1的流式微球聯(lián)合檢測(cè)分析技術(shù)，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，節(jié)約本錢(qián)等特點(diǎn)。1 材料和方法1.1 標(biāo)本來(lái)源 血漿標(biāo)本采自2021年9月2021年3月貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科已確診的心肌梗死患者和安康體檢者。清晨空腹采血，別離血漿，-80保存待

14、檢。1.2 主要儀器和試劑 IL-6、TNF-和MCP-1標(biāo)準(zhǔn)品，IL-6、TNF-和MCP-1鼠抗人單克隆抗體濃度均為100g/ml，IL-6、TNF-和MCP-1生物素標(biāo)記的羊抗人二抗?jié)舛染鶠?.2mg/ml，以上均為美國(guó)R&D公司產(chǎn)品，熒光素FITC標(biāo)記羊抗鼠IgGabcam公司，2mg/ml，羧基化微球Bio-Rad公司，PE標(biāo)記的親和素eBioscience公司，0.2mg/ml，甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品、 膽紅素標(biāo)準(zhǔn)品和膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品天津一方科技，人IL-6、TNF-和MCP-1 ELISA檢測(cè)試劑盒R&D公司產(chǎn)品，批號(hào)分別為CK-E10140H、CK-E10110H和CK-E

15、10136H，BD Array流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀等。1.3 方法 試驗(yàn)條件的選擇分別取100µl三種已用不同熒光素標(biāo)記的羧基化微球，參考文獻(xiàn)2激活微球，分別在濃度系列依次是0µg、1.25µg、2.5µg、5µg、10µg、20µg的三種鼠抗人單克隆抗體參加25ug/ml的FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG50µl，反響后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度中位數(shù)MFImedian fluorescence intensity，制著劑量反響曲線，選擇適宜的鼠抗人單克隆抗體最正確聯(lián)接量。按文獻(xiàn)2的方法進(jìn)展微球偶聯(lián)。用正交試驗(yàn)對(duì)生物素標(biāo)記

16、抗體地的釋倍數(shù)、孵育時(shí)間、洗滌次數(shù)、PE標(biāo)記的親和素的稀釋倍數(shù)、標(biāo)記了親和素后的第二次孵育時(shí)間和洗滌次數(shù)等驗(yàn)條件進(jìn)展優(yōu)化。1.3.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)應(yīng)用CLSI的有關(guān)規(guī)那么對(duì)流式微球分析技術(shù)檢測(cè)IL-6 、TNF-、MCP-1的線性、精細(xì)度、準(zhǔn)確度、靈敏度、回收實(shí)驗(yàn)、干擾試驗(yàn)和方法學(xué)比照等分析性能進(jìn)展系統(tǒng)性評(píng)價(jià)3。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，方差分析、2檢驗(yàn)和兩組間比擬以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.結(jié)果2.1 流式微球聯(lián)合檢測(cè)方法學(xué)的建立經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，熒光強(qiáng)度中位數(shù)MFI隨著鼠抗人單克隆抗體的增加而增加，考慮試劑本錢(qián)及試驗(yàn)的有效性，IL-

17、6、TNF-和MCP-1單克隆抗體的最正確連結(jié)量均為10µg。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，利用SPSS3.0軟件分析，IL-6、TNF-、MCP-1流式微球檢測(cè)條件優(yōu)化為：試驗(yàn)體系中，生物素標(biāo)記抗體的稀釋倍數(shù)為1:540、第一次孵育時(shí)間為2h、第一次洗滌次數(shù)是2次、PE標(biāo)記親和素的稀釋倍數(shù)選擇1:1000、第二次孵育時(shí)間選擇1h、第二次洗滌次數(shù)為1次。以羧基化微球標(biāo)記的不同的熒光素為定性根底，按優(yōu)化的試驗(yàn)條件選擇實(shí)驗(yàn)參數(shù)，按儀器說(shuō)明書(shū)操作，即建立了流式微球聯(lián)合檢測(cè)IL-6、TNF-和MCP-1的分析技術(shù)。2.2 靈敏度試驗(yàn)：對(duì)自建方法進(jìn)展靈敏度試驗(yàn)， IL-6檢測(cè)靈敏度為1.13pg/mL，T

18、NF-檢測(cè)靈敏度為1.07pg/mL，MCP-1檢測(cè)靈敏度為：7.07pg/mL。2.3 線性實(shí)驗(yàn)：按自建的流式微球聯(lián)合檢測(cè)法檢測(cè)IL-6、TNF-、MCP-1標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋濃度，結(jié)合靈敏度試驗(yàn)， IL-6在濃度1.133333.33pg/ml，其線性良好，曲線相關(guān)系數(shù)為0.9999，曲線方程為：y=0.8361x+100.88。TNF-在濃度1.07-1111.11pg/ml，其線性良好，曲線相關(guān)系數(shù)為0.9969，曲線方程為：y=0.2571x+105.50。MCP-1在濃度7.07-3333.33pg/ml，其線性良好，曲線相關(guān)系數(shù)為0.9989，曲線方程為：y=0.4696x+91.7

19、1。2.4精細(xì)度試驗(yàn)： 按自建的方法對(duì)不同濃度的IL-6、TNF-、MCP-1稀釋樣品進(jìn)展精細(xì)度試驗(yàn)，IL-6低高兩個(gè)稀釋濃度標(biāo)準(zhǔn)品4.57 pg/mL和123.46pg/mL的批內(nèi)變異系數(shù)分別為2.31%、1.98%，批間變異系數(shù)分別為4.17%、3.52%；TNF-低高兩個(gè)稀釋濃度標(biāo)準(zhǔn)品4.57 p g/mL和123.46 p g/mL的批內(nèi)變異系數(shù)分別為2.67%、2.90%，批間變異系數(shù)分別為4.27%、4.91%； MCP-1低高兩個(gè)稀釋濃度標(biāo)準(zhǔn)品13.72 ng/mL和370.37 pg/mL的批內(nèi)變異系數(shù)分別為2.63%、2.92%，批間變異系數(shù)分別為3.70%、4.23%。2.

20、5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)：根據(jù)自建方法，選擇IL-6標(biāo)準(zhǔn)品濃度為4.57 pg/mL和123.46pg/mL，TNF-標(biāo)準(zhǔn)品濃度為4.57 p g/mL和123.46 p g/mL, MCP-1標(biāo)準(zhǔn)品濃度為13.72 ng/mL和370.37 pg/mL進(jìn)展驗(yàn)證試驗(yàn)，IL-6的相對(duì)偏倚分別為0.19%和0.66%，回收率是95.4101.5%； TNF-的相對(duì)偏倚分別為0.85%、1.53%，回收率是97.3104.2%；MCP-1的相對(duì)偏倚分別為1.06%、0.15%，回收率是95.2104.3%。2.6干擾實(shí)驗(yàn)：取病人血漿，參加不同濃度的甘油三酯、膽固醇和膽紅素作干擾試驗(yàn)，高濃度的甘油三酯37mmo

21、l/L、膽固醇13mmol/L和膽紅素0.34 mmol/L混合干擾物對(duì)IL-6、TNF-和MCP-1測(cè)定時(shí)的干擾率分別為12.1%、11.6%和9.4%，對(duì)檢測(cè)有一定的干擾。較低濃度的甘油三酯18.5mmol/L、膽固醇6.5mmol/L和膽紅素0.17mmol/L混合干擾物對(duì)IL-6、TNF-和MCP-1測(cè)定時(shí)的干擾率分別為6.7%、5.8%和3.4%，對(duì)檢測(cè)干擾較小。2.7方法比照實(shí)驗(yàn)：80份血漿標(biāo)本中IL-6、TNF-、MCP-1水平采用自建方法和ELISA法試劑試劑盒同時(shí)進(jìn)展檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)采用配對(duì)t檢驗(yàn)， t值分別是0.44、1.09和0.94， P值均大于0.05，兩種檢測(cè)方法無(wú)

22、顯著差異。3 討論許多炎癥性因子，如白細(xì)胞介素-6IL-6、腫瘤壞死因子-TNF-和單核細(xì)胞趨化因子-1MCP-1等參與了動(dòng)脈粥樣硬化的形成過(guò)程4,5。在炎癥性標(biāo)志物的檢驗(yàn)中，方法較多，常用的有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、放射免疫試驗(yàn)、免疫比濁等。ELISA法影響因素較多，而且存在著標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題。放免法由于存在放射性污染問(wèn)題，在臨床上的應(yīng)用也逐漸減少。免疫比濁法對(duì)抗體和增濁劑的質(zhì)量要求很高，試劑和儀器較貴6。近年來(lái)，流式細(xì)胞分析技術(shù)Flow Cytometer，F(xiàn)CM已廣泛應(yīng)用于臨床，應(yīng)用前景不斷擴(kuò)大，開(kāi)展流式微球分析技術(shù)cytometric bead assay, CBA，那么檢測(cè)所需樣本量更少，并大大

23、縮短操作時(shí)間，同時(shí)其特異性強(qiáng)，靈敏度高，如果將多種熒光強(qiáng)度具有明顯差異的微球, 分別用不同的特異性抗體包被, 將包被好的微球(捕獲微球) 混合, 并與標(biāo)準(zhǔn)/或待檢樣本及熒光素標(biāo)記的特異性檢測(cè)抗體一起反響, 可對(duì)樣本中的多種可溶性細(xì)胞因子或蛋白質(zhì)同時(shí)進(jìn)展CBA定量，從而進(jìn)展流式微球的多參數(shù)聯(lián)合檢測(cè)分析。本文就編碼不同的羧基化微球，建立的對(duì)IL-6、TNF-和MCP-1的流式微球聯(lián)合檢測(cè)方法。對(duì)于一個(gè)檢驗(yàn)方法或檢測(cè)系統(tǒng)的建立，為保證檢驗(yàn)質(zhì)量，確保檢測(cè)系統(tǒng)的有效性，必須對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)展系統(tǒng)性評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)的主要內(nèi)容包括幾大性能，如分析靈敏度、線性、精細(xì)度、準(zhǔn)確度干擾試驗(yàn)及方法比對(duì)等。只有真正驗(yàn)證了檢測(cè)系統(tǒng)的分析性能符合臨床要求，或與公認(rèn)的質(zhì)量指標(biāo)根本一致，才可以將檢測(cè)系統(tǒng)用于臨床常規(guī)檢驗(yàn)。一個(gè)可靠、有效的檢測(cè)系統(tǒng)性能評(píng)價(jià)，是建立在臨床檢驗(yàn)全面質(zhì)量管理根底上的，是臨床檢驗(yàn)全面質(zhì)量管理的深化和提高。本文通過(guò)對(duì)自建IL-6、TNF-和MCP-1的流式微球聯(lián)合檢測(cè)方