AFLP試驗(yàn)方法

1、模塊八分子標(biāo)記技術(shù)SSR技術(shù)1 .實(shí)驗(yàn)?zāi)康睦矛F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)揭示DNA序列的遺傳多態(tài)性即建立DNA水平上的遺傳標(biāo)記。為分子遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析與種質(zhì)鑒定、重要性狀基因定位與圖位克隆、轉(zhuǎn)基因生物鑒定、分子標(biāo)記輔助育種等研究奠定實(shí)驗(yàn)技能基礎(chǔ)。通過此實(shí)驗(yàn)了解和掌握利用SSR和AFLP分子標(biāo)記檢測日!物基因組DNA的遺傳多態(tài)性的基本原理和實(shí)驗(yàn)方法。2 .實(shí)驗(yàn)原理SSR:根據(jù)SSR兩端保守的單拷貝序列設(shè)計(jì)一對特異引物，通過PCR技術(shù)將其間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴(kuò)增出來，利用電泳分析技術(shù)就可獲得其長度多態(tài)性。每個(gè)SSR座位兩側(cè)一般是相對保守的單拷貝序列，擴(kuò)增每個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星DNA序列，再經(jīng)聚

2、丙烯酰胺凝膠電泳，比較擴(kuò)增帶的帶型，就可檢測到不同個(gè)體在某個(gè)SSR座位上的多態(tài)性。3 .實(shí)驗(yàn)儀器離心機(jī)、移液器(100-1000ul,10-50U1)、PCR儀、垂直板電泳設(shè)備。4 .實(shí)驗(yàn)試劑MgC12,引物，dNTP,10XPCR緩沖?夜,DNA聚合酶，無菌去離子水。5 .實(shí)驗(yàn)方法(1)將200山離心管、模板DNA、引物、dNTP、10Xbuffer、無菌去離子水和DNA聚合酶置于冰上溶解。(2)依次向無菌的200山離心管中加入如下成份，輕輕混勻，離心去除氣泡。模板DNA20-60ngMgCl215-40nmol引物(各)2-8pmoldNTP1-5nmolPCR緩沖液1XDNA聚合酶1-5

3、UTotal20L(3)將離心管置于PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。94C2min94C50sec150-65C30sec>35循環(huán)72C90secj72C7min4Coo(4)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：利用聚丙烯酰胺凝膠檢測SSR-PCR結(jié)果。SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可能僅僅存在幾個(gè)堿基的差異，通常采用聚丙烯酰胺凝膠(銀染體系)電泳方法檢測。相對于瓊脂糖凝膠電泳而言，聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠更好的區(qū)分微小片斷的差異，能夠檢出的等位基因位點(diǎn)多，多態(tài)性信息含量值較高，因此適用于SSR標(biāo)記的結(jié)果檢測。兩種銀染檢測體系是在聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)束后，用固定劑將核酸固定到凝膠上，使銀染劑中的銀離

4、子與核酸牢固結(jié)合，再通過還原劑將銀離子還原而發(fā)生顯色反應(yīng)。6 .實(shí)驗(yàn)結(jié)果SSR-PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果7 .注意事項(xiàng)由于SSR技術(shù)是基于PCR的一種分子標(biāo)記，所以模板DNA、DNA聚合酶、dNTP以及Mg2+的濃度等因素會(huì)影響SSR的結(jié)果。如果參與反應(yīng)的某些因子條件不適合，則會(huì)導(dǎo)致圖譜彌散狀背景的產(chǎn)生，擴(kuò)增產(chǎn)物的消失以及電泳譜帶位置的改變。改進(jìn)反應(yīng)條件的措施主要有：(1)保證DNA模板的質(zhì)量。DNA模板的質(zhì)量直接影響到PCR的效果，要求模板中的蛋白質(zhì)、糖及其它雜質(zhì)含量低。(2)不同引物的退火溫度應(yīng)根據(jù)引物的Tm略有變動(dòng)。(3)設(shè)置模板DNA、DNA聚合酶、dNTP以及Mg2+的濃度梯度。

5、AFLP技術(shù)1 .實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握AFLP分子標(biāo)技術(shù)的原理、操作方法和實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)，了解AFLP分子標(biāo)記技術(shù)在分子輔助育種中的應(yīng)用。2 .實(shí)驗(yàn)原理基因組DNA用兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，形成分子量大小不等的限制性酶切片段，然后把酶切片段與有共同粘性末端的人工接頭連接，連接后的粘性末端序列和接頭序列作為PCR反應(yīng)引物的結(jié)合位點(diǎn)，通過PCR反應(yīng)對酶切片段進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增。由于限制性片段太多，全部擴(kuò)增則產(chǎn)物難以在膠上分開，為此在引物的3'端加入1-3個(gè)選擇性堿基，這樣只有那些能與選擇性堿基配對的片段才能與引物結(jié)合，成為模板被擴(kuò)增，從而達(dá)到對限制性片段進(jìn)行選擇擴(kuò)增的目的；最后通過聚丙

6、烯酰胺凝膠電泳，將這些特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物分離開來。3 .儀器設(shè)備離心機(jī)，培養(yǎng)箱，微量移液器，制冰機(jī)，離心機(jī)，PCR儀。4 .實(shí)驗(yàn)試劑：MseI,EcoRI,10X酶切緩沖液，MseI接頭，EcoRI接頭，T4-連接酶，MseI引物，EcoRI弓I物，dNTP,10XPCR緩沖?夜,DNA聚合酶。MseI引物II,EcoRI引物II,dNTP,無菌去離子水。5 .實(shí)驗(yàn)方法(1)接頭的設(shè)計(jì)AFLP接頭是雙鏈的寡核甘酸，其設(shè)計(jì)遵循隨機(jī)引物的設(shè)計(jì)原則，可采用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)。人工接頭5'端去磷酸化，這樣接頭只有一端可以被連接到酶切片段的末端。AFLP接頭一般由二部分組成：

7、即核心序列和限制性內(nèi)切酶識別序列。通常采用EcoRI和MseI兩個(gè)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切操作，設(shè)計(jì)的EcoRI接頭和MseI接頭如下表所示。EcoRI-接頭MseI-接頭5，/CTCGTAGACTGCGTACCGACGATGAGTCCTGAG5-CATCTGACGCATGGTAA5'TACTCAGGACTCT-5'AFLP接頭構(gòu)成示意圖(2)引物的設(shè)計(jì)AFLP引物的設(shè)計(jì)主要由接頭的設(shè)計(jì)決定，其長度一般為16-20個(gè)堿基，AFLP引物的5'端是與接頭序列相對應(yīng)的。AFLP引物的一個(gè)重要特征是所有引物起始于5-G殘基。值得注意的是，無論5'端是何種堿基，dNTP濃度過

8、低時(shí)容易產(chǎn)生雙鏈結(jié)構(gòu)。3'端選擇性堿基一般不超過3個(gè)*6,當(dāng)引物帶有1-2個(gè)選擇性堿基時(shí)，引物的選擇較好；當(dāng)選擇性堿基增加到3個(gè)時(shí)，引物的選擇特異性仍可接受；當(dāng)引物的選擇性堿基增加到4個(gè)時(shí)，引物與模板的錯(cuò)配率增加，擴(kuò)增特異性下降，會(huì)出現(xiàn)原指紋圖譜中未出現(xiàn)的條帶。對于雙酶切反應(yīng)而言，引物組合數(shù)共有(2n)種，n為選擇堿基的數(shù)目。引物主要由3部分組成即5'端核心序列、酶切位點(diǎn)序列、3'端選擇性延伸序列(以EcoRI弓I物和MseI引物為例，下同)。AFLP接頭構(gòu)成引物名稱5'端核心序列酶切位點(diǎn)序列選擇性延伸序列EcoRI引物5-GACTGCGTACCAATTCNNN

9、-3MseI引物5-GATGAGTCCTGAGiTAANNN-3(3)基因組DNA酶切為了便于靈活的調(diào)節(jié)擴(kuò)增片段的大小，一般采用兩種限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA。一種是切點(diǎn)少的內(nèi)切酶，如具有6堿基識別位點(diǎn)的EcoRI,它產(chǎn)生較大的DNA片段；一種是切點(diǎn)多的內(nèi)切酶，如具有4堿基識別位點(diǎn)的MseI,它產(chǎn)生較小的DNA片段。由EcoRI和MseI酶切產(chǎn)生三種基因組片斷，MseI-MseI片段，EcoRI-EcoRI片段，EcoRI-MseI,其中EcoRI-MseI為主要酶切產(chǎn)物。將200I離心管、模板DNA、MseI、EcoRI、10buffer、無菌去離子水置于冰上溶解。20L。輕輕混勻，離心去

10、除氣泡。組分DNA模板MseIEcoRI10XBufferMS100ng2U2U2人依次向無菌的200人離心管中加入各成份，加水至終體積為37C恒溫培養(yǎng)箱酶切2-4hr。(4)接頭的連接將MseI接頭、EcoRI接頭、T4-連接酶和無菌去離子水置于冰上溶解。依次向無菌的200山離心管中加入如下成份，加水至終體積為20山。輕輕混勻，離心去除氣泡。組分酶切液EcoRI接頭MseI接頭T4-連接酶MS10山50pmol50pmol6U37C恒溫連接16hr。(5) DNA樣品的預(yù)擴(kuò)增DNA樣品預(yù)擴(kuò)增是為了充分利用連接產(chǎn)物，同時(shí)獲得較多擴(kuò)增產(chǎn)物，為進(jìn)一步篩選擴(kuò)增引物提供保障。預(yù)擴(kuò)增引物在設(shè)計(jì)時(shí)選擇性堿

11、基通常為一個(gè)。 將MseI引物I、EcoRI引物I、10XPCR緩沖?夜、dNTP、DNA聚合酶和無菌去離子水置于冰上溶解。 依次向無菌的200人離心管中加入如下成份，加水至終體積為50山。輕輕混勻，離心去除氣泡。連接后樣品5人引物(各)10ngdNTP10nmolPCR緩沖液1XDNA聚合酶2.5U按照如下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。94C2-5min94C30sec56c60sec72c60sec72c7min4coo35循環(huán)瓊脂糖凝膠電泳檢測：取20I預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物和5L上樣緩沖液混合后在0.8%瓊脂糖凝膠中檢測預(yù)擴(kuò)增的效果，樣品用0.1XTE稀釋20倍，-20C保存。(6) DNA樣品的擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)增

12、產(chǎn)物需稀釋到一定倍數(shù)才能進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，否則會(huì)產(chǎn)生類似“smea的現(xiàn)象，具體的稀釋倍數(shù)視預(yù)擴(kuò)增結(jié)果而定。 將10XPCR緩沖?夜、MseI引物II、EcoRI引物II、dNTP、DNA聚合酶和無菌去離子水置于冰上溶解。 依次向無菌的200人離心管中加入如下成份，加水至終體積為20山。輕輕混勻，離心去除氣泡。稀釋的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物5山引物各25ngdNTP4nmolPCR緩沖液1XDNA聚合酶1U按照如下反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。94C2min94C65C72C30sec30sec60sec”12循環(huán)，退火溫度每循環(huán)降低0.7C94C30sec156C30sec卜23循環(huán)72C60sec變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。6 .注意事項(xiàng)(1)基因組DNA應(yīng)具有較好的純度。(2)內(nèi)切酶的選擇應(yīng)慎重。(3)要確定適宜的酶切時(shí)間，酶切時(shí)間太長浪費(fèi)時(shí)間，酶切時(shí)間太短則PCR產(chǎn)物大片段較多、帶型密集、不易分辨。必須保證基因組DNA酶切完全，否則會(huì)影響最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(4)制作聚丙烯酰胺凝膠時(shí)，膠平板應(yīng)格外清潔，否則殘留去污劑會(huì)導(dǎo)致銀染時(shí)產(chǎn)生褐色背