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文檔簡介
1、WB 實 驗 基 本 步 驟實驗基本步驟提取細胞蛋白BCA定量制備蛋白膠(SDS-PAGE交)蛋白樣品變性電泳轉(zhuǎn)膜圭封閉一抗TBST洗滌二抗TBST洗滌顯影結(jié)果分析試劑配制1. PBS磷酸鹽緩沖溶液1L磷酸二氫鉀0.24g磷酸氫二鈉1.44g氯化鈉8g氯化鉀0.2g加入500ml純水,調(diào)PH=7.2定容至1L,高壓蒸汽滅菌2. PBST ( PBS+0.05% 吐溫-20)500mlPBS+0.25ml 吐溫-203. 電轉(zhuǎn)液500mlTris 1.5g甘氨酸 7.2g400ml水溶解加入100ml甲醇,置于4 C冰箱預(yù)冷4. 電泳液(1X)10x稀釋,50ml10x電泳液+450ml純水5.
2、 TBS6. TBST (TBS+0.05% 吐溫-20)50mlTBS+450ml 純水 +0.25ml 吐溫-207. 封閉液TBST1X+5% 奶粉40ml封閉液=40mlTBST+2g 奶粉,40 C預(yù)熱WB實驗、蛋白樣品制備準備:一管細胞,PBS (4C預(yù)冷),PMSF (100mM),移液槍(1000ul, 10ul), 1.5mlEP 管2個,高速冷凍離心機4C預(yù)冷1. 于-20C冰箱中取出一管細胞樣品,吸去培養(yǎng)液2加入1ml 4C預(yù)冷的PBS (0.01M pH7.27.3)。用移液槍輕輕吹成懸浮液后 4C, 8000r離心5min,然后棄去上清。重復(fù)以上操作一次,共洗細胞兩次
3、以洗去培養(yǎng)液。3. 按1ml裂解液加10山PMSF (100 mM),搖勻置于冰上。(PMSF要搖勻至無結(jié)晶時才可 與裂解液混合。)4. 在樣品中加入300ul含PMSF的裂解液,吹勻,于冰上裂解 30 min,為使細胞充分裂解培養(yǎng) 瓶要經(jīng)常來回搖動。5. 裂解完后,于4°C下12000 rpm離心5 min。7.將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒 0.5 ml的離心管中放于20C保存。二、蛋白含量的測定(BCA定量)準備:96 孔板,移液槍(1000ul,10ul,200ul ),BCA 工作液(A+B ),50mlEP 管,1xPBS,BSA標準液1. 將96孔板分好區(qū)域,若不夠分則只做兩
4、個重復(fù),(外圍一圈的孔最好不用)2. 算好孔數(shù)(總的)每孔加 200ulBCA工作液(A+B ),( A液:B液=50:1, 一般配多些,如 60 孔,A 液 12000ul,B 液 240ul)3. 將樣品稀釋到一定倍數(shù)才能定量,(10倍,20倍,30倍),每孔需要20ul樣品(2ul樣品+18ulPBS,即稀釋10倍),做三個重復(fù)則需要 60ul, 般配80ul4. 配蛋白標準樣品,將2mg/ml的蛋白標準溶液稀釋至0.5mg/ml,若配200ul的0.5mg/ml蛋白 標準溶液則需要50ul的2mg/ml的蛋白標準溶液和150ul PBS溶液5. 將稀釋好的樣品加入孔板中(標記的區(qū)域),
5、接著標準品按0, 1,2,4,8,12,16,20ul加到標號的區(qū)域,之后在加標準樣品的孔內(nèi),將孔內(nèi)溶液用PBS補足到20ul6. 每孔加200ul配好的工作液,平行加,不能上下加,以減少誤差7. 將加好的96孔板放在37C下孵育30分鐘8. 孵育完后,放在酶標儀輕微震蕩3-10s,中速,吸光值595nm進行比色測定,記錄標準曲線及樣品 吸光值數(shù)據(jù)后,以蛋白含量(ml)為橫坐標,吸光值為縱坐標作標準曲線。(R2 >0.98才有用, 酶標儀操作:兩個箭頭圖標,1是結(jié)果,2是保存)9. 計算蛋白含量(注意定量樣品已經(jīng)稀釋了10倍)蛋白質(zhì)定量標準曲線加樣量骨口. 序號12345678標準蛋白量
6、/ul01248121620(0.5mg/ml )背景液(PBS /ul2019181612840標準液濃度mg/ml00.0250.050.10.20.30.40.5三、SDS- PAGE電泳1. 配膠(12%,可以提前配好)準備:玻璃板,梳子,AP (解凍,現(xiàn)拿現(xiàn)用),聚丙烯酰胺(4 C冰箱冷藏)(1)玻璃板驗漏5min(2) 按表配置分離膠(3) 灌膠,加酒精封壓,凝30min (注意不要有氣泡)(4) 按表配濃縮膠,倒掉酒精,用吸水紙吸去酒精,灌膠,插梳子(注意不要有氣泡),凝30mi n(5) 取膠,用水沖洗一下濃縮膠,加少量水放入一次性手套中4°C冰箱保存?zhèn)溆?. 樣品處
7、理準備:PBS,移液槍,1.5mlEP管(1) 稀釋樣品:一般每孔上樣5ul,即1mg/ml濃度的樣品,測完蛋白含量后,將樣品用PBS稀釋至1mg/ml (注意load in gbuffer的加入也得算入)(2) 取出上樣樣品15ul至1.5 ml離心管中,加入6XSDS上樣緩沖液3ul至終濃度為1XC(上樣總體積一般不超過15 d,加樣孔的最大限度可加20 pl樣品。)(3) 將樣品在100C煮5 min震蕩使蛋白完全變性(注意儀器操作)3. 電泳準備:電泳液500ml (現(xiàn)配),蛋白膠,10ul移液槍(槍頭),樣品,Marker,冰盒,電泳 裝置(1) 將SDS-PAGE膠放入電泳槽中,加
8、足夠的電泳液。(短玻璃板面向內(nèi),長玻璃板面向外。若只跑一塊膠,那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。電泳液至少要漫過內(nèi) 測的短玻璃板。注意先檢漏。)(2) 上樣。用移液槍貼壁吸取樣品,將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。(加樣太快可使樣品沖出加樣孔,若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時,進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌 3次,以免交叉污染。)(3) 先設(shè)置80V,開始電泳,樣品溴酚藍跑至分離膠后增至120V電壓,電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳,進行轉(zhuǎn)膜。(此時準備好電轉(zhuǎn)液)四、轉(zhuǎn)膜準備:電轉(zhuǎn)液(現(xiàn)配4C冰箱冷藏),鑷子,濾紙,PVDF膜(0.45um),電轉(zhuǎn)
9、裝置,冰盒 注意:拿濾紙和膜時一定要戴手套或用鑷子,因為手上的蛋白會污染膜。1. 在加有轉(zhuǎn)移液的盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊2. 濾紙浸入電轉(zhuǎn)液中,PVDF膜在甲醇中潤濕成半透明,小心將膜放入 4C電轉(zhuǎn)液中平衡至少 5min。3. 將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊,用玻棒來回搟幾遍以搟走里面的 氣泡。(一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。)在墊子上墊三層濾紙(可三張紙先 疊在一起在墊于墊子上),一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。4. 先將玻璃板撬掉才可剝膠,撬的時候動作要輕,要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒玻 璃板便開始松動,直到撬去玻板。(撬時一定要小心,玻板很
10、易裂。)除去小玻璃板后,將 濃縮膠輕輕刮去(濃縮膠影響操作),要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上(做好標記),用手調(diào)整使其與濾紙對齊,輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上,要蓋滿整 個膠(膜蓋下后不可再移動)并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊,搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉(zhuǎn)移液中進行,要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙 不能相互接觸,接觸后會發(fā)生短路。(轉(zhuǎn)移液含甲醇,操作時要戴手套,實驗室要開門以使 空氣流通。)5. 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中(電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱,漿槽放入冰中),要使夾的黑面對槽的黑面,夾 的白面對槽的紅面。一般用100mA轉(zhuǎn)移90min。6. 轉(zhuǎn)完后將膜用1
11、X麗春紅染液染5 min (于脫色搖床上搖)。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用。(準備封閉液)六、免疫反應(yīng)準備:封閉液,一抗,二抗,TBST1 .將膜移至含有封閉液的平皿中,室溫下脫色搖床上搖動封閉2h。2. TBST洗4次。每次5分鐘。3將膜按照目的蛋白所處位置剪切并做好標記,加入相對應(yīng)的一抗,室溫孵育2h或者4C過夜4. 室溫下孵育12 h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗四次,每次 5min5. 同上方法準備二抗稀釋液并與膜接觸,室溫下孵育12 h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗4次,每次5 min七、顯影準備:樣品膠片,移液槍(200ul),中槍頭,吸水紙,顯影液(A+B ),薄鑷子二抗一抗目的蛋白 78kd Bip 1:1000兔二抗75kd目的蛋白 34kd GAPDH內(nèi)參
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