SOD,CAT及POD活性的測(cè)定

1、SOD,CAT 及 POD 活性的測(cè)定分別取 0.4g 材料于預(yù)冷的研缽中，加入 8ml 預(yù)冷的 50mmol-1磷酸緩沖液（pH7.8）（先加 2ml,在冰浴下研磨成勻漿后，將勻漿轉(zhuǎn)入 10ml 離心管，再用 6ml 沖洗），10000rpm 離心 15min,取上清液定容至 10ml 后于 4c 保存。上清液用于可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD 活性及 POD 活性的測(cè)定。SO砒性測(cè)定1 .顯色反應(yīng)取 5mL 指形管（要求透明度好）4 支，2 支為測(cè)定管，另 2 支為對(duì)照管，按表 47-1加入各溶液。 混勻后， 給 1 支對(duì)照管照上比試管稍長(zhǎng)的雙層黑色硬紙?zhí)渍诠猓?與其他各管同時(shí)置于 4000lx

2、日光燈下反應(yīng) 20-30min（要求各管照光情況一致，反應(yīng)溫度控制在 2535c 之間，使酶活性高低適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)時(shí)間）。當(dāng)樣品數(shù)量較大時(shí)，可在臨用前根據(jù)用量將表 47-1 中各試劑（酶液和核黃素除外）按比例混合后一次加入 2.65mL,然后依次加入核黃素和酶液，使終濃度不變。表 47-1 各溶液顯色反應(yīng)用量試劑酶）用量（mL）終濃度（比色時(shí)）0.05mol/L 磷酸緩沖液1.5130mmol/LMet 溶液P0.313mmol/L750 仙 mol/LNBT 溶液0.375amol/L100mol/LEDTA-N 注液0.310mol/L20（imol/L 核黃素0.32.0mmol/L酶液0

3、.12 支對(duì)照管以緩沖液代替酶液蒸儲(chǔ)水0.5總體積3.33.SOD 活性測(cè)定至反應(yīng)結(jié)束后，用黑布罩蓋上試管，終止反應(yīng)。以遮光的對(duì)照管作為空白，分別在 560nm 下測(cè)定各管的OD值，tf算SO陰性。3.結(jié)果計(jì)算已知 SODM 生單位以抑制 NBT 光化還原的 50W 一個(gè)酶活性單位表示，按下式計(jì)算測(cè)定方法SOD活性。SO曲活性u(píng)/g（FW）二式中：SOD 總活性以酶單位每克鮮重表示。比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示。ACK照光對(duì)照管的吸光度。AE樣品管的吸光度。VT樣品液總體積，mLV1測(cè)定時(shí)樣品用量，mLW樣品鮮重，g蛋白質(zhì)含量單位為 mg/g。愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶（POD）活性i.取兩

4、支試管，洗滌后甩干水分試劑 J管號(hào)（對(duì)照）測(cè)定管0.05mol/LPH5.5 的磷酸緩沖液2.9ml2.9ml2%雙氧水溶液0ml1.0ml0.05mol/L 愈創(chuàng)木酚溶液1.0ml1.0ml蒸儲(chǔ)水3.0ml2.0ml總體積7.0ml7.0ml將上述各管立即放入預(yù)先調(diào)好 37c 的水浴鍋中保溫 5min 以上(酶促反應(yīng))，向?qū)φ展苤屑尤?0.1ml 酶液，混勻，在入 470nm 處調(diào)零，再向測(cè)定管中加入 0.1ml 酶液，并且立即計(jì)時(shí)，混勻后進(jìn)行比色測(cè)定，3 分鐘時(shí)立即讀取吸光度。(也可以每分鐘讀取一次，3 分鐘內(nèi)吸光度變化值 4A)2.結(jié)果計(jì)算以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以AA47

5、0/min-g(鮮重)表示之。也可以用每min內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)過氧化物酶活性單位(u)表示。按下式計(jì)算酶的相對(duì)活性AX酶提取液總量(ml)酶活性(A470-gtwmin1)=樣品鮮重(g)x 測(cè)定時(shí)酶液用量(ml)過氧化氫酶的活性測(cè)定紫外吸收法【原理】H2O2在 240nm 波長(zhǎng)下有強(qiáng)烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度(A240)隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測(cè)量吸光率的變化速度即可測(cè)出過氧化氫酶的活性?！緝x器與用具】紫外分光光度計(jì)；離心機(jī)；研缽；250ml 容量瓶 1 個(gè)；0.5ml 刻度吸管 2 支，2ml 刻度吸管 1 支；10ml 試管 3 支；恒溫水??；【試劑】0

6、.2mol/LpH7.8 磷酸緩沖液(內(nèi)含 1%聚乙烯口比咯烷酮)；0.1mol/LH2O2(用 0.1mol/L 高鎰酸鉀標(biāo)定)?！痉椒ā俊痉椒ā? .酶液提?。悍Q取新鮮小麥葉片或其它植物組織 0.5g 置研缽中，加入 23m14c 下預(yù)冷的 pH7.0 磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入 25ml 容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液，并定容到刻度?；旌暇鶆?qū)⒘科恐?5c 冰箱中靜置 10min,取上部澄清液在 4000rpm 下離心 15min,上清液即為過氧化氫酶粗提液。5c 下保存?zhèn)溆谩? .測(cè)定：取 10ml 試管 3 支，其中 2 支為樣品測(cè)定管，1 支為空白管，按

7、表 40-2 順序加入試劑。表 40-2 紫外吸收法測(cè)定 H2O2樣品液配置表管號(hào)S1S2S3粗酶液(ml)0.20.20.2pH7.8 磷酸(ml)1.51.51.5蒸儲(chǔ)水(ml)1.01.01.025c 預(yù)熱后逐管加入 0.3ml0.1mol/L 的 H2O2,每加完一管立即記時(shí)，并迅速倒入石英比色杯中，240nm 下測(cè)定吸光度，每隔 1min 讀數(shù) 1 次，共測(cè) 4min,待 3 支管全部測(cè)定完后,按下式計(jì)算酶活性。3 .結(jié)果計(jì)算：以 1min 內(nèi) A240減少 0.1 的酶量為 1 個(gè)酶活單位（u）。A240VT過氧化氫酶活性（u/gFW/min）=0.1VitFW（AS1AS2）式中 A240=AS02AS。一加入煮死酶液的對(duì)照管吸光值；ASI,AS2一樣品管吸光值；Vt 一粗酶提取液總體積