免疫細(xì)胞分離技術(shù)(終)

1、免疫細(xì)胞分離技術(shù)（針對淋巴細(xì)胞）41110111 向珍娟41110124 龔琦青41110131 周武免疫細(xì)胞分離技術(shù)的意義 我們知道進行有關(guān)細(xì)胞免疫方面的檢測，特別是有關(guān)免疫細(xì)胞功能的體外實驗，往往須將待檢淋巴細(xì)胞從血液或組織中分離出來，而外周血會有多種細(xì)胞成分，包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞和血咆群體。但有些細(xì)胞如淋巴細(xì)胞的物理特性及生化特性與其他細(xì)胞差異甚微，用簡單的方法不容易分純，因此產(chǎn)生了專門的細(xì)胞分離純化技術(shù)。 白細(xì)胞分離白細(xì)胞分離 吞噬細(xì)胞的分離和收集吞噬細(xì)胞的分離和收集 淋巴細(xì)胞分離淋巴細(xì)胞分離白細(xì)胞的分離 自然沉降法 聚合物加速沉降法自然沉降法采集血液試管直立靜置室溫

2、（3060min）抗凝（如加肝素）血漿層白細(xì)胞層紅細(xì)胞層吸管吸取白細(xì)胞層置新試管中離心棄上清并洗滌加蒸餾水低滲處理（裂解紅細(xì)胞）反復(fù)洗滌得純度較高的白細(xì)胞懸液聚合物加速沉降法 本法是利用高分子量的聚合物如明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（PVP）等使紅細(xì)胞凝集成串，加速紅細(xì)胞沉降，使之與白細(xì)胞分離。 優(yōu)點：本法的細(xì)胞獲得率比自然沉降法高。吞噬細(xì)胞的分離和收集吞噬細(xì)胞的分離和收集 方法方法：斑蝥敷貼法 操作操作：用濾紙蘸取10中藥斑蝥酒精浸出液，貼敷在臂內(nèi)側(cè)皮膚表面，45h后皮膚局部充血，48h后局部形成水皰，吸取皰中的組織液，內(nèi)含巨噬細(xì)胞； 優(yōu)點優(yōu)點：可從人體組織液中獲取較純的巨噬細(xì)胞，不需作進

3、一步體外分離，細(xì)胞量損失較少； 缺點缺點：此法對病人皮膚有一定損傷，有時可引起局部感染，應(yīng)慎用。2022-3-8淋巴細(xì)胞分離三步走 （一）外周血單個核細(xì)胞的分離 （二）純淋巴細(xì)胞群的采集 （三）淋巴細(xì)胞亞群的分離（一）外周血單個核細(xì)胞的分離 外周血中單個核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細(xì)胞不同，紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞密度較大，為1.090左右，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞密度為1.0751.090，血小板為1.0301.035。為此利用一種密度介于1.0751.092之間而近于等滲的溶液（分層液）做密度梯度離心，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。Ficol

4、l 分層液法外周血單個核細(xì)胞的分離Ficoll 分層液法 Percoll 分層液法分層液 基本要求 對細(xì)胞無毒 基本等滲 不同于血漿等分離物質(zhì) 有一定的比重 最佳選擇（目前） Ficoll（聚蔗糖-泛影葡胺溶液）： 2份6聚蔗糖蒸餾水溶液+1份34%泛影葡胺生理鹽水溶液組成，其比重為1.0770.002. 分離過程 （1）分層液置試管底層 （2）肝素抗凝全血以Hanks 液或PBS 液作適當(dāng)稀釋后，輕輕疊加在分層液上面，使兩者形成一個清晰的界面 （3）水平式離心 （4）不同層次的液體和細(xì)胞帶 （5）吸取單個核細(xì)胞層Ficoll 分層液法 分離成品：淋巴細(xì)胞 單核細(xì)胞 分離純度：95%左右，其中

5、淋巴細(xì)胞約占90%95% Percoll 分層液法 Percoll分離液法是一種連續(xù)密度梯度離心分離法。 Percoll 是一種經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)處理的硅膠顆粒，對細(xì)胞無毒性。Percoll 液經(jīng)高速離心后可形成一個連續(xù)的密度梯度，不同密度的細(xì)胞將懸浮于各自不同的密度區(qū)帶，從而將密度不等的細(xì)胞分離純化。分離過程 （1）用Percoll原液(密度1135)與約等量的磷酸緩沖液均勻混合 （2）高速離心后，形成一個從管底到液面密度逐漸遞減的連續(xù)密度梯度 （3）將已制備的單個核細(xì)胞懸液輕輕疊加在液面上 （4）低速離心后，得四個細(xì)胞層。表層為死細(xì)胞殘片和 血小板，底層為粒細(xì)胞和紅細(xì)胞，中間有兩層

6、，上層富含單核細(xì)胞(78)，下層富含淋巴細(xì)胞(98）。Percoll分層液法 優(yōu)點：純化單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞； 缺點：操作流程較長，手續(xù)較多。連續(xù)密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞中各細(xì)胞成分的分布示意圖（二）純純淋巴細(xì)胞的分離淋巴細(xì)胞的分離 根據(jù)密度離心分離法獲得的淋巴細(xì)胞主要混合在單個核細(xì)胞懸液中，由于淋巴細(xì)胞在數(shù)量上占單個核細(xì)胞的大多數(shù)，因此，單個核細(xì)胞有時也可以大致地代表淋巴細(xì)胞直接用于某些實驗，但嚴(yán)格地講，采用上述方法獲得的單個核細(xì)胞需去除單核細(xì)胞才能較為準(zhǔn)確地代表淋巴細(xì)胞用于實驗。純淋巴細(xì)胞群的采集 實驗原理：利用單核細(xì)胞在37和Ca2+存在條件下，能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維

7、或葡聚糖凝膠的特性； 實驗方法：粘附貼壁法 吸附柱過濾法 磁鐵吸引法2022-3-8粘附貼壁法 將已制備的單個核細(xì)胞懸液傾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37溫箱靜置1h左右，單核細(xì)胞和粒細(xì)胞均貼于平皿壁上，而未貼壁的非粘附細(xì)胞幾乎為純淋巴細(xì)胞，繼用橡皮刮下貼壁的細(xì)胞即為純單核細(xì)胞群。 缺點：因B細(xì)胞也有貼壁現(xiàn)象，用本法分離的淋巴細(xì)胞群中B細(xì)胞有所損失。2022-3-8吸附柱過濾法 將單個核細(xì)胞懸液注入裝有玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG10的柱層中，凡有粘附能力的細(xì)胞絕大部分被吸附而粘滯在柱層中，從柱上洗脫下來的細(xì)胞主要是淋巴細(xì)胞； 優(yōu)點：此法簡單易行，對細(xì)胞極少損害。2022-3-

8、8磁鐵吸引發(fā)法 原理：利用單核細(xì)胞具有吞噬的特性； 操作：在單個核細(xì)胞懸液中加直徑為3m的羰基鐵顆粒，置37溫箱內(nèi)短時旋轉(zhuǎn)搖動，待單核細(xì)胞充分吞噬羰基鐵顆粒后，用磁鐵將細(xì)胞吸至管底，上層液中含較純的淋巴細(xì)胞。2022-3-8（三）淋巴細(xì)胞亞群的分離 原則原則：根據(jù)相應(yīng)細(xì)胞的特性和不同的標(biāo)志加以選擇性純化； 陽性選擇法陽性選擇法：凡根據(jù)細(xì)胞的特性和標(biāo)志選擇純化所需細(xì)胞的方法； 陰性選擇法陰性選擇法：選擇性去除不要的細(xì)胞，僅留下所需的細(xì)胞的方法；2022-3-8淋巴細(xì)胞亞群的分離 通過以上兩步的實驗分離操作，我們得到純度比較高的淋巴細(xì)胞混合液。然而在具體的實驗操作中，我們還需要將淋巴細(xì)胞進一步的進

9、行分離。 原則原則：根據(jù)相應(yīng)細(xì)胞的特性和不同的標(biāo)志加以選擇性純化； 陽性選擇法陽性選擇法：凡根據(jù)細(xì)胞的特性和標(biāo)志選擇純化所需細(xì)胞的方法； 陰性選擇法陰性選擇法：選擇性去除不要的細(xì)胞，僅留下所需的細(xì)胞的方法；分離方法1. E花環(huán)沉降法2. 尼龍毛分離法3. 免疫吸附分離法4. 免疫磁性微珠分離法5. 流式細(xì)胞儀分離法E花環(huán)沉降法 基本原理：T 細(xì)胞有羊紅細(xì)胞受體(E受體)，可以與羊紅細(xì)胞結(jié)合形成較大的E 花環(huán)的特性，可將T 細(xì)胞和B 細(xì)胞分離。分離過程 （1）將淋巴細(xì)胞與一定比例的綿羊紅細(xì)胞混合 （2）淋巴細(xì)胞形成E 花環(huán) （3）用淋巴細(xì)胞分層液分離 （4）浮懸在分層界面的細(xì)胞群則富含B 細(xì)胞，

10、而T 細(xì)胞由于與羊紅細(xì)胞結(jié)合形成E 花環(huán)后比重較大，則沉降在管底 相關(guān)拓展：用神經(jīng)氨酸酶預(yù)處理羊紅細(xì)胞將有利于花環(huán)的形成和增加穩(wěn)定性。另外將沉降在管底與羊紅細(xì)胞結(jié)合的T 細(xì)胞經(jīng)低滲法處理可使圍繞細(xì)胞周圍的綿羊紅細(xì)胞快速裂解，又可得到E 受體陽性的T細(xì)胞群。尼龍毛分離法 原理：本法利用B細(xì)胞和單核細(xì)胞具有易粘附于尼龍纖維表面的特性，可將T和B細(xì)胞分開。 操作方法：取松散而經(jīng)過處理的尼龍毛（聚酰胺纖維），均勻充填在內(nèi)徑56nm的聚乙烯塑料管（飲料管即可）內(nèi)，經(jīng)Hanks液浸透保溫，將單個核細(xì)胞懸液加入柱內(nèi)，放37溫箱靜置12h。用預(yù)溫的含1020小牛血清培養(yǎng)液灌洗，洗脫液內(nèi)含有非粘附的T細(xì)胞，重復(fù)

11、灌洗幾次以除去管內(nèi)殘留的T細(xì)胞。再用冷或溫培養(yǎng)液邊沖邊洗邊擠壓塑料管，此時洗脫液內(nèi)富含B細(xì)胞。 優(yōu)點：如此得到的T細(xì)胞純度在90以上，B細(xì)胞純度可達80。2022-3-8免疫吸附分離法-親和板結(jié)合分離法 原理：各種淋巴細(xì)胞亞群具有不同的抗原性，將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上，繼加細(xì)胞懸液，凡抗原陽性的細(xì)胞則與相應(yīng)抗體結(jié)合，抗原陰性的細(xì)胞可從未吸附的細(xì)胞懸液中獲??；2022-3-8親和板結(jié)合分離法 同樣若用特異性抗原交聯(lián)在塑料板上，則可分離得具有特異抗原受體的淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞受體與特異抗原或抗體接觸，可引起細(xì)胞激活，因此，凡欲去除細(xì)胞懸液內(nèi)某一細(xì)胞亞群時，本法更適用。 如要分離CD4+或CD8+細(xì)

12、胞，則可用抗CD4或CD8單克隆抗體吸附。用抗Ig抗體則可分離B細(xì)胞。同樣，用活化的C3包被，可分離出有C3受體的細(xì)胞。2022-3-8親和板結(jié)合分離法（陽性選擇法） （1）將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上 （2）加細(xì)胞懸液 （3）各種淋巴細(xì)胞亞群具有不同抗原性的特點和表面標(biāo)志，抗原陽性的細(xì)胞與相應(yīng)的固相抗體結(jié)合，吸附在平板上 （3）多次細(xì)胞洗滌后我們將得到吸附在平板上的抗原陽性細(xì)胞 （4）同理若用特異性抗原交聯(lián)于塑料板上，則可分離得到具有特異抗原受體的淋巴細(xì)胞。但淋巴細(xì)胞受體與特異抗原或抗體連接后有可能引起細(xì)胞激活，因此，凡欲去除細(xì)胞懸液內(nèi)某一細(xì)胞亞群時，即將其用于陰性選擇，本法更合適。2022-

13、3-8免疫磁珠法分離細(xì)胞原理： 免疫磁珠法分離細(xì)胞是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細(xì)胞得以分離。 免疫磁珠法分為陽性分離法和陰性分離法： 陽性分離法磁珠結(jié)合的細(xì)胞就是所要分離獲得的細(xì)胞 陰性分離法磁珠結(jié)合不需要的細(xì)胞，游離于磁場的細(xì)胞為所需細(xì)胞。熒光激活細(xì)胞分離儀(FACS)分離法 主要原理主要原理是細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動系統(tǒng)，細(xì)胞排成單行，逐個流經(jīng)檢測區(qū)進行測定。當(dāng)細(xì)胞從流動室噴嘴處流出時，超聲振蕩攪動液流，使液流斷裂成一連串的均勻小滴（40000個/s），每小滴內(nèi)最多含一個細(xì)胞（其中只有百分之幾的液滴中含細(xì)胞），細(xì)胞經(jīng)激光束照射產(chǎn)生熒光和散射光，由光電倍增管接收，轉(zhuǎn)換成脈沖信號，數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理，分辨細(xì)胞